אוטומטית פרוטוקולים עבור התגבשות Macromolecular במעבדה MRC של הביולוגיה המולקולרית

המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר גבישים באיכות גבוהה מתנאי הקרנה ראשוניים של התגבשות. ניתן להשתמש בגבישים כדי לחקור את המבנים של חלבונים, DNA, RNA והקומפלקסים שלהם. משהו במבנים מקרומולקולריים נעשה מאתגר יותר ויותר.

ומתן מגוון רחב של תנאים התחלתיים מגדיל את התפוקה של גבישים שימושיים, תוך הפחתת הצורך באופטימיזציה של דגימה וגבישים. שתי המערכות האוטומטיות לחלוטין, ה-LMB, מאפשרות הכנה של עד 1,920 ניסויי דיפוזיה של אדים בטיפות ננו-ליטר. לקיצור, ההנחה היא שהמשתמשים כבר מכירים את הפונקציות הבסיסיות והתחזוקה של מתקן הננו-ליטר, מדפסת הזרקת הדיו ואוטם לוחות ההדבקה.

לפני ביצוע ההליך, ודא שהרובוטים של המערכת מאותחלים ותוכנת הבקרה שלהם פתוחה. הפעל את הצ'ילר של מנשא קירור הצינור, כ-30 דקות לפני תחילת התוכנית הראשית. הנח לוחית בדיקה על מנשא ה-SBS הממונע של אוטם הצלחות.

הפעל את אוטם הצלחות ובדוק שהסרט מוחל כהלכה. חזור על בדיקה זו פעמיים נוספות כדי לוודא שאוטם הצלחות מוכן. לאחר מכן הוסף 20 ליטר מים נטולי יונים למיכל הראשי של המטפל בנוזלים.

נתק את תוספות הצימוד מהמיכל הקטן יותר של תמיסת שטיפת אתנול 20%, וחבר את התוספות למיכל הראשי. הזן את שם המסך המתאים במסך המגע של מדפסת הזרקת הדיו. לאחר מכן פתח וסגור את דלת הקרוסלה כדי להפעיל את סיבוב הקרוסלה.

פתח את הדלת כאשר הערימה הראשונה מציגה את עצמה. טען את הערימה הראשונה במלואה עם 22 לוחות התגבשות, כל אחד עם עמוד אחד פונה החוצה. טען את שתי הערימות הבאות במלואן באותו אופן.

טען את ששת הלוחות הנותרים במיקומים הגבוהים ביותר של הערימה הרביעית, ולאחר מכן סגור את דלת הקרוסלה. ודא שתצוגת הצ'ילר מציינת 14 מעלות צלזיוס. הפוך בעדינות ושוב ושוב את ערכות ההקרנה שנבחרו למשך דקה אחת.

לאחר מכן, פתח את הפאנל הקדמי של המטפל בנוזלים. פתח את הצינורות והנח אותם במנשא הקירור בפריסה הסטנדרטית של 96 בארות. עם הנחת כל צינור במנשא, הנח את המכסה שלו על המגש באותה פריסה של 96 בארות.

בעת שימוש במערכת 1, מובילי התווית ממוקמים על המגש בפריסה של 96 בארות כדי לאפשר בדיקה צולבת שהצינורות מסודרים כהלכה. בדוק את מיקומי הצינור ולאחר מכן ודא שכל הצינורות מפולסים ומיושבים במנשא. ואז סגור את הלוח הקדמי.

בחלון ההפעלה של תוכנת הטיפול בנוזלים, בחר הפעל תחזוקה ופתח את תוכנית השטיפה. הפעל את התוכנית כדי לשטוף את האתנול של 20% מהמערכת ולשטוף את החלק החיצוני של קצות חלוקת הנוזלים. לאחר השלמת הניקוי, לחץ על ביטול כדי לחזור לאתחול.

בחרו 'הפעל תהליך קיים' ולחצו על 'התחל את הבחירה'. פתח את תוכנית החלוקה של ערכת MRC. מלא 18 אינץ' עבור מופעים במסך התצורה והפעל את התוכנית, עקוב אחר המערכת כאשר ארבע הלוחות הראשונים מסומנים, ממולאים ואטומים.

אל תשאיר את המערכת ללא השגחה עד להשלמת הכנת ארבע הצלחות הראשונות. לאחר שכל 72 הצלחות הוכנו והוחזרו לקרוסלה, העבירו את תוספות הצימוד ממיכל המים נטול היונים למיכל האתנול של 20%. הפעל את תוכנית שטיפת האתחול באותו תהליך כמו קודם.

כבה את הצ'ילר והשליך את צינורות ערכת ההקרנה הריקים. הסר בזהירות את 72 הצלחות המוכנות מהקרוסלה. השלך צלחות מלאות או אטומות בצורה גרועה.

אחסן את הצלחות המוכנות לשימוש בחום של 10 מעלות צלזיוס. ראשית ודא שהרובוטים של המערכת פועלים, מתקן הננוליטר מאותחל כשהתוכנה שלו פתוחה, ומנהל השיטות של המטפל בנוזלים פתוח. הפעל את מנשא הקירור של המיקרו-צינור כרבע שעה לפני תחילת התוכנית הראשית.

הנח לוחית בדיקה על מנשא ה-SBS הממונע של אוטם הצלחות. הפעל את אוטם הצלחות וודא שהצלחת אטומה כהלכה. בדוק את אוטם הצלחות שלוש פעמים.

לאחר מכן הפעל את מתקן הננוליטר כדי להציב טיפות של 100 ננוליטר של תמיסת בדיקה בצלחת בדיקה. מוצג כאן מיקרוגרף אור של טיפה של 100 ננו-ליטר, המיוצרת על ידי מתקן הננו-ליטר, כאשר תמיסת הבדיקה עשויה מצבע אדום. סגור את תוכנת מתקן הננוליטר והסר את בלוק מחזיק הרצועה מהסיפון.

לאחר מכן, מוגדר במחזיק צלחת מעוצב בהתאמה אישית, צלחת התגבשות מלאה מראש של 96 בארות עם הכמות היחסית הגבוהה ביותר של ריאגנטים נדיפים בתנאיה. הסר את סרט הדבק מהצלחת. פתח את הפאנל הקדמי של המטפל בנוזלים, והנח את הצלחת הלא אטומה על הסיפון בחלק האחורי של מנשא ההזזה הראשון.

מכסים את הצלחת במכסה אלומיניום SBS. הנח את המכסה לכיוון הפינה השמאלית האחורית של המנשא על ידי הפעלת לחץ עדין על הפינה הנגדית של המכסה. בעת שימוש במערכת 2, יש לעבד תחילה ערכות סינון עם כמויות משמעותיות של ריאגנטים נדיפים.

זה מונע היווצרות עיבוי על מוליכי SBS, מה שעלול להשפיע על מסירה אוטומטית של המוליכים או איטום הצלחת. פתחו את האטם, העמיסו על מנשאי ההזזה וכסו את 19 הלוחות הנותרים באותו אופן, עובדים מהתנאים הנדיפים. ברגע שמנשא הקירור של המיקרו-צינור נמצא ב-4 מעלות צלזיוס, כפי שמצוין באור ירוק, הסר את המכסה שלו.

חותכים את המכסה של מיקרו-צינור המכיל לפחות 440 מיקרוליטר של דגימת חלבון. ודא שלדוגמה אין קצף מעל המניסקוס, מכיוון שהדבר יפריע למערכת זיהוי הנוזלים. הנח את הצינור במצב 1 של מנשא הקירור של המיקרו-צינור.

הנח לוחית PCR על סיפון המטפל בנוזלים מול מנשא המתאם הנע של הצלחת. ואז סגור את הלוח הקדמי. בממשק ניהול שיטת המטפל בנוזלים, בחר Setup Plates.

עקוב אחר האתחול של שתי המערכות ומלא את פרמטרי ההפעלה, כולל סוג הצלחת ומספר הטיפות לכל מצב, גודל הטיפה, מיקום הצלחת הראשונה לעיבוד ומספר הלוחות. לחץ על לא כשתישאל אם אתה מעוניין בעזרה בטעינת החפיסה. לאחר שווידאת שאין מדפי טיפים ריקים, לחץ על אישור. לאחר שווידאתם שיש מספיק עצות לריצה, לחצו על אישור. במידת הצורך, עדכן את מערכת ניהול הטיפים ולחץ על OK. ודא שסיפון מתקן הננוליטר נקי מבלוק מחזיק הרצועה, ושהמנשא נמצא בחלק האחורי של ערימות קצות המיקרוליטר של 50 מיקרוליטר, נקיים ממכסי האלומיניום SBS.

בדוק שוב שכל שאר הרכיבים הנדרשים מוכנים ולאחר מכן התחל בתהליך. עקוב אחר המערכת כאשר מתקן הננוליטר מגדיר את הטיפות בצלחת הראשונה, ואוטם הצלחות אוטם את הצלחת לאחר מכן. אל תשאיר את המערכת ללא השגחה עד להשלמת הכנת הצלחת הראשונה.

לאחר שכל 20 הצלחות הוכנו עם טיפות התגבשות וחזרו אוטומטית למנשאי ההזזה, פתח את הפאנל הקדמי והסר בעדינות את הלוחות. בדוק שהלוחות אטומים כהלכה לפני אחסונם להתגבשות. נקו את מכסי ה-SBS עם תמיסת אתנול 20% לפני ערימתם בצד שמאל של המטפל בנוזלים לאחסון.

השלך את לוחית ה-PCR ואת המיקרו-צינור. כבה את מנשא הקירור של המיקרו-צינור ונגב את העיבוי. השאירו מגבת נייר על גבי המשטח הקריר יותר כדי לספוג עיבוי נוסף.

לאחר מכן החזר את מכסה המנשא למקומו וסגור את הפאנל הקדמי. OmpF ו-MreB נבדקו בתחילה באמצעות פרוטוקולים אוטומטיים לחלוטין אלה. גבישי OmpF באיכות מספקת לעקיפה של קרני רנטגן נמצאו בבאר A4 של לוחית LMB 7.

גבישים באיכות עקיפה של MreB נמצאו בבאר D12 של לוחית LMB 20. אחסון צלחות קדם דלק ב-10 מעלות צלזיוס מהווה פשרה למניעת הקפאה ואחסון ב-4 מעלות, מה שעלול לגרום להידרדרות בתנאי ההתגבשות ולבעיות הקשורות לעיבוי. כאשר מאוחסנים בדרך זו, ניתן להשתמש בצלחות תוך ארבעה עד חמישה חודשים.

בין 4 ל-8, 000 לוחות LMB מיוצרים מדי שנה עם מערכת 1 ומשמשים מאוחר יותר להקרנה ראשונית. יש לבצע אופטימיזציה שונה של הפרוטוקולים כאשר התחלופה הצפויה נמוכה בהרבה. כל סט צלחות הדלק שלנו משמש בדרך כלל כמסך ראשוני גדול לדגימה חדשה.

עם זאת, ניתן לבחור פחות צלחות לדרישות מדגם ספציפיות בהרבה. לאחר הכנת הטיפות, הצלחות מאוחסנות על מדפים בעלי רטט נמוך כאשר הטמפרטורה נשלטת היטב על 4 או 18 מעלות צלזיוס. הניסויים מוערכים באמצעות מיקרוסקופים של מקור אור גלילה.

לאחר חקירה מדוקדקת של אופי הגבישים, ניתן לנתח תכונות ודמיון בין תנאים באמצעות כלים מבוססי אינטרנט כגון מסדי הנתונים LMB או C6 Screen. ייתכן שעדיין יהיה צורך באופטימיזציה של תנאי ההתגבשות לאחר מכן. פרוטוקולים אוטומטיים נוספים, עם שיטות 4 הפינות וסינון תוספים מתוארים בכתב היד שלנו.