Name: אוטומטית פרוטוקולים עבור התגבשות Macromolecular במעבדה MRC של הביולוגיה המולקולרית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: למד פרוטוקולים אוטומטיים להכנת גבישים איכותיים של מולקולות מקרומולקולריות באמצעות מערכות LMB. שיטה זו מאפשרת עד 1,920 ניסויים בננוליטר לחקר מבנים של חלבונים, DNA ו-RNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המתקן התגבשות MRC-LMB הוא באדיבות נתמך על ידי המועצה למחקר רפואי (בריטניה). אנו מודים חברי LMB על תמיכתם: אולגה Perisic (PNAC), טוני וורן, Fusinita ואן דן Ent ו פט אדוארדס (לימודי המבנית), סטיב Scotcher, שאר חברי הסדנה מכני, ניל גרנט, ג'ו וסטמורלנד (עזרים חזותיים), פול הארט, טום פראט (IT). אנחנו גם רוצה להודות סטיב אליוט (Tecan, בריטניה), סטיוארט מיטשל, הת'ר Ringrose (רובוטיקה המילטון, בריטניה), פול הפשרה, רוברט לואיס של Joby ג'נקינס (טרומבוציטופניה Labtech, בריטניה), פול רירדן (Swissci AG, שוויץ), סטיבנס. ג'ורג ', דונלד Ogg (Alphabiotech, בריטניה), ניל ויליאמס (Markem Imaje, בריטניה) ו גרהם האריס (סוכנות קליבלנד) לקבלת עזרה טכנית.

1. שני אוטומטי לחלוטין מערכות (מיון ראשוני)
<ol><li>
מערכת 1: הכנת לוחות 96-ובכן התגבשות 72 מלא עם הקרנת ערכות (LMB צלחות)
	<ol>
<li>לפני ביצוע ההליך, ודא הרובוטים של המערכת יאותחלו תוכנת השליטה שלהם פתוחה. הפעל את chiller של קירור-צינור המוביל בערך 30 דקות לפני התוכנית הראשית יופעל.</li>
		<li>מניחים צלחת מבחן על המוביל SBS ממונע של חותם צלחת. חותם צלחת ולרוץ לבדוק כי הסרט הוא מיושם כהלכה. לחזור על בדיקה זו עוד פעמיים כדי לוודא חותם צלחת מוכנה.</li>
		<li>לאחר מכן, להוסיף 20 לליטר מים יונים המכל הראשי של המטפל נוזלי. נתק את הכיסויים צימוד של המכולה קטן (20% אתנול שטיפה פתרון) וחבר את המכסים המכל הראשי.</li>
		<li>הזן את שם המסך המתאים (טבלה 1) על המגע מדפסת הזרקת דיו. לאחר מכן, לפתוח ולסגור את הדלת קרוסלה להזניק את הסיבוב בקרוסלה. פתח את הדלת כאשר הערימה הראשון מציג את עצמו.</li>
		<li>מלא לטעון הערימה הראשון עם 22 לוחיות התגבשות, כל אחד עם עמודה 1 מול החוצה. מלא לטעון את הערימות שני הבא באותו אופן.</li>
		<li>לטעון את הצלחות 6 הנותרים בעמדות הגבוהות של הערימה הרביעית. סגרי את הדלת קרוסלה.</li>
		<li>ודא כי התצוגה chiller מציין 14 ° C. בעדינות, שוב ושוב היפוך ערכות ההקרנה שנבחר במשך דקה אחת. לאחר מכן, לפתוח את הפאנל הקדמי של המטפל נוזלי.</li>
		<li>פתח הצינורות ומניחים שבתא הקירור לפי התוכנית 96-ובכן תקן (A1, A2, וכו '.). בעת הצבת כל שפופרת במנשא, במקום המכסה על מגש בפריסה 96-ובכן אותו.</li>
		<li>להצליב הצינור עמדות ולוודא לכל הצינורות ברמה התיישבו במנשא. לאחר מכן, סגור את הפאנל הקדמי.</li>
		<li>בחלון 'אתחול' של התוכנה המפעילה נוזלי, בחר "בניהול אחזקה", פתח את התוכנית שטיפה. הפעל את התוכנית ריקון האתנול 20% מן המערכת, כדי לשטוף את דן טיפים לחילוק נוזלי.</li>
		<li>לאחר שטיפה הושלם, לחץ על 'ביטול' כדי לחזור 'אתחול'. בחר 'הפעל תהליך הקיים' ולחץ על "התחל את הבחירה שלך". פתח את התוכנית 'dispensing ערכת MRC'. מלא "18" עבור "מופעים" בתצורת מסך ולהפעיל את התוכנית.</li>
		<li>צג המערכת כפי קודם ארבעת הלוחות מסומנות, מלא, והוא חתום.</li>
		<li>לאחר כל הצלחות 72 היה מוכן להציב בחזרה הקרוסלה, להחליף את הכיסויים צימוד מהגורם הראשי אל המיכל קטן. הפעל את התוכנית 'הפעלת רצף' (ראה שלב 1.1.10).</li>
		<li>כבה את chiller ולמחוק את רוקן הקרנת ערכת צינורות. הסר בזהירות את הצלחות מוכן 72 מ הקרוסלה. ביטול מלא באופן שגוי או צלחות גרוע אטום. חנות את הלוחיות מוכן לשימוש ב- 10 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
מערכת 2: הגדרת טיפות התגבשות (חלבון nL 100 + 100 מצב nL) מתוך מדגם יחיד ב- 20 LMB צלחות
	<ol>
<li>ראשית, ודא הרובוטים של המערכת הם על, מנפק nanoliter מאותחל עם התוכנה שלה פתוח, המנהל בשיטה של המטפל נוזלי פתוח. הפעל המוביל צינון microtube בערך 15 דקות לפני התוכנית הראשית יופעל.</li>
		<li>מניחים צלחת מבחן על המוביל SBS ממונע של חותם צלחת. הפעל חותם צלחת וודא כי הצלחת אטום כראוי. מבחן חותם צלחת שלוש פעמים.</li>
		<li>לאחר מכן, להפעיל מנפק nanoliter להגדיר 100-nL טיפות של פתרון מבחן צלחת הבדיקה. בדוק במיקרוסקופ טיפות מוגדרות בצורה נכונה. לסגור את התוכנה מנפק nanoliter ולהסיר את הבלוק רצועת-מחזיק מן הסיפון.</li>
		<li>הכנס הבא, המחזיק צלחת אישית מעוצבת (לראות תוצאות נציג: התגבשות התקנים שפותחה LMB) לצלחת LMB עם הכמות היחסית הגבוהה של ריאגנטים נדיף בתנאים שלה (טבלה 1). הסר את הסרט דבק הצלחת.</li>
		<li>לפתוח את הפאנל הקדמי של המטפל נוזלי ומניחים את הצלחת יפתחו במרפסת, מאחורי המוביל הראשון הזזה (הזזה נושאות עשוי להיות שלף, כדי להקל על גישה).</li>
		<li>מכסים את הצלחת עם מכסה אלומיניום SBS. ליישב את המכסה לעבר הפינה השמאלית האחורית של המוביל על ידי הפעלת לחץ עדין לכיוון הפינה הנגדית של המכסה.</li>
		<li>. פתחי, לטעון לתוך נושאות הזזה, לכסות את הלוחות 19 הנותרים באותה דרך, עובד ביותר לתנאים לפחות תנודתי. לאחר המוביל קירור-microtube-4 ° C, כמצוין על-ידי אור ירוק, הסר את העטיפה שלו.</li>
		<li>חתוך את המכסה של microtube המכיל µL 440 (לפחות) של חלבון לדוגמה (טבלה 2). לוודא הדגימה יש ללא קצף מעל מניסקוס, כמו זה יפריע מערכת זיהוי נוזלי. מקם את הצינור בעמדה 1 של חברת קירור-microtube.</li>
		<li>מניחים צלחת PCR על סיפון נוזלי המטפל מול המוביל מתאם צלחת-המעבר. לאחר מכן, סגור את הפאנל הקדמי.</li>
		<li>לאחר טעינת הסיפון, ודא סיפון מתקן nanoliter ברור של גוש רצועת-מחזיק נושאות בירכתי המחסן עצה 50-µL ברורות של הכיסוי SBS אלומיניום.</li>
		<li>הממשק 'שיטת ניהול' המטפל נוזלי, בחר 'הגדר לוחות'. לעקוב אחרי האתחול של שתי מערכות ומלא את הפרמטרים לרוץ. בצע את ההנחיות של ממשק ניהול שיטה (ההנחיות, דמויות, מערכת ניהול המידע לעזור עם הכנה).</li>
		<li>בדוק היטב כי כל הנדרש רכיבים מוכנים ולאחר מכן התחל את התהליך.</li>
		<li>צג המערכת מנפק nanoliter שוקעת הטיפות בצלחת הראשונה, חותם צלחת לאחר מכן חותמות את הצלחת.</li>
		<li>לאחר כל 20 לוחות שהוכנו עם התגבשות טיפות, חזר באופן אוטומטי נושאות הזזה, לפתוח את הפאנל הקדמי ולהסיר בעדינות את הצלחות. בדוק כי הלוחות נסגרות כראוי לפני אחסונם על התגבשות.</li>
		<li>לנקות את המכסים SBS עם פתרון 20% אתנול לפני ערימות מהם, בצד שמאל של המטפל נוזלי לאחסון. למחוק את הצלחת ה-PCR ואת microtube.</li>
		<li>כבה המוביל צינון microtube ואת לנגב את הדחיסה. להשאיר מגבת נייר על גבי המשטח קריר יותר לספוג עוד יותר עיבוי. לאחר מכן, התקן מחדש את מכסה המוביל וסגור הפאנל הקדמי.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. אופטימיזציה של התנאים
<ol><li>
מבוסס על המזרק המטפל נוזלי: מפיק שני מעברי צבע ליניאריים של ריכוזים לתוך המאגרים של צלחת התגבשות (שיטת 4-פינה).
	<ol>
<li>ראשית, ודא המטפל נוזלי על מוטענים עם התוכנה שלה פתוח.</li>
		<li>בכרטיסיה 'מעבר צבע': לפתוח את התוכנית הנדרשת, בחר את סוג הצלחת התגבשות ונפח הסופי המאגרים (טבלה 3). הגדרת מתקדמות עבור 'vol שוט מקס' צריך תפחת מ- 6000 ל-3,000 בעת שימוש בפתרונות המכיל [אלכוהול איזופרופיל] > 10% v/v ו- [MPD] > 20% v / v
</li>
		<li>להכין את? המזרקים. הכנס בוכנה כל מזרק (קצוות מחודדים למטה) ולהוסיפה האחורי של מזרקים החריצים המיועד מתחת לראש רובוט. טוויסט מזרק עם כיוון השעון כדי לנעול אותו בעמדה (התוכנית תתחיל רק עם? כל המזרקים נדרש מחובר כראוי).</li>
		<li>הכינו את שקתות. הסר את מסגרת מפלדת והכנס את שקתות. העמדות 4 משמאל תואמות 4 הפינות A, B, C, מתג ד לכרטיסייה 'הגדר' אשר מציגה את נפחי הפתרונות הנדרשים כל מזרק (על טבלה 3, 0.5 מ"ל נפח מת נוספו אמצעי האחסון מוצג). שופכים את הפתרונות פינה לתוך שקתות בהתאמה שלהם, להציב את המסגרת בחזרה על הסיפון (המסגרת מחזיקה בעמדה עם 2 מגנטים קטנים הממוקמים בחלקו הקדמי של הסיפון). דרך חלופית להמשיך עם שלב זה היא לשפוך את הפתרונות לתוך שקתות כאשר הם ממוקמים כבר על הסיפון.
</li>
		<li>מניחים את הצלחת התגבשות על המוביל SBS ממונע.</li>
		<li>לחץ על 'תשאף' ולחכות בשלב זה יושלם (כאשר בוכנות עצר בדרך למעלה).</li>
		<li>מעבר לכרטיסיה 'לרוץ' ולהפעיל את התוכנית.</li>
		<li>בגמר של התוכנית, לחזור אל הכרטיסיה הגדרה, לחץ על 'הסר': המערכת ניקוי המזרקים את מפתרונות שאריות, ואז מרים את הפיסטונס עד הסוף. 'לטהר' עשויים להתבקש במקום 'הסר'; זה ישאיר את בוכנות במיקום התחתון, מוכן לרוקן פתרונות יותר עם מזרקים אותו.
</li>
		<li>הסר תארגן את הדברים על ידי ומסובב אותם התרחקותו.</li>
		<li>להיפטר מזרקים של שקתות בסל המתאים (או לשטוף אותם עם מים יונים, ולאחר מכן 20% v/v אתנול פתרון לשימוש חוזר).</li>
		<li>לאטום את הצלחת ומניחים אותו על מיקסר microplate במשך 3 דקות במהירות של 1000 סל ד, או 10 דקות כאשר פתרונות בעלי צמיגות גבוהה מעורבבים. הבסיס מוכן להגדרת התגבשות טיפות על מנפק nanoliter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
תוסף הקרנת פרוטוקול 1 (הגדרת התגבשות טיפות לתוך צלחת 96-ובכן התגבשות מראש מלא מסך כתוסף)
	<ol>
<li>ראשית, להכין את המצב עם ריכוזים הראשונית של ריאגנטים גדלה בכ-10% (מינימום כרך 15 מ"ל בעת העברת התנאי של מיכל על-גבי המסך מוספים עם המטפל נוזלי).</li>
		<li>ודא כי המטפל נוזלי מוכן לנתח. פתח את התוכנית 'הוסף למסך תוספים' על לוח אחד (להכניס נפח מאגרים: '72 µL'). מנחה, דמויות ועזרה עצה-ניהול מערכת (12 x 1,000 µL טיפים נדרש) עם מוודא הרובוט הוא מוכן לפעול על-פי הבחירות.
</li>
		<li>להחזיר את המסך מוספים מן החממה-20 ° C, להסיר את החותם אלומיניום מיד (שימוש בעל צלחת) ולאחר מכן מקם את הצלחת על סיפונה של המטפל נוזלי. התוכנית פועלת לפי פריסה דיוקן (הצלחת ממוקם מעבר לפינה-A1 ממוקם בפינה הקדמית השמאלית של המוביל). גם להציב את המיכל מלא עם המצב. הפעל את התוכנית.</li>
		<li>פעם היו מלאים המאגרים של הצלחת, מניחים אותה על גבי ניעור microplate ולהפעיל את התוכנית. יש לשטוף את הגורם המכיל של תנאי עם יונים מים ו-20% אתנול לשימוש חוזר.</li>
		<li>
להגדיר את טיפות על מנפק nanoliter. ראשית, פתחי את הצלחת התגבשות (שימוש בעל צלחת). אז, את הצלחת ואת החלבון 8-ובכן להתפשט במקום הראשון של בלוק רצועת-מחזיק את המקום. הכרטיסיה 'הגדרה' על תוכנת השליטה מציגה את העמדות בפועל של כל רכיב על הסיפון. לטעון כל טוב של רצועת עם חלבון דגימת לפי גודל טיפה הנדרש (טבלה 4). להפעיל את התוכנית להכין טיפות.
</li>
		<li>בגמר של התוכנית, הסר את הלוחית של הסיפון, לאטום אותו מיד (להשתמש סילר לאיטום צלחת, דבק רחב 3 אינץ). למחוק את רצועת לפח המתאים.</li>
		<li>להעריך את הגודל, צורה, ולמרכוז של טיפות מתחת למיקרוסקופ לפני האחסון.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
תוסף הקרנת פרוטוקול 2 (הגדרת התגבשות טיפות לתוך צלחת 96-ובכן התגבשות עם מסך מוספים מחדש שמיש)
	<ol>
<li>תחילה, הכן את המסך מוספים: להשאיר את הצלחת תרבות המתאים תא 96-ובכן קפואים להפשיר בטמפרטורת החדר במשך 40 דקות. לאחר מכן, centrifuge את המסך מוספים ב 1,000 x g למשך 2 דקות.</li>
		<li>להכין את התנאי (מינימלית כרך 15 מ"ל בעת העברת התנאי של מיכל על-גבי המסך מוספים עם המטפל נוזלי).</li>
		<li>למלא את המאגרים של צלחת 96-ובכן התגבשות עם התנאי. על המטפל-הנוזל, המשך באותו אופן כמו פרוטוקול 1, צעד 2.2.2, אך הזן '80 µL' עבור אמצעי האחסון במאגרים.</li>
		<li>להגדיר את טיפות על מנפק nanoliter עם 3 רכיבים על הסיפון (לוח המכיל את המסך מוספים, יחד עם לוח התגבשות ורצועת 8-ובכן חלבון במקום הראשון של בלוק רצועת-מחזיק, בטבלה 4).</li>
		<li>לאטום את הצלחת התרבות התא המכיל את המסך עם גיליון אלומיניום ומניחים אותו בחזרה בחממה-20 ° C.</li>
		<li>להעריך את הגודל, צורה, ולמרכוז של טיפות מתחת למיקרוסקופ לפני האחסון.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRupp%2C+B+%22Biomolecular+Crystallography%3A+Principles%2C+Practice+and+Application+to+Structural+Biology%22">Biomolecular Crystallography: Principles, Practice and Application to Structural Biology</a>. , Garland Science. (2010).</li>
<li>McPherson, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15325645">Introduction to protein crystallization.</a> Methods. 34, 254-265 (2004).</li>
<li>Bergfors, T. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBergfors%2C+TM+%22Protein+crystallization%3A+techniques%2C+strategies%2C+and+tips%3A+a+laboratory+manual%22">Protein crystallization: techniques, strategies, and tips: a laboratory manual</a>. , International University Line. La Jolla, Calif. (1999).</li>
<li>Dessau, M. A., Modis, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Crystallization+for+X-ray+Crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Protein Crystallization for X-ray Crystallography.</a> J. Vis. Exp. (47), e2285(2011).</li>
<li>Crick, F. H. C. <a target="_blank" href="https://profiles.nlm.nih.gov/ps/access/SCBBZV.pdf">X-Ray Diffraction of Protein Crystals.</a> Methods Enzymol. 4, 127-146 (1957).</li>
<li>Jaskolski, M., Dauter, Z., Wlodawer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+history+of+macromolecular+crystallography%2C+illustrated+by+a+family+tree+and+its+Nobel+fruits%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">A brief history of macromolecular crystallography, illustrated by a family tree and its Nobel fruits.</a> FEBS J. 281, 3995-4009 (2014).</li>
<li>Chruszcz, M., Wlodawer, A., Minor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Protein+Structures-A+Series+of+Fortunate+Events%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Determination of Protein Structures-A Series of Fortunate Events.</a> Biophys. J. 95, 1-9 (2008).</li>
<li>Manjasetty, B. A., Büssow, K., Panjikar, S., Turnbull, A. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3376864/">Current methods in structural proteomics and its applications in biological sciences.</a> 3 Biotech. 2, 89-113 (2012).</li>
<li>Carter, C. W., Carter, C. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/500706">Protein crystallization using incomplete factorial experiments.</a> J. Biol. Chem. 254, 12219-12223 (1979).</li>
<li>Jancarik, J., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?S0021889891004430">Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins.</a> J. Appl. Cryst. 23, 409-411 (1991).</li>
<li>Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959440X00001317">High-throughput protein crystallization.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 10, 558-563 (2000).</li>
<li>Berry, I. M., Dym, O., Esnouf, R. M., Harlos, K., Meged, R., Perrakis, A., Sussman, J. L., Walter, T. S., Wilson, J., Messerschmidt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPINE+high-throughput+crystallization%2C+crystal+imaging+and+recognition+techniques%3A+current+state%2C+performance+analysis%2C+new+technologies+and+future+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">SPINE high-throughput crystallization, crystal imaging and recognition techniques: current state, performance analysis, new technologies and future aspects.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1137-1149 (2006).</li>
<li>Luft, J. R., Collins, R. J., Fehrman, N. A., Lauricella, A. M., Veatch, C. K., DeTitta, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+deliberate+approach+to+screening+for+initial+crystallization+conditions+of+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">A deliberate approach to screening for initial crystallization conditions of biological macromolecules.</a> J. Struct. Biol. 142, 170-179 (2003).</li>
<li>Moraes, I., Evans, G., Sanchez-Weatherby, J., Newstead, S., Stewart, P. D. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23860256">Membrane protein structure determination-the next generation.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1838, 78-87 (2014).</li>
<li>Stock, D., Perisic, O., Löwe, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15652247">Robotic nanoliter protein crystallisation at the MRC Laboratory of Molecular Biology.</a> Prog. Biophys. Mol. Biol. 88, 311-327 (2005).</li>
<li>Gorrec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+current+approach+to+initial+crystallization+screening+of+proteins+is+under-sampled%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Cryst%22%5BJournal%5D)">The current approach to initial crystallization screening of proteins is under-sampled.</a> J. Appl. Cryst. 46, 795-797 (2013).</li>
<li>Hennessy, D. N., Narayanan, B., Rosenberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+implementation+of+precise+grid+screens%3A+the+four-corners+method%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Automatic implementation of precise grid screens: the four-corners method.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65, 1001-1003 (2009).</li>
<li>Cudney, R., Patel, S., Weisgraber, K., Newhouse, Y., McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+optimization+strategies+for+macromolecular+crystal+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Screening and optimization strategies for macromolecular crystal growth.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 414-423 (1994).</li>
<li>DiLorenzo, M. E., Timoney, C. F., Felder, R. A. <a target="_blank" href="http://journals.sagepub.com/doi/full/10.1016/S1535-5535-04-00123-6">Technological Advancements in Liquid Handling Robotics.</a> JALA. 6, 36-40 (2001).</li>
<li>Jenkins, J., Cook, M. <a target="_blank" href="http://journals.sagepub.com/doi/abs/10.1016/j.jala.2004.04.020">Mosquito: An Accurate Nanoliter Dispensing Technology.</a> JALA. 9, 257-261 (2004).</li>
<li>Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+Robot+for+High-throughput+Crystallization+of+Membrane+Proteins+in+Lipidic+Mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases.</a> J. Vis. Exp. (67), e4000(2012).</li>
<li>Till, M., Robson, A., Byrne, M. J., Nair, A. V., Kolek, S. A., Shaw Stewart, P. D., Race, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+Success+Rate+of+Protein+Crystallization+by+Random+Microseed+Matrix+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening.</a> J. Vis. Exp. (78), e50548(2013).</li>
<li>Dierks, K., Meyer, A., Oberthür, D., Rapp, G., Einspahr, H., Betzel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+UV+detection+of+protein+crystals+enabled+by+fluorescence+excitation+at+wavelengths+longer+than+300+nm%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+F+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Efficient UV detection of protein crystals enabled by fluorescence excitation at wavelengths longer than 300 nm.</a> Acta Crystallogr F Biol Crystallogr. 66, 478-484 (2010).</li>
<li>Szewczak, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Structural+studies+of+the+bacterial+MreBCD+complex%22">Structural studies of the bacterial MreBCD complex</a>. , University of Cambridge, UK. (2016).</li>
<li>Nayak, V., Dessau, M., Kucera, K., Anthony, K., Ledizet, M., Modis, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+dengue+virus+type+1+envelope+protein+in+the+postfusion+conformation+and+its+implications+for+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of dengue virus type 1 envelope protein in the postfusion conformation and its implications for membrane fusion.</a> J. Virol. 83, 4338-4344 (2009).</li>
<li>Gorrec, F., Palmer, C. M., Lebon, G., Warne, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pi+sampling%3A+a+methodical+and+flexible+approach+to+initial+macromolecular+crystallization+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Pi sampling: a methodical and flexible approach to initial macromolecular crystallization screening.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 67, 463-470 (2011).</li>
<li>Parker, J. L., Newstead, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+trends+in+%CE%B1-helical+membrane+protein+crystallization%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Current trends in α-helical membrane protein crystallization: An update.</a> Protein Sci. 21, 1358-1365 (2012).</li>
<li>Gorrec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MORPHEUS+II+protein+crystallization+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+F+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">The MORPHEUS II protein crystallization screen.</a> Acta Crystallogr F Biol Crystallogr. 71, 831-837 (2015).</li>
<li>Yin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hitting+the+target%3A+fragment+screening+with+acoustic+in+situ+co-crystallization+of+proteins+plus+fragment+libraries+on+pin-mounted+data-collection+micromeshes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Hitting the target: fragment screening with acoustic in situ co-crystallization of proteins plus fragment libraries on pin-mounted data-collection micromeshes.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 70, 1177-1189 (2014).</li>
<li>Wu, P., Noland, C., Ultsch, M., Edwards, B., Harris, D., Mayer, R., Harris, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+the+Implementation+of+Acoustic+Droplet+Ejection+for+Protein+Crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22JALA%22%5BJournal%5D)">Developments in the Implementation of Acoustic Droplet Ejection for Protein Crystallography.</a> JALA. 21, 97-106 (2015).</li>
<li>Zipper, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+to+reduce+evaporation+of+crystallization+droplets+by+using+plate+lids+with+apertures+for+adding+liquids%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+F+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">A simple technique to reduce evaporation of crystallization droplets by using plate lids with apertures for adding liquids.</a> Acta Crystallogr F Biol Crystallogr. 70, 1707-1713 (2014).</li>
<li>Wagner, A., Duman, R., Stevens, B., Ward, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcrystal+manipulation+with+laser+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Microcrystal manipulation with laser tweezers.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 69, 1297-1302 (2013).</li>
<li>Newman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+Evaluations+of+the+Reproducibility+of+Vapor-Diffusion+Crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Initial Evaluations of the Reproducibility of Vapor-Diffusion Crystallization.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 63, 826-832 (2007).</li>
<li>Reis, N. M., Chirgadze, D. Y., Blundell, T. L., Mackley, M. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19923710">The effect of protein-precipitant interfaces and applied shear on the nucleation and growth of lysozyme crystal.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65, 1127-1139 (2009).</li>
<li>McPherson, A., Koszelak., S., Axelrod, H., Day, J., Robinson, L., McGrath, M., Williams, R., Cascio, D. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0022024886901715">The effects of neutral detergents on the crystallization of soluble proteins.</a> J. Crystal Growth. 76 (3), 547-553 (1986).</li>
<li>Sauter, C., Ng, J. D., Lorber, B., Keith, G., Brion, P., Hosseini, M. W., Lehn, J. -M., Giegé, R. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022024898008525">Additives for the crystallization of proteins and nucleic acids.</a> J. Crystal Growth. 196, 365-376 (1999).</li>
<li>McPherson, A., Cudney, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Searching+for+silver+bullets%3A+an+alternative+strategy+for+crystallizing+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Searching for silver bullets: an alternative strategy for crystallizing macromolecules.</a> J. Struct. Biol. 156, 387-406 (2006).</li>
<li>Gorrec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+crystallization+screens+developed+at+the+MRC+Laboratory+of+Molecular+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Protein crystallization screens developed at the MRC Laboratory of Molecular Biology.</a> Drug Discov. Today. 21, 819-825 (2016).</li>
<li>Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., DeTitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermofluor-based+high-throughput+stability+optimization+of+proteins+for+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies.</a> Anal. Biochem. 357, 289-298 (2006).</li>
<li>Chari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ProteoPlex%3A+stability+optimization+of+macromolecular+complexes+by+sparse-matrix+screening+of+chemical+space%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">ProteoPlex: stability optimization of macromolecular complexes by sparse-matrix screening of chemical space.</a> Nat. Methods. 12, 859-865 (2015).</li>
<li>Newman, J., Egan, D., Walter, T. S., Meged, R., Berry, I., Ben Jelloul, M., Sussman, J. L., Stuart, D. I., Perrakis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+rationalization+of+crystallization+screening+for+small-+to+medium-sized+academic+laboratories%3A+the+PACT%2FJCSG%2B+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Towards rationalization of crystallization screening for small- to medium-sized academic laboratories: the PACT/JCSG+ strategy.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61, 1426-1431 (2005).</li>
<li>Wilson, J. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/08893110410001664837">Automated Evaluation of Crystallisation Experiments.</a> Cryst. Rev. 10, 73-84 (2004).</li>
<li>Snell, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+a+training+set+through+the+visual+analysis+of+crystallization+trials.+Part+I%3A+%E2%88%BC150+000+images%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Establishing a training set through the visual analysis of crystallization trials. Part I: ∼150 000 images.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 64, 1123-1130 (2008).</li>
<li>Haupert, L. M., Simpson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+protein+crystallization+trials+by+second+order+nonlinear+optical+imaging+of+chiral+crystals+%28SONICC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC).</a> Methods. 55, 379-386 (2011).</li>
<li>Newman, J., Fazio, V., Lawson, B., Peat, T. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/cg1004209">The C6 Web Tool: A Resource for the Rational Selection of Crystallization Conditions.</a> Cryst. Growth & Des. 13, 12219-12223 (2010).</li>
</ol>

אנחנו בזאת המדינה עניין מסחרי סותרות מאז LifeArc commercializes את הפריטים הבאים: 96 - ו 48-הבאר MRC צלחות, MRC תלייה טיפה החותם, המסכים התגבשות LMB אנגסטרום, Pi, מורפיוס.

1 - הכנה ושימוש ראשוני מסכי מאוחסנים לוחות
הקרנת ערכות צריך להיות מעורב לפני להיות בגליל לוחות כי ההפרדה משקעים או שלב אור מתרחשת כמה צינורות במהלך האחסון. כאשר המסך מורכב שתי ערכות (2 x 48 צינורות), הצינור הראשון של ערכת השני ממוקם במיקום E1 נושאת קירור. כאשר המסך מורכב של ערכות 4 (4 x 24 צינורות), הצינור הראשון של ערכת השני ימוקם במיקום C1, הצינור הראשון של ערכת השלישי ממוקם במיקום E1, הצינור הראשון של ערכת הרביעי ממוקם במיקום G1. בעת הוספת הצינורות במנשא הקירור שלהם, עפעפיו ממוקמות על מגש בעקבות הפריסה תקן 96-ובכן נוף. מאז המספרים טוב נקובים מעל עפעפיו על ידי יצרני, הדבר מאפשר הצלבת אם לכל הצינורות הונחו בסדר הנכון. זה גם עוזר כדי להחליף את המכסים הנכון על הצינורות בעת מילוי מספר מופחת של צלחות.
אנו מאחסנים את הצלחות שמולאו מראש ב 10 ° C, פשרה כדי להימנע הקפאה ואחסון ב 4 ° C זה עלול לגרום להידרדרות של מצבים ובעיות עם איטום. צלחות מאוחסנים עבור אפילו מספר חודשים עם כלל לא מורגש עיבוי על הפנים הפנימי של החותם. זה פחות נכון עבור לוחות LMB05, LMB06, LMB09, LMB10 כמו אלה מכילים התנאים עם ריכוזים גבוהים יחסית של ריאגנטים נדיף (טבלה 1). כמות קטנה של עיבוי על הצד הפנימי של החותם מפחית יעילות איטום והוא יכול לגרום זיהום צולב בין בארות בזמן unsealing את הצלחות. כדי לסייע למנוע עיבוי במהלך הקירור הראשוני, צלחות ניתן להעביר תחילה של הקרוסלה לתוך פיקניק מבודדים קריר המאוחסן בחדר קר 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. התקררות איטית מאוד מצמצם את ההתפתחות של מעברי צבע הטמפרטורה בתוך הבארות אטום, ומכאן ומפחיתה עיבוי הכוללת15. בנוסף, ברגע הלוחות מאוחסנים בחממה 10 ° C, ללא צורך במיקור חוץ מותאמים אישית SBS פוליסטירן המכסה מושם בצלחת בחלק העליון של כל ערימה (לא מוצג).
הערכה השלמה של הצלחות שמולאו מראש שלנו יכול לשמש כמסך ראשונית גדולה נגד מדגם הרומן, מסיסים במים, חלבון. לחלופין, ייתכן שנבחר צלחות פחות כדי להתאים את דרישות ספציפיות. לדוגמה, LMB15 ו- LMB19 הם מסכים שגובשו במיוחד עבור26,דגימות חלבון ממברנה27, או LMB20 היא מסך עם כבד-אטומים כדי להקל על ניסיוני בהדרגה של נתוני דיפרקציה28 (ראה גם : <a href="https://www.youtube.com/watch?v=Gpb4SypWnQY&t=11s">ניסוח של מורפיוס חלבון התגבשות המסכים</a>).
2. הגדרת התגבשות טיפות
בעת שימוש במערכת 2, הקרנת ערכות עם כמויות משמעותיות של ריאגנטים נדיף תעובד קודם. זה מונע התעבות שהצטבר על הגומי של הכיסוי SBS, אשר יכול להשפיע על מכסה טיפול ואיטום צלחת. המכסה SBS יש קצת סיווג כאשר על צלחת, ולכן הם צריכים להיות מיושרים בתחילה (ראה פרוטוקול, שלב 1.2.6). אמצעי האחסון מת ב הבארות של צלחת PCR חלבון הם נדיב יחסית (0.8 µL, ראה מקרא המובאים בטבלה 2). שימו לב כי באותה מידה נדיב כרכים מת הם מועסקים בעת השימוש מנפק nanoliter בנפרד עם חלבון ברצועות 8-טוב (טבלה 4). אמצעי אחסון קטן יותר מת עשויה לפעול, אולם כמה דגימות לדבוק הטיפים, כיול של רובוט עשוי להיות מעט לא מדויקים, החדר יכול להיות חם יותר מאשר כרגיל, ועוד. כל להוביל לדוגמה הפסדים מכוסה על ידי אמצעי האחסון מת נדיב על מנת לחזק את הגישה.
התפתחויות נוספות המזעור של ניסויים וההגדרה ומכאן היקף המדגם הדרוש לסינון התגבשות התנאים ניתן להפחתה בהכניסו המתאימים טכנולוגיה29,30 . עם זאת, היבטים מסוימים של מזעור נוסף צריך שיקול דעת זהיר, כגון האידוי של טיפות31 והמניפולציה של microcrystals32.
לבסוף, צנטריפוגה של הצלחת (2,000 סל ד, 1 דקות) יכול להיות משולב כשלב הסופי שגרתית בעת הגדרת התגבשות טיפות (ב כדורית העליונה-ולס). בגודל ובצורה עקבית יותר של טיפות הנובע צנטריפוגה עשויה להפחית הפארמצבטית-בעיות-33,-34. . בוודאי, טיפות ממורכז תקל את ההערכה מאוחר יותר של ניסויים באמצעות מיקרוסקופ כפי אורך המוקד הדרוש יהיה דומה על פני המשטח כולו.
3. יתרונות השיטה 4-פינה
היתרון המשמעותי ביותר של שיטת 4-פינה הוא הפשטות שלה, אשר ממזער שגיאות ומקל פרוטוקולים אוטומטיים פשוטה. לדוגמה, הפתרונות בפינה תמיד ימוקם על סיפון נוזלי עוזר בעקבות באותה הפריסה. כמו כן, כל התוכניות מבוססות על יחס קבוע בין הפתרונות (איור 3C). הכנה ידנית של הפתרונות בפינה היא עדיפה לטיפול האוטומטי של פתרונות בריכוזים גבוהים, אשר יכול להיות בעלי צמיגות גבוהה. יחסית מהיר ומדויק השאיפה/dispensing אפשרי אז על רוב סוגי המטפלים נוזלי עם הדרישות המינימליות עבור אופטימיזציה של מחלקות נוזלי. בכל זאת, כמה פתרונות פינה עדיין ייתכן צמיגה יותר מדי בשביל רובוט הפועלים עם מערכת נוזל לפעול ביעילות. זו הסיבה לניתוח עוזר נוזלי ההפעלה עם תזוזה חיובית (איור 3B).
בנוסף 2 מעברי צבע ליניאריים של ריכוזים, רכיב השלישי (כלומר, קבוצה של אנשים רגילים/תוספים) יכול להיבדק על ריכוז קבוע בדרך נוחה. בשביל זה, כמויות גדולות יחסית של ערכה בסיסית של פתרונות פינה-ריכוז גבוה יותר כראוי, לא כולל את הרכיב כדי להיות מגוונים, מוכן קודם. לאחר מכן, מלאי פתרונות כולל רכיב זה מתווסף כדי להתאים את ריכוזי הסופי. לדוגמה, 50 מ של קבוצת 4 פינת פתרונות מוכנים בריכוזים גבוהים 10% מאשר בתחילה. סט הליבה ואז מפוצל לערכות 5 של 4. לבסוף, 10% בנפח של מאגר שונים-pH פתרונות מתווסף משנה.
4. תבניות וסוגי מסכי מוספים
המסכים מאוחסנים בדרך כלל ב-20 ° C (איור 4) מאז הם לא משמשים באופן קבוע ומכילים חומרים נדיפים/לא יציב. השימוש של מסך מוספים קפוא המאוחסנים בתוך גוש עמוק טוב (1 מ"ל במספר בארות) חייב להיות מתוכנן מוקדם כי זה יקח 12-24 ביממה עבור כל הפתרונות מוספים להפשיר לחלוטין בטמפרטורת החדר. כמו כן, מספר רב של משתמשים לשתף באותו מסך מוספים, ובכך לגרום בעיות זיהום צולב. לבסוף, הגובה של בלוקים עמוק טוב גורם להם מתאימים עבור רוב מתקני החלוקה nanoliter. כפתרון נוח כדי לעקוף בעיות אלה, המסך צריך להעביר מהגוש עמוק טוב לוחות פרופיל נמוך (איור 4).
מבחינה היסטורית, מסכי מוספים הכוללים מגוון רחב של ריאגנטים יחיד (עם ריכוזים יחיד) היה מאוד פופולרי35,36. עם זאת, סוגים אחרים של מסכי מוספים פותחו המשלבים mixes תוספים37 או מספר מופחת של תוספים יחיד ב ריכוזים שונים38. לבסוף, בגישה המשלימה היא לחקור את ההשפעה של תוספות על הדגימות לפני התגבשות39,40.
5. עוד שיקולים
אימון טוב: רוב מסכי מכילים חומרים מזיקים או אפילו רעילים, ולכן חייב להיות מועסק הגנה אישית נאותה במהלך הפרוטוקולים. באותה מידה, חלקים של הרובוטים נעים עלול להוביל לפציעות, במיוחד כאשר מנסה להפריע באופן ידני בעת הפעלת תוכנית (למרות רוב הרובוטים יש לחצן עצירת חירום/מערכת). בגלל המורכבות הטכנית מעורבת, רגיל בדיקה של רובוטים, מסכי ותוכניות עם בעבר אפיינו את הבדיקה דוגמאות חשובים עבור רמות גבוהות מתמשכת של הפארמצבטית.
תפוקת: כאינדיקציה, בין 4,000 ל 8,000 LMB הלוחות מיוצרים שנתי עם מערכת 1 (וגם לאחר מכן מועסקים על-ידי משתמשים להקרנה הראשונית). שזה לא מותאם מניות כמות גדולה של צלחות שמולאו מראש ב 10 ° C כאשר מחזור הצפוי הוא נמוך בהרבה, כמו אחרי 4-5 חודשים, כמה תנאים יתחיל להתדרדר להתאדות. גישות שונות כדי אוטומציה פרוטוקולים יושמו עבור מעבדות קטנות - עד בינוניים41.
Storing והערכה ניסויים: לאחר הכנת את טיפות, צלחות מאוחסנים על מדפים נמוכים-רטט בחדר בשעה 4 או 18 ° C עם טמפרטורה מבוקרת בחוזקה (+ /-0.5 ° C סטיית המרבי). ניסויים הם העריכו באמצעות מיקרוסקופים מקור אור קר. מערכות הדמיה אוטומטיות שונות זמינים מסחרית, אולם אחד יש לשקול היטב כל ההיבטים: המהירות הדרושה כדי לסרוק צלחת יהיה מספיק עבור תפוקה גבוהה? אובייקטים שאינם קריסטלים יפריע פוקוס אוטומטי? איכות התמונות המתקבלת יהיה מספיק כדי ספוט גבישים קטנים מאוד (במיוחד סביב קצה טיפות)? 42 , 43 , 44
השוואה של התגבשות התנאים: לאחר חקירות זהיר על טבעו של הקריסטלים השיג בתחילה, אחד ניתן לנתח מגמות, דמיון על פני תנאי שימוש על <a href="http://fms-3.lmb.internal/screens2/search.html">LMB מסך מסד הנתונים</a> או את C6 <a href="http://c6.csiro.au/">כלי אינטרנט</a>45.

קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן מוחל נרחב כדי לקדם את ההבנה שלנו של מנגנונים ביולוגיים ומחלות בשלב האטומי וכדי לסייע לאחר מכן גישות רציונלי גילוי סמים1. בשביל זה, מטוהרים, מרוכז (2-50 מ"ג/מ"ל) דוגמאות macromolecular של חלבון, DNA, RNA, אחר ליגנדים מתחמי שלהם הם trialed עבור שלהם נטיה טופס הזמנת סורגים תלת מימדי התגבשות2,3 ,4. כאשר גבישים באיכות גבוהה מתקבלים זה מכמותה צילומי רנטגן, עשוי לפתור את מבנה גבישי ליד ברזולוציה אטומית5,6. ויותר חשוב, לא ניתן לחזות את התנאים כדי לגבש מדגם הרומן, התשואה של גבישים באיכות גבוהה בדרך כלל נמוך מאוד. הסיבה הבסיסית היא דוגמאות רבות עניין מאתגר מאפייני הביוכימי, ההופכים אותם לא יציב על ציר הזמן המתאים עבור התגבשות (בדרך כלל כמה ימים). בסופו של דבר, התהליך מורכב את הזמן הנדרש כדי לייצר גרסאות מדגם ודוגמאות, וכדי לייעל את טיהור וגיבוש -7,8.
תנאי התגבשות הוא פתרון עם precipitant המפחיתה מדגם מסיסות, תנאים מכילים לעתים קרובות גם מאגרים ותוספים. מאות כאלה ריאגנטים מתאימים היטב כדי לשנות את הפרמטרים של הניסויים התגבשות כפי שיש להם נטיה נמוכה להתערב עם שלמות הדגימה (כגון חלבון או חומצות גרעין התגלגלות). ואילו בדיקות מיליונים of שילובים of התגבשות ריאגנטים הוא לא ריאלי, בדיקה כמה הרבה ערכות הקרנה - גיבש עם אסטרטגיות שונות9,10 - אפשרי עם ניסויים ולמחקר ופרוטוקולים אוטומטית. בפרספקטיבה הזו, הטכניקה נוח ביותר היא כנראה אדי דיפוזיה עם 100-200 nL טיפות יושב על באר קטן מעל מאגר המכיל את התנאי התגבשות (25-250 µL), מיושמת צלחות מיוחדות התגבשות11 , 12. תנאי ולדגום החלבון משולבים לעתים קרובות ביחס 1:1 עבור הנפח הכולל של 200 nL בעת הגדרת את טיפות בבארות העליונה. ניתן ליישם התגבשות חלבון nanoliter רובוטית עם טכניקות חלופיות, צלחות כגון שמן שפרמיה אצווה13 ושלב מעוקבים Lipidic14 (אחד האחרונים מיושמת באופן ספציפי הטרנס-הממברנה חלבונים הנמצאים מאוד מסיסות במים).
<a href="http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/groups/JYL/WWWrobots/robot.html">המתקן התגבשות-MRC-LMB</a> החלה בתחילת שנות האלפיים, סיכום מוקדם של פרוטוקולים אוטומטיים שלנו הוצג בשנת 200515. הקדמה היסטורית חלבון התגבשות הוצג ולגשת גם חלוקה לרמות את היתרונות של nanoliter רובוטית (ואז גישה מוזרה לניסויים בבעלי חיים שגרתיים). מאז התגבשות macromolecular הוא בעצם תהליך סטוכסטי עם מעט מאוד או לא שימושי מידע מוקדם, העסקת במגוון רחב של מחלות הראשונית (מתאים) להגדיל את התשואה של איכות עקיפה קריסטלים16. חוץ מזה, יתרון-מתעלמים של מסך גדול הראשונית היא להפחית באופן משמעותי את הצורך אופטימיזציה של גבישים במקרים רבים ודוגמאות. כמובן, אחד עשוי עדיין צריכים להמשיך עם אופטימיזציה של כמה תנאים הראשונית מאוחר יותר. בדרך כלל, הריכוז של ריאגנטים, ה-pH ואז באופן שיטתי נחקרות. ריאגנטים יותר ניתן גם להזרים את תנאים אופטימליים יותר לשנות פרמטרים של התגבשות. בהחלט, אחד צריך לנסות התגבשות עם מדגם הטרי, ומכאן הפרוטוקולים המתאימים להיות פשוטה וזמינה בכל עת.
כאן, שתיים אוטומטי לחלוטין מערכות תוכנן ב- MRC-LMB (מערכות 1 ו-2), הפרוטוקולים המתאימים מתוארים באופן מלא. היישום העיקרי של שתי מערכות אלה היא ראשונית ההקרנה על ידי פיזור אדי יושב טיפה התגבשות צלחות. מערכת 1 משלבת מלווה נוזלי, של קרוסלה אוטומטית ללוחות מניות, מדפסת הזרקת דיו של צלחת תיוג של סילר לאיטום צלחת דבק. במערכת 1, צלחות 96-ובכן 72 מלא עם ערכות זמינים מסחרית ההקרנה (80 µL של מצב יועברו למאגר מ נפח ההתחלתי של 10 מ"ל במבחנות), שכותרתו, אטום. הלוחות מאוחסנים ואז חממה 10 ° C שיהיו זמינים למשתמשים בכל עת (כמו מסכי הראשוני הנקרא 'LMB צלחות').
מערכת 2 משלב מלווה נוזלי, מתקן nanoliter, סילר לאיטום של צלחת דבק. במערכת 2, יושב טיפות (100-1, 000 nL) לניסויים דיפוזיה אדי מיוצרים על ידי שילוב של תנאים, המדגם בבארות העליונה של 20 צלחות 48 - או 96-ובכן מראש מתמלאת תנאים. משמעות הדבר היא תנאי ההקרנה הראשונית 1,920 הם trialed בעת שימוש 20 צלחות LMB על מערכת 2.
רובוטים משמשים גם בנפרד עבור אופטימיזציה של התנאים שנבחרו, הפרוטוקולים חצי אוטומטי המתאים מתוארים גם. שיטה 4-בפינת ה-17 הוא מועסק באופן שגרתי כדי לייצר מסכי אופטימיזציה. הפרוטוקול המתאים הראשון דורש הכנה ידנית של 4 פתרונות ("A, B, C ו- D'). שני מעברי צבע ליניאריים של ריכוזים (עבור שני סוכנים התגבשות הראשי) ואז נוצרות באופן אוטומטי ישירות לתוך המאגרים של צלחת התגבשות. בשביל זה, המטפל נוזלי המבוסס על המזרק dispenses הפתרונות בפינה-יחס שונה.
כדי לייעל עוד יותר תנאי, אחד יכול להעסיק מסכי תוסף זה פוטנציאל לשפר את המאפיינים של גבישים וכתוצאה מכך18. שתי הגישות זמינים להקרנה מוספים: פרוטוקול מתחיל עם תוספים בגליל לתוך המאגרים של התגבשות צלחות לפני שתגדיר את טיפות (פרוטוקול 1) ופרוטוקול אחר שבו המסך תוסף זה בגליל ישירות על גבי טיפות (פרוטוקול 2).
התפתחויות שימושיות אחרות היו ביוזמת MRC-LMB כדי להקל על התגבשות macromolecular אוטומטיות, מוצגים גם. בעיקרו של דבר, התגבשות צלחות ומכשירים המשויכים כגון משתלבת החברה של למערכות ביולוגיות ההקרנה (SBS) מכסה את זה ממזער אידוי של תנאים כאשר באמצעות מערכת 2.
לשם קיצור, ההנחה היא כי המשתמשים הם מכירים הפונקציות הבסיסיות ואת התחזוקה של מנפק nanoliter למדפסת הזרקת דיו, חותם צלחת דבק. אלא אם צוין אחרת, צלחות על סיפונה של הרובוטים ימוקמו כך טוב A1 ('A1-הפינה') היא לכיוון הפינה השמאלית האחורית של נשאית צלחת.

<table><tbody><tr><td>Robots</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Freedom EVO&reg;</td><td>Tecan</td><td>n/a</td><td>מטפל בנוזלים (מערכת 1). שאיבה / חלוקה על בסיס נוזל מערכת. משלב קרוסלה אוטומטית. EVOware פלוס תוכנת שליטה v.2.4.12.0.&nbsp;</td></tr><tr><td>מיקרו-מעבדה; סטאר אנד טרייד;</td><td>המילטון</td><td>n/a</td><td>מטפל בנוזלים (מערכת 2). שאיפה/חלוקה המבוססת על תזוזה חיובית (CO-RE&trade; טכנולוגיה). תוכנת שליטה של המילטון STAR v.4.3.5.4785 עם ממשק ניהול שיטות.</td></tr><tr><td>יתוש &reg;</td><td>TTP Labtech</td><td>n/a</td><td>מתקן ננוליטר מבוסס מיקרו-מזרק המשמש להגדרת טיפות (מערכת 2 ועצמאית), סיפון בעל 3 מצבים. תוכנת שליטה v.3.11.0.1422.&nbsp;</td></tr><tr><td>שפירית;</td><td>TTP Labtech</td><td>n/a</td><td>מטפל נוזלים מבוסס מזרק המשמש לייצור מסכי אופטימיזציה (שיטת 4 פינות). תוכנת שליטה v.1.2.1.10196.&nbsp;</td></tr><tr><td>אוטם לוחות דבק</td><td>Brandel</td><td>n/a</td><td>משולב במערכות 1 ו-2 (משמש גם כרובוט עצמאי).</td></tr><tr><td>מדפסת הזרקת דיו 9232</td><td>Markem-Imaje</td><td>n/a</td><td>משולבת במערכת 1. ממשק מסך מגע.</td></tr><tr><td><מסכי התגבשות חזקים></חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מסך קריסטל ומסחר; 1</td> ערכת התגבשות <td>של Hampton Research</td><td>HR2-110</td><td>(מבחנות, 10 מ"ל למצב) המשמשת במסך קריסטל LMB01</td></tr><tr><td>2&trade;</td>ערכת התגבשות <td>Hampton Research</td><td>HR2-112</td><td>(מבחנות, 10 מ"ל למצב) המשמשת באשף LMB01</td></tr><tr><td>ומסחר; ערכת</td> התגבשות <td>1009530</td><td>Rigaku</td> קלאסית <td>1 (מבחנות, 10 מ"ל למצב) המשמשת ב-LMB02</td></tr><tr><td>Wizard&trade; ערכת</td> התגבשות קלאסית 2 <td>Rigaku</td><td>1009531</td><td>(מבחנות, 10 מ"ל למצב) המשמשת ב-LMB02</td></tr><tr><td>Grid Screen&trade; אמוניום סולפט</td><td>המפטון מחקר</td><td>HR2-211</td><td>ערכת התגבשות (מבחנות, 10 מ"ל למצב) המשמשת ב-LMB03</td></tr><tr><td>Grid Screen&trade; ערכת התגבשות PEG/LiCl</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-217</td><td>(מבחנות, 10 מ"ל למצב) המשמשת ב-LMB03</td></tr><tr><td>Quick Screen&Trade;</td><td>ערכת</td> התגבשות Hampton <td>Research HR2-221</td><td>(מבחנות, 10 מ"ל למצב) המשמשת ב-LMB03</td></tr><tr><td>Grid Screen&trade; ערכת התגבשות נתרן כלוריד</td><td>המפטון מחקר</td><td>HR2-219</td><td>(מבחנות, 10 מ"ל למצב) המשמשת ב-LMB03</td></tr><tr><td>Grid Screen&trade; PEG 6000</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-213</td><td>ערכת התגבשות (מבחנות, 10 מ"ל למצב) המשמשת ב-LMB04</td></tr><tr><td>Grid Screen&trade; ערכת</td> התגבשות <td>MPD Hampton Research</td><td>HR2-215</td><td>(מבחנות, 10 מ"ל למצב) המשמשת ב- LMB04</td></tr><tr><td>MemFac&trade;</td><td>ערכת</td> התגבשות Hampton <td>Research HR2-114</td><td>(מבחנות, 10 מ"ל למצב) המשמשת ב-LMB04</td></tr><tr><td>PEG/Ion&trade;</td><td>ערכת</td> התגבשות Hampton <td>Research HR2-126</td><td>(מבחנות, 10 מ"ל למצב) המשמשת ב-LMB05</td></tr><tr><td>Natrix&trade;</td>ערכת התגבשות <td>Hampton Research</td><td>HR2-116</td><td>(מבחנות, 10 מ"ל למצב) המשמשת ב-LMB05</td></tr><tr><td>Crystal Screen Lite&trade;</td><td>ערכת</td> התגבשות Hampton <td>Research HR2-128</td><td>(מבחנות, 10 מ"ל למצב) המשמשת ב-LMB06</td></tr><tr><td>Custom Lite</td><td>screen Molecular Dimensions Ltd</td><td>n/a</td><td>ערכת התגבשות (מבחנות, 10 מ"ל למצב) המשמשת ב-LMB06</td></tr><tr><td>Wizard&trade; </td> ערכת התגבשות Cryo 1 <td>Rigaku</td><td>1009536</td><td>(מבחנות, 10 מ"ל למצב) המשמשת ב-LMB07</td></tr><tr><td>Wizard&trade; </td> ערכת התגבשות Cryo 2 <td>Rigaku</td><td>1009537</td><td>(מבחנות, 10 מ"ל למצב) המשמשת בערכת התגבשות LMB07</td></tr><tr><td>JBS1</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-101L</td><td>(מבחנות, 10 מ"ל למצב) המשמשת בערכת התגבשות LMB08</td></tr><tr><td>JBS2</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-102L</td><td>(מבחנות, 10 מ"ל למצב) המשמשת ב- LMB08</td></tr><tr><td>JBS3</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-103L</td><td>ערכת התגבשות (מבחנות, 10 מ"ל למצב) המשמשת בערכת התגבשות LMB08</td></tr><tr><td>JBS4</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-104L</td><td>(מבחנות, 10 מ"ל למצב) המשמשת בערכת התגבשות LMB08</td></tr><tr><td>JBS5</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-105L</td><td>(מבחנות, 10 מ"ל למצב) המשמשת בערכת התגבשות LMB09</td></tr><tr><td>JBS6</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-106L</td><td>(מבחנות, 10 מ"ל למצב) המשמשת ב-LMB09</td></tr><tr>ערכת התגבשות <td>JBS7</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-107L</td><td>(מבחנות, 10 מ"ל למצב) המשמשת בערכת התגבשות LMB09</td></tr><tr><td>JBS8</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-108L</td><td>(מבחנות, 10 מ"ל למצב) המשמשת בערכת התגבשות LMB09</td></tr><tr><td>JBS9</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-109L</td><td>(מבחנות, 10 מ"ל למצב) המשמשת ב- LMB10</td></tr><tr><td>JBS10</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-110L</td><td>ערכת התגבשות (מבחנות, 10 מ"ל למצב) המשמשת ב-LMB10</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; מסך 1 pH 4.5</td><td>מידות מולקולריות בע"מ</td><td>MD1-16LMB</td><td>ערכת התגבשות (מבחנות, 10 מ"ל למצב) המשמשת ב-LMB10</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; מסך 1 pH 5.5</td><td>מידות מולקולריות בע"מ</td><td>MD1-16LMB</td><td>ערכת התגבשות (מבחנות, 10 מ"ל למצב) המשמשת ב-LMB10</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; מסך 1 pH 6.5</td><td>מידות מולקולריות בע"מ</td><td>MD1-16LMB</td><td>ערכת התגבשות (מבחנות, 10 מ"ל למצב) המשמשת ב-LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; מסך 1 pH 7.5</td><td>מידות מולקולריות בע"מ</td><td>MD1-16LMB</td><td>ערכת התגבשות (מבחנות, 10 מ"ל למצב) המשמשת ב-LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; מסך 1 pH 8.5</td><td>מידות מולקולריות בע"מ</td><td>MD1-16LMB</td><td>ערכת התגבשות (מבחנות, 10 מ"ל למצב) המשמשת ב-LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; מסך 2 pH 4.5</td><td>מידות מולקולריות בע"מ</td><td>MD1-16LMB</td><td>ערכת התגבשות (מבחנות, 10 מ"ל למצב) המשמשת ב-LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; מסך 2 pH 5.5</td><td>מידות מולקולריות בע"מ</td><td>MD1-16LMB</td><td>ערכת התגבשות (מבחנות, 10 מ"ל למצב) בשימוש ב-LMB12</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; מסך 2 pH 6.5</td><td>מידות מולקולריות בע"מ</td><td>MD1-16LMB</td><td>ערכת התגבשות (מבחנות, 10 מ"ל לכל מצב) בשימוש ב-LMB12</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; מסך 2 pH 7.5</td><td>מידות מולקולריות בע"מ</td><td>MD1-16LMB</td><td>ערכת התגבשות (מבחנות, 10 מ"ל למצב) המשמשת ב-LMB12</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; מסך 2 pH 8.5</td><td>מידות מולקולריות בע"מ</td><td>MD1-16LMB</td><td>ערכת התגבשות (מבחנות, 10 מ"ל למצב) המשמשת באינדקס LMB12</td></tr><tr><td>ומסחר;</td>ערכת התגבשות <td>Hampton Research</td><td>HR2-144</td><td>(מבחנות, 10 מ"ל למצב) המשמשת ב-LMB13</td></tr><tr><td>SaltRX&trade; 1</td> ערכת התגבשות <td>Hampton Research</td><td>HR2-107</td><td>(מבחנות, 10 מ"ל למצב) המשמשת ב-LMB14</td></tr><tr><td>SaltRX&trade; 2</td> ערכת התגבשות <td>Hampton Research</td><td>HR2-109</td><td>(מבחנות, 10 מ"ל למצב) המשמשת ב-LMB14</td></tr><tr><td>MemStar&trade;</td><td>מידות מולקולריות בע"מ</td><td>MD1-21</td><td>ערכת התגבשות (מבחנות, 10 מ"ל למצב) בשימוש ב- LMB15</td></tr><tr><td>MemSys&trade;</td><td>מידות מולקולריות בע"מ</td><td>MD1-25</td><td>ערכת התגבשות (מבחנות, 10 מ"ל למצב) בשימוש ב- LMB15</td></tr><tr><td>JCSG-plus&trade; Suite</td><td>Qiagen</td><td>130720</td><td>ערכת התגבשות (מבחנות, 10 מ"ל למצב) בשימוש ב-LMB16</td></tr><tr><td>MORPHEUS&reg; מסך</td><td>מידות מולקולריות בע"מ</td><td>MD1-46</td><td>ערכת התגבשות (מבחנות, 10 מ"ל למצב) המשמשת במסך מינימלי LMB17</td></tr><tr><td>Pi</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-127</td><td>ערכת התגבשות (מבחנות, 10 מ"ל למצב) המשמשת במסך LMB18</td></tr><tr><td>Pi-PEG</td><td>JenaBioScience</td>ערכת התגבשות <td>CS-128</td><td>(מבחנות, 10 מ"ל למצב) המשמשת ב-LMB19</td></tr><tr><td>MORPHEUS&reg; מסך II</td><td>מידות מולקולריות בע"מ</td><td>MD1-91</td><td>ערכת התגבשות (מבחנות, 10 מ"ל לכל מצב) בשימוש</td></tr><tr><td>במסך התגבשות LMB20 LMB ומסחר;</td><td>מידות מולקולריות בע"מ</td><td>MD1-98</td><td>ערכת התגבשות (מבחנות, 10 מ"ל למצב) המשמשת במסכי LMB21</td></tr><tr><td><חזקים>תוספים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HT מסך תוסף</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-138</td><td>קפוא בבלוק באר עמוק של 96 בארות (1 מ"ל לבאר).</td></tr><tr><td>MORPHEUS&reg; מסך תוסף</td><td>מידות מולקולריות בע"מ</td><td>MD1-93-500</td><td>קפוא בבלוק עמוק של 96 בארות (500 ומיקרו; L לבאר).</td></tr><tr><td>מסך תוסף ANGSTROM ומסחר; &nbsp;</td><td>מידות מולקולריות בע"מ</td><td>MD1-100</td><td>קפוא בבלוק באר עמוק של 96 בארות (1 מ"ל לבאר).</td></tr><tr><td>MORPHEUS&reg; מסך תוסף</td><td>מידות מולקולריות בע"מ</td><td>MD1-93</td><td>קפוא בתרבית תאים של 96 בארות Costar&reg; צלחת עם בארות בצורת V (100 ומיקרו; L לבאר).</td></tr><tr><td>מסך תוסף ANGSTROM ומסחר; &nbsp;</td><td>מידות מולקולריות בע"מ</td><td>MD1-100-FX</td><td>קפוא בתרבית תאים 96 בארות Costar&reg; צלחת עם באר בצורת V (100 ומיקרו; L לבאר).</td></tr><tr><td>מסך תוספים HIPPOCRATES</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>n/a</td><td>48 תוספים בודדים (תרכובות תרופות הנמצאות ב-MORPHEUS&reg; III).</td></tr><tr><td><חזק>חומרים מתכלים אחרים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 בארות MRC 2 טיפות צלחת</td><td>Swissci</td><td>MRC 96T-UVP</td><td>טיפת ישיבה, צלחת דיפוזיה אדים. נפח מומלץ במאגר: 80&nbsp; &micro;L. טווח נפחי טיפות שימושיות: 10-1000 nL. ניתן להעברת UV.</td></tr><tr><td>48 בארות MRC צלחת טיפה אחת&nbsp; ('צלחת מקסי')</td><td>Swissci</td><td>MMX01-UVP&nbsp;</td><td>טיפת ישיבה, צלחת פיזור אדים להגדלה/אופטימיזציה. נפח מומלץ במאגר: 200&nbsp; &micro;L. טווח נפחי טיפות שימושיים: 0.1-10 &micro;L. ניתן להעברת UV.</td></tr><tr><td>אטם טיפה תלויה MRC</td><td>Swissci</td><td>n/a</td><td>טיפה תלויה, תואם לשתי לוחות דיפוזיה של אדי MRC (MRC 96T-UVP ו-MMX01-UVP). ניתן להעברה של UV וקרני רנטגן.</td></tr><tr><td>סרט איטום דבק</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-50</td><td>ברוחב 3 אינץ' Duck&reg; HD Clear&trade; לאיטום ואיטום ידני.</td></tr><tr><td>יריעת אלומיניום דביקה</td><td>בקמן קולטר</td><td>538619</td><td>משמשת לאיטום מחדש של מסכי תוספים.</td></tr><tr><td>מחסנית דיו</td><td>Markem-Imaje</td><td>9651</td><td>System 1 (מדפסת הזרקת דיו).</td></tr><tr><td>מחסנית ממס</td><td>Markem-Imaje</td><td>8652</td><td>System 1 (מדפסת הזרקת דיו).</td></tr><tr><td>50 ומיקרו; טיפים&nbsp;</td><td>המילטון</td><td>235947</td><td>מערכת 2 (STAR&trade; מטפל בנוזלים). קופסה של 6 סטים עם 1920 x CO-RE&TRADE; טיפים בערימות חד פעמיות.</td></tr><tr><td>מיכל ריאגנט</td><td>המילטון</td><td>194052</td><td>משמש לחלוקת מצב לצלחות במהלך פרוטוקולי סינון תוספים.&nbsp;</td></tr><tr><td>צלחת PCR</td><td>Thermo Scientific&Trade;</td><td>AB-2150</td><td>מערכת 2 (מכילה חלבון שיועבר ליתוש). אבג'ן יהלום אולטרה, 384 בארות בצורת V.</td></tr><tr><td>מיקרו-מזרקים</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-03020</td><td>סליל של 26,000 מיקרו-מזרקים למתקן Mosquito&reg; ננוליטר (מרווח 9 מ"מ).</td></tr><tr><td>בלוק מחזיק רצועה</td><td>TTP Labtech</td><td>3019-05013</td><td>מכשיר SSB עבור Mosquito&reg; רצועות, הידוע גם בשם 'מחזיק ריאגנט 4 כיווני'.</td></tr><tr><td>2 ומיקרו; L רצועת 8 בארות</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-03110</td><td>מכיל חלבון על סיפון ה-Mosquito&reg;. קופסה של 40 רצועות, מקסימום נפח בבאר הוא 3.2 &micro;L.</td></tr><tr><td>5 ומיקרו; רצועה L 8 בארות</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-03100</td><td>מכיל חלבון על סיפון ה-Mosquito&reg;. קופסה של 40 רצועות, מקסימום נפח בבאר הוא 7.5 &micro;L.</td></tr><tr><td>מזרקים 5 מ"ל</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-07100</td><td>גוף מזרק ובוכנה למטפל הנוזלים Dragonfly&reg; חבילה של 100.</td></tr><tr><td>שקתות/מאגרים</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-07103</td><td>מכיל פתרונות מלאי על סיפון השפירית. חבילה של 50.</td></tr><tr><td>שייקר מיקרו-פלטות אורביטלי</td><td>CamLab Limited</td><td>n/a</td><td>Variomag&reg; לתנאי ערבוב בצלחת אחת (0-2000 סל"ד).</td></tr><tr><td>מערבל מיקרופלייט</td><td>TTP Labtech</td><td>3121-01015</td><td>MxOne. מצב ערבוב בצלחת אחת עם 96 סיכות רוטטות.</td></tr></tbody></table>

אוטומטית פרוטוקולים עבור התגבשות macromolecular במעבדה mrc של הביולוגיה המולקולרית

Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

כאשר גבישים באיכות גבוהה מתקבלים זה מכמותה צילומי רנטגן, עשוי לפתור את מבנה גבישי ליד ברזולוציה אטומית. התנאים כדי לגבש חלבונים, DNAs, RNAs ואת מתחמי שלהם עם זאת לא ניתן לחזות. העסקת במגוון רחב של תנאים היא דרך להגברת איכות עקיפה גבישים. שתי מערכות אוטומטית לחלוטין פותחו ב MRC מעבדה לביולוגיה מולקולרית (קיימברידג ', אנגליה, MRC-LMB) המאפשרים התגבשות הקרנה נגד תנאי ראשוני 1,920 על ידי אדי פיזור טיפות nanoliter. פרוטוקולים אוטומטיים למחצה גם פותחו כדי למטב את התנאים על-ידי שינוי הריכוזים של ריאגנטים, ה-pH, או על ידי החדרת תוספים המשפרים באופן פוטנציאלי מאפיינים של הקריסטלים וכתוצאה מכך. כל הפרוטוקולים המתאים להיות מתוארות בפרוטרוט ודן בקצרה. יחדיו, הם מאפשרים נוחה ויעילה מאוד macromolecular התגבשות במתקן מרובת-משתמשים, תוך מתן למשתמשים שליטה על פרמטרים מרכזיים של הניסויים שלהם.

מערכות אוטומטיות, פרוטוקולים עבור הכנת כמות גדולה של מסכי שגרתית ו nanoliter טיפות התגבשות לניסויים דיפוזיה אדי תיאר, דנו.

אוטומטית פרוטוקולים עבור התגבשות Macromolecular במעבדה MRC של הביולוגיה המולקולרית

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize ...

המטרה הכללית של הליך זה היא להפיק גבישים באיכות גבוהה מתנאי סינון ראשוניים של התגבשות. ניתן להשתמש בגבישים כדי לחקור את המבנים של חלבונים, DNA, RNA והקומפלקסים שלהם. חקירת מבנים מקרו-מולקולריים הפכה למאתגרת יותר ויותר.אספקה של מגוון רחב של תנאי התחלה מגדילה את התבואה של גבישים שימושיים, תוך הפחתת הצורך באופטימיזציה של הדגימה והגבישים. שתי המערכות האוטומטיות באופן מלא, ה-LMB, מקלות על הכנתם של עד 1,920 ניסויי דיפוזיית אדי בטיפות ננו-ליטר. למען הקצר, ההנחה היא שהמשתמשים כבר מכירים את הפונקציות הבסיסיות ואת התחזוקה של מחלק הננו-ליטר, מדפסת הזרת הדיו ומסגירת הפלטות הדביקה.לפני ביצוע הפרוצדורה, ודא כי הרובוטים של המערכת אותחלו ותוכנת הבקרה שלהם פתוחה. הפעל את הצ׳ילר של נשא קירור המבחנות כ-30 דקות לפני תחילת התוכנית הראשית. הנח פלטת בדיקה על נשא ה-SBS הממונע של סוגר הפלטות.הפעילו את מדבקת הפלטות (plate sealer) ובדקו שהסרט מיושם כראוי. חזרו על בדיקה זו פעמיים נוספות כדי לוודא שמדבקת הפלטות מוכנה. לאחר מכן, הוסיפו 20 liters של מים דה-יוניים למכל הראשי של מטפל הנוזלים (liquid handler).נתקו את תושבת הה coupling מהמכל הקטן של תמיסת השטיפה 20% ethanol, וחברו את התושבויות למכל הראשי. הזינו את שם המסך המתאים במסך המגע של מדפסת ההזרנה. לאחר מכן, פתחו וסגרו את דלת הקרוסלה כדי להפעיל את סיבוב הקרוסלה.פתחו את הדלת כאשר המגש הראשון מופיע. טענו באופן מלא את המגש הראשון עם 22 פלטות התגבשות, כאשר עבור כל פלטה עמודה אחת פונה החוצה. טענו באופן מלא את שני המגשים הבאים באותה הדרך.הכנס את ששת הפלטות הנותרות בעמדות הגבוהות ביותר של הערימה הרביעית, ולאחר מכן סגור את דלת הקרוסלה. ודא כי תצוגת הצ'ילר מעידה על 14 °C. הפוך בעדינות ובצורה חוזרת את ערכות הסריקה שנבחרו במשך דקה אחת.לאחר מכן, פתחו את הפאנל הקדמי של מערכת הטיפול בנוזלים. פתחו את המבחנות והניחו אותן בנשא הקירור לפי פריסת 96 בארות סטנדרטית. עם הנחת כל מבחנה בנשא, הניחו את המכסה שלה על המגש באותה פריסת 96 בארות.בעת שימוש במערכת 1, כבלי התיוג מונחים על המגש בפריסת 96 בארות כדי לאפשר בדיקה הצלבית לכך שהמבחנות מסודרות כראוי. בצעו בדיקה הצלבית של מיקומי המבחנות ולאחר מכן ודאו שכל המבחנות מפולסות ומוצמדות לנשא. לאחר מכן, סגרו את הפאנל הקדמי.בחלון ההפעלה (Startup) של תוכנת מערכת טיפול בנוזלים, בחר ב-Run Maintenance ופתח את תוכנית השטיפה (Flushing). הפעל את התוכנית כדי לשטוף את ה-20% ethanol מהמערכת ולנקות את החלקים החיצוניים של קצות הפיפטיות (dispensing tips). עם סיום השטיפה, לחץ על Cancel כדי לחזור לתפריט ההפעלה.בחר ב-Run An Existing Process ולחץ על Start Your Selection. פתח את תוכנית חלוקת ה-MRC Kit. במסך התצורה (Configuration), הזן 18" עבור Instances והפעל את התוכנית. עקוב אחר המערכת בזמן שארבע הפלטות הראשונות מסומנות, ממולאות ונאטמות.אין להשאיר את המערכת ללא השגחה עד להשלמת ההכנה של ארבעת הלוחות הראשונים. לאחר שכל 72 הלוחות הוכנו והוחזרו למערך הסיבוב (carousel), העבירו את מחברי הצימוד ממכל המים דה-יוניים למכל ה-20% ethanol. הפעילו את תוכנית השטיפה הראשונית (startup flush) באמצעות אותו תהליך כפי שבוצע קודם לכן.כבה את הצ׳ילר והשליך את מבחנות ערכת הסריקה הריקות. הוצא בזהירות את 72 הפלטות שהוכנו מהקרוסלה. השלך פלטות שמולאו באופן שגוי או שנאטמו בצורה לקויה.יש לאחסן את הפלטות המוכנות לשימוש בטמפרטורה של 10 degrees Celsius. ראשית, וודאו כי הרובוטים של המערכת פועלים, מחלק הננוליטרים עבר אתחול והתוכנה שלו פתוחה, ומנהל השיטות של מטפל הנוזלים פתוח. הפעילו את נשא הקירור של המיקרוטיובים כ-15 דקות לפני תחילת התוכנית הראשית.הניחו פלטת בדיקה על נשאי ה-SBS הממונע של מכשיר איטום הפלטות. הפעילו את מכשיר איטום הפלטות וודאו שהפלטה נאטמה כראוי. בצעו את הבדיקה של מכשיר איטום הפלטות שלוש פעמים.לאחר מכן, הפעילו את מפזר הננו-ליטר כדי להניח טיפות של 100 nanoliter מתמיסת הבדיקה בתוך פלטת בדיקה. מוצג כאן מיקרוגרף של טיפה בנפח 100 nanoliter, שהופקה באמצעות מפזר הננו-ליטר, כאשר תמיסת הבדיקה הוכנה עם צבע אדום. סגרו את תוכנת מפזר הננו-ליטר והסירו את בלוק מחזיק הרצועות מהמשטח.בשלב הבא, מקמו במחזיק פלטות שתוכנן במיוחד פלטת גבישה של 96 בארות שמולאה מראש, הכוללת את התנאים עם הכמות היחסית הגבוהה ביותר של ריאגנטים נדיפים. הסירו את סרט הדבק מהפלטה. פתחו את הפאנל הקדמי של מערכת הטיפול בנוזלים, והניחו את הפלטה הפתוחה על משטח העבודה בחלקו האחורי של נשא ההחלקה הראשון.כסו את הפלטה עם מכסה אלומיניום של SBS. יישבו את המכסה לעבר הפינה השמאלית האחורית של הנשא על ידי הפעלת לחץ עדין על הפינה הנגדית של המכסה. בעת שימוש במערכת 2, יש לעבד תחילה ערכות סריקה המכילות כמויות משמעותיות של ריאגנטים נדיפים.פעולה זו מונעת היווצרות עיבוי על מובילי ה-SBS, דבר שעלול להשפיע על הטיפול האוטומטי במובילים או על איטום הפלטות. הסִירו את האיטום, טענו אל תוך הנשאי ההחלקה וכסו את 19 הפלטות הנותרות באופן דומה, תוך עבודה מהתנאים הנדיפים ביותר לפחות נדיפים. ברגע שנשאי הקירור של המיקרו-מבחנות מגיע ל-4 degrees Celsius, כפי שמוצג על ידי אור ירוק, הסירו את המכסה שלו.יש לחתוך את המכסה של מיקרו-מבחנה המכילה לפחות 440 µL של דגימת חלבון. ודאו כי אין קצף מעל המניסקוס של הדגימה, שכן הדבר יפריע למערכת גילוי הנוזלים. מקמו את המבחנה בעמדה 1 של נשא הקירור למיקרו-מבחנות.הנח פלטת PCR על משטח עבודת מערכת הטיפול בנוזלים לפני נשא מתאם הזזת הפלטות. לאחר מכן סגור את הפנל הקדמי. בממשק ניהול שיטות הטיפול בנוזלים, בחר Setup Plates.עקבו אחר האתחול של שתי המערכות ומלאו את פרמטרי ההרצה, כולל סוג הפלטה ומספר הטיפות לכל תנאי, גודל הטיפה, מיקום הפלטה הראשונה לעיבוד ומספר הפלטות. לחצו על No כאשר תישאלו אם תרצו עזרה בטעינת הסיפון. לאחר שווידאתם שאין מחזיקי קלפים ריקים, לחצו על OK. לאחר שווידאתם שיש מספיק טיפים להרצה, לחצו על OK. במידת הצורך, עדכנו את מערכת ניהול הטיפים ולחצו על OK. ודאו שמשטח השפוע של נבזר הננוליטרים פנוי מבלוק מחזיק הרצועות, ושהנשא נמצא בחלק האחורי של ערימות הטיפים בנפח 50 microliter, ושניתן לגשת למכסי ה-SBS מאלומיניום ללא חסימות.יש לוודא שכל שאר הרכיבים הנדרשים מוכנים ואז להתחיל בתהליך. יש לנטר את המערכת בזמן שהמטפטף הננו-ליטרי מניח את הטיפות בלוחית הראשונה, ולאחר מכן מכשיר איטום הלוחיות אוטם את הלוחית. אין להשאיר את המערכת ללא השגחה עד להשלמת ההכנה של הלוחית הראשונה.לאחר שכל 20 הפלטות הוכנו עם טיפות הגביש וחזרו באופן אוטומטי למגשים הנחליים, פתח את הפאנל הקדמי והוצא בעדינות את הפלטות. ודא שהפלטות אטומות כראוי לפני אחסונן לצורך הגבשת. נקה את מכסי ה-SBS עם תמיסת ethanol 20% לפני העמדתם במחסנית בצד שמאל של מערכת הטיפול בנוזלים לצורך אחסון.יש להשליך את פלטת ה-PCR ואת המיקרוטובוס. יש לכבות את נשא הקירור של המיקרוטובוסים ולניגוב את העיבוי. יש להניח נייר סופג על פני השטח של המקרר כדי לספוג עיבוי נוסף.לאחר מכן החליפו את כיסוי הנשא וסגרו את הפאנל הקדמי. OmpF ו-MreB נסרקו בתחילה באמצעות פרוטוקולים אוטומטיים מלאים אלה. גבישי OmpF באיכות מספקת לעקיפת קרני X נמצאו בבאר A4 של פלטת LMB 7.גבישים של MreB באיכות דיפרקציה נמצאו בבאר D12 של פלטת LMB 20. אחסון פלטות טרום-הזנה בטמפרטורה של 10 degrees Celsius הוא פשרה כדי למנוע הקפאה ואחסון ב-4 degrees, אשר עלולים לגרום להידרדרות של תנאי הגביש והבעיות הקשורות למעבדה. כאשר הפלטות מאוחסנות בדרך זו, ניתן להשתמש בהן תוך ארבעה עד חמישה חודשים.בין 4,000 ל-8,000 מצעי LMB מיוצרים מדי שנה באמצעות System 1 ומשמשים לאחר מכן לסריקה ראשונית. יש לבצע אופטימיזציה שונה לפרוטוקולים כאשר קצב התחלופה הצפוי נמוך בהרבה. כל מערך מצעי ה-pre-fuel שלנו משמש בדרך כלל כסריקה ראשונית נרחבת עבור דגימה חדשה.עם זאת, ניתן לבחור פחות פלטות בהתאם לדרישות דגימה ספציפיות מאוד. לאחר הכנת הטיפות, הפלטות מאוחסנות על מדפים בעלי רעידות נמוכות, כאשר הטמפרטורה נשמרת בבקרה הדוקה ב-4 או 18 degrees Celsius. הניסויים מוערכים באמצעות מיקרוסקופים בעלי מקור אור גליגולי.לאחר חקירה קפדנית של מהות הגבישים, ניתן לנתח תכונות ודמיון בין תנאים שונים באמצעות כלים מבוססי רשת כגון מאגרי המידע LMB או C6 Screen. ייתכן שעדיין יהיה צורך באופטימיזציה עוקבת של תנאי הגביש. פרוטוקולים אוטומטיים נוספים, הכוללים את שיטות 4-הפינות (4-corner methods) וסריקת תוספים, מתוארים במאמר שלנו.

automated-protocols-for-macromolecular-crystallization-at-mrc

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

מבנה 3-D של מולקולה מספק הבנה ייחודית של כמה פונקציות מולקולה. השיטה העיקרית לקביעת המבנה ברזולוציה כמעט אטומי הוא רנטגן קריסטלוגרפיה. כאן, אנו להדגים את השיטות הקיימות לקבלת גבישים תלת ממדי של מקרומולקולה נתון זה מתאים לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה בקרני רנטגן.

חלבון התגבשות של קריסטלוגרפיה רנטגן

במסמך מתואר גישה רובוטית להתגבשות תפוקה גבוהה של חלבונים בממברנה בmesophases lipidic לשימוש בקביעת מבנה באמצעות קריסטלוגרפיה macromolecular ה-X. שלושה רובוטים המסוגל להתמודד mesophase הצמיג ודביק חלבון העמוס האינטגרלי לשיטה הם הציגו.

שימוש ברובוט להתגבשות תפוקה גבוהה של חלבונים בממברנה בMesophases Lipidic

כאן אנו מתארים שיטה כללית להקרנת מטריצת microseed אקראית. טכניקה זו מוצגת להגדיל באופן משמעותי את שיעור ההצלחה של ניסויי הקרנת התגבשות חלבון, להפחית את הצורך באופטימיזציה, ולספק אספקה ​​אמינה של גבישים לאיסוף נתונים וניסויים יגנד שרייה.

שיפור שיעור ההצלחה של התגבשות חלבון על ידי Microseed מטריקס אקראי הקרנה

כאן, אנו נתאר כיצד להשתמש את הסינון האוטומטי ואת אפשרויות של איסוף נתונים זמינים ב beamlines סינכרוטרון מסוימים. מדענים לשלוח דוגמאות cryocooled סינכרוטרון, ואת המאפיינים עקיפה מוקרנים, ערכות הנתונים נאספים וכוח עיבוד ומתבצע, במידת האפשר, פתרון מבנה — כל זאת ללא התערבות אנושית.

איסוף נתונים מקריסטלים של מקרומולקולות ביולוגיות ואפיון עצמאית לחלוטין

מחזיק לדוגמה הרומן לקריסטלוגרפיה macromolecular רנטגן יחד עם פרוטוקול טיפול מתאים מוצג. המערכת מאפשרת צמיחה גביש, הטבילה גביש באוסף נתונים עקיפה באתרו בשניהם, הסביבה ואת הטמפרטורה הקריוגני ללא צורך של כל מניפולציה גביש או הרכבה.

מחזיק מדגם All-in-one עבור קריסטלוגרפיה Macromolecular X-ray עם פיזור רקע מינימלי

מחקרים מבניים של ביומקרומולקולים על ידי קריסטלוגרפיה דורשים גבישים באיכות גבוהה. כאן אנו מדגימים פרוטוקול שיכול לשמש את OptiCrys (מכשיר אוטומטי לחלוטין שפותח במעבדה שלנו) ו/או כפתורי מיקרו-דיאליזה לגידול גבישים גדולים ואיכותיים המבוססים על ידע בדיאגרמת שלב ההתגבשות.

אופטימיזציה של צמיחת קריסטל עבור קריסטלוגרפיה מקרומולקולרית נויטרון

יחס אות לרעש של נתונים הוא אחד השיקולים החשובים ביותר בביצוע מדידות עקיפה של קרני רנטגן ממיקרו-קריסטלים. קו הקרן VMXm מספק סביבה עם רעש נמוך ומיקרואורגניזם לניסויים כאלה. כאן, אנו מתארים שיטות הכנה לדוגמה עבור microcrystals הרכבה וקירור עבור VMXm וקווי קרן קריסטלוגרפיה מיקרומוקולריים אחרים.

צינור הכנה לדוגמה עבור מיקרוקריסטלים בקו הקרן VMXm

כאן, אנו מתארים כיצד להשתמש בצינורות הקריסטלוגרפיה המקרומולקולרית האוטומטית לניתוח מורכב של חלבון למבנה, ניתוח מורכב מהיר של חלבון ליגנד והקרנת שברים בקנה מידה גדול המבוססת על טכנולוגיית CrystalDirect במעבדת HTX ב- EMBL Grenoble.

צינורות הקריסטלוגרפיה האוטומטית במתקן EMBL HTX בגרנובל

פרוטוקול זה מפרט סינון התגבשות בתפוקה גבוהה, החל מהכנת 1,536 לוחות מיקרו-אסאי ועד לסוף חלון זמן ניסיוני של 6 שבועות. פרטים כלולים על הגדרת הדגימה, ההדמיה המתקבלת וכיצד משתמשים יכולים לבצע ניתוחים באמצעות ממשק משתמש גרפי התומך בבינה מלאכותית כדי לזהות במהירות וביעילות תנאי התגבשות מקרומולקולרית.

סינון בתפוקה גבוהה להשגת פגיעות קריסטליות לקריסטלוגרפיה של חלבונים

אנו מציגים פרוטוקול להתגבשות חלבונים באמצעות מתקן ההתגבשות במתחם המחקר בהארוול ולאחר מכן באתרו איסוף נתונים קריסטלוגרפיים מקרני רנטגן מגבישים בתוך הלוחות בקריסטלוגרפיה מקרומולקולרית רב-תכליתית באתרו (VMXi) של דיאמונד. אנו מתארים דרישות לדוגמה, פרוטוקולי התגבשות והנחיות לאיסוף נתונים.

התגבשות ואיסוף נתונים באתרם של טמפרטורת החדר באמצעות מתקן ההתגבשות בהארוול וב-Beamline VMXi, Diamond Light Source

למד פרוטוקולים אוטומטיים להכנת גבישים איכותיים של מולקולות מקרומולקולריות באמצעות מערכות LMB. שיטה זו מאפשרת עד 1,920 ניסויים בננוליטר לחקר מבנים של חלבונים, DNA ו-RNA.

אוטומטית פרוטוקולים עבור התגבשות Macromolecular במעבדה MRC של הביולוגיה המולקולרית

גלה סרטונים נוספים