Name: השימוש Immunolabeling כדי לנתח Microtubules יציב, דינמי, המתהווה של העובר דג זברה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: למד שיטות אימונולייבלינג לניתוח מיקרוטובולים יציבים, דינמיים ומתהווים במוח המתפתח של דג זברה. פרוטוקולים אלה מאפשרים זיהוי וכימות מדויק של אוכלוסיות מיקרוטובולים שונות במקומן הטבעי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מיקרוסקופ קונפוקלי נרכש בכספים מ ארה ב הלאומית למדע קרן (NSF), גרנט #DBI-0722569. המחקר נתמך על ידי ארה ב הלאומית מכוני בריאות/לאומי המכון של גנרל רפואי למדעים (NIH/NIGMS) גרנט #GM085290, ארה ב המחלקה של ההגנה (DOD) גרנט #W81XWH-16-1-0466 מוענק ברוסטר חומרי גלם. אי חיוניים נתמך על ידי מענק כדי UMBC הווארד יוז מכון רפואי דרך המכללה מראש לתואר ראשון במדעי החינוך תוכנית, להעניק #52008090. פ מ בראון נתמכה על ידי ארצות הברית מחלקת של החינוך GAANN מלגת, מלגת בוגר מאירהוף ממומן על ידי מענק NIH/NIGMS #GM055036, Assistantship של מחקר שמומן על ידי משרד ההגנה האמריקאי גרנט #W81XWH-16-1-0466.

<ol><li>Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+ends%3A+a+dynamic+protein+network+controls+the+fate+of+microtubule+tips%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 309-322 (2008).</li>
<li>Conde, C., Cáceres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+assembly%2C+organization+and+dynamics+in+axons+and+dendrites%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites.</a> Nat Rev Neurosci. 10 (5), 319-332 (2009).</li>
<li>Kaverina, I., Straube, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cell+migration+by+dynamic+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of cell migration by dynamic microtubules.</a> Semin Cell Dev Biol. 22 (9), 968-974 (2011).</li>
<li>Kollman, J. M., Merdes, A., Mourey, L., Agard, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+nucleation+by+%CE%B3-tubulin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule nucleation by γ-tubulin complexes.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (11), 709-721 (2011).</li>
<li>Howard, J., Hyman, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth%2C+fluctuation+and+switching+at+microtubule+plus+ends%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Growth, fluctuation and switching at microtubule plus ends.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (8), 569-574 (2009).</li>
<li>Schulze, E., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+and+stable+populations+of+microtubules+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic and stable populations of microtubules in cells.</a> J Cell Biol. 104 (2), 277-288 (1987).</li>
<li>Gundersen, G. G., Kalnoski, M. H., Bulinski, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+populations+of+microtubules%3A+Tyrosinated+and+nontyrosinated+alpha+tubulin+are+distributed+differently+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct populations of microtubules: Tyrosinated and nontyrosinated alpha tubulin are distributed differently in vivo.</a> Cell. 38 (3), 779-789 (1984).</li>
<li>Li, R., Gundersen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+polymer+polarity%3A+how+the+cytoskeleton+builds+a+polarized+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Beyond polymer polarity: how the cytoskeleton builds a polarized cell.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (11), 860-873 (2008).</li>
<li>Asakawa, K., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+zebrafish+for+monitoring+in+vivo+microtubule+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn+Off+Publ+Am+Assoc+Anat%22%5BJournal%5D)">A transgenic zebrafish for monitoring in vivo microtubule structures.</a> Dev Dyn Off Publ Am Assoc Anat. 239 (10), 2695-2699 (2010).</li>
<li>Wühr, M., Tan, E. S., Parker, S. K., Detrich, H. W., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+cleavage+plane+determination+in+early+amphibian+and+fish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol+CB%22%5BJournal%5D)">A model for cleavage plane determination in early amphibian and fish embryos.</a> Curr Biol CB. 20 (22), 2040-2045 (2010).</li>
<li>Tran, L. D., Hino, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+microtubules+at+the+vegetal+cortex+predict+the+embryonic+axis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dynamic microtubules at the vegetal cortex predict the embryonic axis in zebrafish.</a> Development. 139 (19), 3644-3652 (2012).</li>
<li>Butler, R., Wood, J. D., Landers, J. A., Cunliffe, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+chemical+modulation+of+spastin-dependent+axon+outgrowth+in+zebrafish+embryos+indicates+a+role+for+impaired+microtubule+dynamics+in+hereditary+spastic+paraplegia%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Genetic and chemical modulation of spastin-dependent axon outgrowth in zebrafish embryos indicates a role for impaired microtubule dynamics in hereditary spastic paraplegia.</a> Dis Model Mech. 3 (11-12), 743-751 (2010).</li>
<li>Yoo, S. K., Lam, P. -Y., Eichelberg, M. R., Zasadil, L., Bement, W. M., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microtubules+in+neutrophil+polarity+and+migration+in+live+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish.</a> J Cell Sci. 125 (23), 5702-5710 (2012).</li>
<li>Andersen, E. F., Halloran, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome+movements+in+vivo+correlate+with+specific+neurite+formation+downstream+of+LIM+homeodomain+transcription+factor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Centrosome movements in vivo correlate with specific neurite formation downstream of LIM homeodomain transcription factor activity.</a> Development. 139 (19), 3590-3599 (2012).</li>
<li>Lee, S. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+regulation+of+the+microtubule+and+actin+cytoskeleton+in+zebrafish+epiboly%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Dynamic regulation of the microtubule and actin cytoskeleton in zebrafish epiboly.</a> Biochem Biophys Res Commun. 452 (1), 1-7 (2014).</li>
<li>Bulinski, J. C., Gundersen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilization+and+post-translational+modification+of+microtubules+during+cellular+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Stabilization and post-translational modification of microtubules during cellular morphogenesis.</a> BioEssays. 13 (6), 285-293 (1991).</li>
<li>Magiera, M. M., Janke, C. Chapter 16 - Investigating Tubulin Posttranslational Modifications with Specific Antibodies. Methods Cell Biol. 115, 247-267 (2013).</li>
<li>Hong, E., Jayachandran, P., Brewster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+polarity+protein+Pard3+is+required+for+centrosome+positioning+during+neurulation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The polarity protein Pard3 is required for centrosome positioning during neurulation.</a> Dev Biol. 341 (2), 335-345 (2010).</li>
<li>Westermann, S., Weber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications+regulate+microtubule+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications regulate microtubule function.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (12), 938-948 (2003).</li>
<li>Jayachandran, P., Olmo, V. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-associated+protein+1b+is+required+for+shaping+the+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Develop%22%5BJournal%5D)">Microtubule-associated protein 1b is required for shaping the neural tube.</a> Neural Develop. 11, 1(2016).</li>
<li>Nam, S. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Tau%2C+a+microtubule+associated+protein%2C+in+Drosophila+photoreceptor+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+N+Y+N+2000%22%5BJournal%5D)">Role of Tau, a microtubule associated protein, in Drosophila photoreceptor morphogenesis.</a> Genes N Y N 2000. 54 (11), 553-561 (2016).</li>
<li>Abal, M., Piel, M., Bouckson-Castaing, V., Mogensen, M., Sibarita, J. -B., Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+release+from+the+centrosome+in+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule release from the centrosome in migrating cells.</a> J Cell Biol. 159 (5), 731-737 (2002).</li>
<li>Delgehyr, N., Sillibourne, J., Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+nucleation+and+anchoring+at+the+centrosome+are+independent+processes+linked+by+ninein+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Microtubule nucleation and anchoring at the centrosome are independent processes linked by ninein function.</a> J Cell Sci. 118 (8), 1565-1575 (2005).</li>
<li>Manning, J. A., Lewis, M., Koblar, S. A., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+function+for+the+centrosomal+protein+NEDD1+in+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">An essential function for the centrosomal protein NEDD1 in zebrafish development.</a> Cell Death Differ. 17 (8), 1302-1314 (2010).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn+Off+Publ+Am+Assoc+Anat%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn Off Publ Am Assoc Anat. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Beck, A. P., Watt, R. M., Bonner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+Lateral+Mounting+of+Zebrafish+Embryos%3A+Analysis+of+Spinal+Cord+Development%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development.</a> JoVE J Vis Exp. (84), e50703(2014).</li>
<li>FÖldes-Papp, Z., Demel, U., Tilz, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+scanning+confocal+fluorescence+microscopy%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunopharmacol%22%5BJournal%5D)">Laser scanning confocal fluorescence microscopy: an overview.</a> Int Immunopharmacol. 3 (13-14), 1715-1729 (2003).</li>
<li>Ferreira, T., Rasband, W. S. ImageJ User Guide - IJ 1.46. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/">https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/</a> (2010).</li>
<li>Z-functions - ImageJ. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://imagej.net/Z-functions">https://imagej.net/Z-functions</a> (2017).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

כיום ישנן שיטות רבות הדמיה MT הדינמיקה של התפתחות מוקדמת של דג זברה, ועד הדמיה חיה של מולקולות מתויגות immunolabeling של קבוע רקמות11,12,13,14. למרות MTs בתא יחיד יכולה להתקיים במצבים דינמיים או יציבה, epithelialization הוא תהליך שבו MTs בהדרגה התייצבו לאורך זמן. באמצעות סמנים עבור MTs יציבה ודינמית מציע דרך להמחיש את התופעה. השיטה המוצגת כאן ממנף את העוצמה של תוכנת הדמיה תלת-ממדית כדי לכמת את ...

Microtubules (MTs) הם פולימרים של α - ו β-טובולין. זה להרכיב לתוך protofilaments ליניארית, כמה מהם לשלב כדי ליצור צינור חלול1,2. MTs הם מבנים מקוטב, עם בצמיחה מהירה פלוס מסתיים, הגדלים לאט מינוס מסתיים שמעוגנים את centrosome או אחרים ארגון microtubule center (MTOC)3. דה נובו היווצרות MT הוא שיזם התגרענות בγ-טובולין. הטבעת מורכבת (γ-TURC), אשר מספק תבנית עבור הרכבה MT4. בתא נתון כלשהו, שתי האוכלוסיות של MTs ניתן להבחין את הפניה הזאת מעל בקצב שונה. MTs דינמי לחקור את הסביבה התאית שלהם על ידי מיתוג בין שלבי צמיחה הצטמקות בתהליך המכונה יציבות דינאמית5. בניגוד MTs דינמי, MTs יציב שאינו גדל, יש מחצית חיים ארוך יותר מאשר MTs דינמי6.

עשורים של מחקר ב ביולוגיה של התא יש מספק מערך מתוחכם של כלים ללמוד MT מבנה ותפקוד וכתוצאה גוף גדול של ידע על אלה אלמנטים cytoskeletal. למשל, MTs לשחק תפקיד המרכזי ובשימור תא קוטביות, אשר לא רק לייחס קוטביות מהותי שלהם, אלא גם כלפי ההתפלגות subcellular דיפרנציאלית של יציבה לעומת דינמי MTs7, 8. לעומת זאת, הרבה פחות מובנת על אדריכלות MT ותפקוד בסביבות מורכבות יותר תלת-ממדיים (3-D), כגון העובר חוליות, בחלקו בשל האתגר של הדמיה של שלד התא MT ברזולוציה גבוהה. למרות מגבלה זו, הדור האחרון של GFP-הבעת הטרנסגניים קווים שהמדבקה MTs או ארעי ביטוי מתויג fluorescently MT סמני גדל ההבנה שלנו של השינויים הדינמיים MTs עוברים וסלולר שלהם, תפקיד התפתחותי העובר דג זברה. הרשת MT יכול לדימות הטרנסגניים שורות אילו טובולין מתבצע ישירות פולימרים9 או טובולין עם תוויות מסומנות באופן עקיף באמצעות חלבונים הקשורים MT Doublecortin-כמו-קינאז (Dclk) או Ensconsin (EMTB)10, 11. קווים אחרים (וגם בונה) נוצרו לאפשר הערכה של קוטביות מהותי MT על-ידי תיוג במיוחד הר plus מסתיים או centrosome-מעוגן מינוס מסתיים11,12,13, 14. הכוח של כלים אלה טמון ביכולת בחקר דינמיקה MT ב live, פיתוח אורגניזמים. מחקרים גילו, לדוגמה, התפלגות מרחבית ודינאמי של MTs אוכלוסיות תאים מסוים, כיוון mitotic spindles ברקמות שעברו מורפוגנזה (אינדיקטור של המטוס של חלוקת התא), את הקוטביות של הפולימר MT ככל שהוא מתייחס לתהליכים כגון התארכות התא, הגירה, קצב הצמיחה MT נקבע על ידי שביט מהירות9,13,15. המגבלה של כלים אלה היא כי הם לא ברצון להפלות בין אוכלוסיות MT יציבה ודינמית.

ציור מן הספרות ביולוגיה התא עשיר, שיטות immunolabeling תמונה יציבה ודינמית MTs ב העובר דג זברה מתוארים כאן, אשר הם משלימים על השימוש הטרנסגניים קווים. השימוש הנרחב של כזה שיטות immunolabeling דג זברה יש כבר הקשו במידת מה על ידי הקושי בשימור תקינות MT במהלך ההליך קיבעון. פרוטוקול 1 מתאר שיטה ממוטב עבור סך immunolabeling, דינמי, וחצו MTs יציב ב סעיפים hindbrain המתפתח דג זברה. יתרה מזאת, שיטה פשוטה באמצעות מסחרית התוכנה הזמין מתואר לכמת אוכלוסיות אלה MT. MTs יציב נבדלים MTs דינמי המבוסס על מספר שינויים post-translational של α-טובולין, כגון acetylation ו- detyrosination, אשר מצטברים MTs יציבה לאורך זמן16,17. העובר דג זברה, acetylation חל על MTs ciliary, עצב אך לא על יציבה לאטמוספרה MTs18, הגבלת את התועלת של סמן זה לתת-ערכה של MTs מיוצב. לעומת זאת, detyrosination מופיע כך שיתרחשו MTs יציבה כל העובר דג זברה18. שינוי post-translational זה חושף את חומצה גלוטמית carboxy-מסוף של α-טובולין (detyrosinated טובולין)18 , ניתן להבחין באמצעות אנטי-Glu-טובולין19. למרות detyrosination מעדיפים מתרחש MTs יציב, ראיות מציין את השינוי post-translational הוא תוצאה של, יותר מאשר גורם לחוסר יציבות MT16. האוכלוסייה MT הדדיים, המורכב MTs דינמי, מזוהה באמצעות נוגדן, אנטי-Tyr-טובולין, זה במיוחד מזהה את הצורה tyrosinated של α-טובולין19. בעקבות immunolabeling עם סמנים אלה קונאפוקלית הדמיה, ניתן לבצע ניתוח כמותי של MTs (אורך, מספר ושפע היחסי) באזורים מוגדרים של הצינור העצבי המתפתח. שיטה יעילה מסופק כאן לביצוע ניתוח זה באמצעות תוכנת עיבוד תמונה תלת-ממדית. בשיטה זו ניתן להחיל על שאלות בנוגע מורפוגנזה לבין הממסד או ההבשלה של התא קוטביות20. אכן, לפתח של מערכים מקוטב של MTs יציב מלווה אירועים התפתחותיים רבים, כולל מורפוגנזה קולט אור21, epithelialization של תאים בפיתוח שפופרת פגמים בתעלה18 ו האקסון היווצרות8.

פרוטוקול 2 מתאר ויוו עיבוד של assay ביולוגיה התא כדי לנתח MTs במהלך שלהם הרכבה שלב (התגרענות/anchorage וצמיחה)22,23. MTs המתהווה nucleated-centrosome, לאחר מכן מעוגנת תוספות subdistal של אמא צנטריול23. מתוארת שיטה לנתח nascent לצמיחה מחודשת MT בעקבות depolymerization. פרוטוקול זה מספק פרטים על הטיפול nocodazole depolymerize MTs, ההליך שטיפה סמים ואת תקופת ההחלמה שלאחר הטיפול. MT מחדש את הצמיחה מנוטר על מרווח קבועs שטיפה פוסט מאת immunolabeling עם סמנים עבור MTs הכולל (אנטי-β-טובולין) לצד סמני centrosome (אנטי-γ-טובולין) ואת גרעין (4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי)), על פי כללי בהליכים המתוארים תחת פרוטוקול 1. השלב depolymerization MT של פרוטוקול זה חיוני כפי שהיא מאפשרת הערכה של דה נובו MT צמיחה ולא סיומת של MTs שישנו. טכניקה זו ולכן היא נבדלת הליכים אחרים שפורסמו למדידת שיעורי צמיחה MT (בהעדר depolymerization) באמצעות סמן קצה פלוס כגון end מחייב חלבון 3 דבוקה חלבון פלואורסצנטי ירוק (EB3-GFP), כפי שמוצג טראן. et al., 201211. יתר על כן, וזמינותו זה שימושי במיוחד עבור ניתוח עוברי פגומים בהרכבה דה נובו MT, כגון המוטציות NEDD1 שדווחה בעבר שבו גיוס של γ-טובולין כדי centrosome פגום, וכתוצאה מכך לא שלם היווצרות שפופרת פגמים בתעלה, ליקויים עצביים24.

<table><tbody><tr><td>אגרוז</td><td></td><td></td><td>משמש לטיפול בפטרידיש.&nbsp; &nbsp; הכן 1% אגרוז על ידי חימום תמיסה של&nbsp; 1 גרם אגרוז ל-100 מ"ל 1X מדיום עוברי במיקרוגל עד לפולימר.&nbsp;</td></tr><tr><td>Kpipes</td><td>Sigma</td><td>P7643</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma</td><td>T3253-500G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>American Bioanalyticals</td><td>AB01424</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889-25G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M2670-500G</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר (BSA)</td><td>Fisher</td><td>BP1605</td><td></td></tr><tr><td>Triton-x</td><td>American Bioanalyticals</td><td>AB02025</td><td></td></tr><tr><td>הרכבה נגד דהייה בינוני</td><td>Invitrogen</td><td>P10144</td><td></td></tr><tr><td>עכבר anti-&beta;-tubulin</td><td>מחקרים התפתחותיים Hybridoma Bank</td><td>E7</td><td>1/200</td></tr><tr><td>ארנב anti-&gamma;-tubulin</td><td>Genetex</td><td>GTX113286</td><td>1/500</td></tr><tr><td>ארנב anti-&alpha;-tubulin</td><td>Genetex</td><td>GTX108784</td><td>1/1000*</td></tr><tr><td>ארנב anti-detyrosinated-tubulin</td><td>Millipore</td><td>AB3201</td><td>1/200-1/1000*&nbsp; נוגדן טיטראט עם שימוש ראשון באצווה חדשה.</td></tr><tr><td>ארנב נגד טירוזין-טובולין</td><td>Millipore</td><td>ABT171</td><td>1/500</td></tr><tr><td>עכבר נגד צנטרין</td><td>Millipore</td><td>04-1624</td><td>1/1000</td></tr><tr><td>עז 488 נגד ארנב</td><td>Thermofisher</td><td>A11008</td><td>1/500</td></tr><tr><td>עז 594 נגד ארנב</td><td>Thermofisher</td><td>A11012</td><td>1/500</td></tr><tr><td>עז 594 נגד עכבר</td><td>Thermofisher</td><td>A11005</td><td>1/500</td></tr><tr><td>עז 488 נגד עכבר</td><td>Thermofisher</td><td>A11001</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Vibratome</td><td>1500</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>מכשירים מדויקים בעולם</td><td>555227F</td><td></td></tr><tr><td>100 מ"מ צלחת פטרי</td><td>טיפול בתא</td><td>229693</td><td></td></tr><tr><td>35 מ"מ צלחת פטרי</td><td>טיפול בתא</td><td>229638</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינור בז</td><td>פישר</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>רשת ניילון ארוגה 70 אום</td><td>Amazon.com</td><td>B0043D1SZG&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>מיקרופיפטה</td><td>גילסון</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>פיפטת זכוכית</td><td>פישר</td><td>NC-999363-9</td><td></td></tr><tr><td>Amazon.com איטום אקווריום</td><td>, מאת MarineLand</td><td>אוטם סיליקון 1 אונקיה (צינור)&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>מעמד טבעת</td><td>פישר</td><td>14-675BO</td><td></td></tr><tr><td>צינורות PTFE Microbore, 0.022 אינץ' ID</td><td>Cole-Parmer</td><td>WU-06417-21</td><td></td></tr><tr><td>חימר דוגמנות</td><td>Amazon.com</td><td>Sargent Art 22-4000</td><td>כל חימר דוגמנות לא רעיל על בסיס שעווה או שמן יספיק</td></tr><tr><td>מהדק</td><td>פישר</td><td>02-215-466</td><td></td></tr><tr><td>מזרק 60 מ"ל</td><td>פישר</td><td>14-820-11</td><td></td></tr><tr><td>מדיום עוברי (E3)</td><td></td><td></td><td>34.8 גרם NaCl 1.6 גרם KCl 5.8 גרם CaCl2&middot; 2H2O 9.78 גרם MgCl2&middot; 6H2O להכנת ציר 60X, ממיסים את החומרים ב-H2O, לנפח סופי של 2 ליטר. חיטוי. להכנת 1X בינוני, יש לדלל 16.5 מ"ל ממלאי 60X ל-1 ליטר&nbsp;</td></tr><tr><td>תמיסת</td><td></td><td></td> חסימה <td>50 מ"ל כף-NP-40 2.5 מ"ל סרום עיזים רגיל 1 גרם BSA 625 ומיקרו; l Triton-X</td></tr><tr><td>TBS-NP-40 (pH 7.6)</td><td></td><td></td><td>155 מ"מ NaCl 10 מ"מ Tris HCl 0.1% NP-40</td></tr><tr><td>2x MAB (pH6.4)</td><td></td><td></td><td>160 מ"מ KPIPES 10 מ"מ EGTA 2 מ"מ MgCl2</td></tr><tr><td>תוכנה מסחרית לעיבוד תמונה תלת מימד</td><td>PerkinElmer</td><td>Volocity (V 6.2)</td><td></td></tr><tr><td>מחמם בלוק יבש&nbsp;</td><td>VWR</td><td>12621-108</td><td>משמש כפלטה חמה להמסת אגרוז בפרוטוקול 1.</td></tr><tr><td>ניתוח מיקרוסקופ</td><td>Leica</td><td>MZ12</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Leica</td><td>SP5</td><td></td></tr><tr><td>תבנית הטבעה שטוחה</td><td>emsdiasum.com</td><td>BEEM 70904-01</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת עיבוד תמונה נחלת הכלל</td><td>NIH</td><td>ImageJ (V 1.5)</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">* ההצלחה משתנה לפי מספר אצווה</td></tr></tbody></table>

השימוש immunolabeling כדי לנתח microtubules יציב, דינמי, המתהווה של העובר דג זברה

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Microtubules (MTs) הם דינמיים ושבירה במבנים מאתגר התמונה ויוו, בפרט העוברים בעלי. החוליות. שיטות Immunolabeling מתוארים כאן ולנתח אוכלוסיות נפרדות של MTs בצינור העצבי המתפתח של העובר דג זברה. כאשר המוקד הוא על רקמה עצבית, מתודולוגיה זו ישימה בהרחבה לרקמות אחרות. ההליכים ממוטבים מוקדם עד אמצע-somitogenesis-שלב עוברי (1 somite כדי 12 somites), אולם הם יכולים להיות מותאמים למגוון שלבים אחרים עם התאמות קלות יחסית. הפרוטוקול הראשון מספק שיטה להעריך את התפוצה המרחבית של MTs יציבה ודינמית ולבצע ניתוח כמותי של אוכלוסיות אלה עם תוכנות עיבוד תמונה. גישה זו משלימה הכלים הקיימים כדי התמונה microtubule dynamics והפצה בזמן אמת, באמצעות קווים הטרנסגניים או בביטוי ארעית של בונה מתויגות. ואכן, כלים כאלה הם מאוד שימושי, אולם הם אינם ברצון מבחינים בין MTs דינמית ויציבה. היכולת תמונה ולנתח אוכלוסיות נפרדות microtubule אלה יש השלכות חשובות על מנגנונים ההבנה שבבסיס תא קיטוב, מורפוגנזה. פרוטוקול השני מתאר טכניקה כדי לנתח nascent MTs במיוחד. זו מושגת על-ידי לכידתו של מאפייני הצמיחה דה נובו MTs לאורך זמן, בעקבות microtubule depolymerization עם nocodazole הסמים ותקופת ההתאוששות לאחר שטיפה סמים. טכניקה זו לא הוחל עדיין במחקר של MTs בדג זברה עוברי, אבל וזמינותו יקר על חקירת הפונקציה ויוו של חלבונים מעורבים microtubule הרכבה.

ניתוח של MTs יציבה ודינמית באמצעות immunolabeling פרוטוקול 1, ההתפלגות של MT תת האוכלוסיות במהלך המוקדמות (קיל עצבית) ו- (מוט עצבית) מאוחר, שלבי הפיתוח שפופרת פגמים בתעלה מתגלה, באמצעות Glu-טובולין טובולין Tyr כסמני בשביל יציבה ודינמית MTs, בהתאמה. MTs דינמי שולטים ב- hindbrain בשלב קיל עצבית (4-5 somites) (איור 2א-ד). כפי בשדרית מתפתח המטה עצבית (11-12 somites), שלב של epithelialization משופר, MTs איכותית...

Immunolabeling שיטות כדי לנתח אוכלוסיות נפרדות של microtubules במוח דג זברה המתפתח מתוארים כאן, אשר חלים באופן נרחב לרקמות אחרות. הפרוטוקול הראשון מתאר שיטה ממוטב עבור immunolabeling microtubules יציבה ודינמית. פרוטוקול השני מספק שיטה כדי התמונה ולכמת nascent microtubules במיוחד.

השימוש Immunolabeling כדי לנתח Microtubules יציב, דינמי, המתהווה של העובר דג זברה

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

המטרה הכללית של הליכי סימון אלו היא לדמיין ולכמת מיקרוטובוליים יציבים, דינמיים וראשוניים בעובר דג זבב בשלבי התפתחות. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הנוירוביולוגיה ההתפתחותית, כגון האופן שבו מיקרוטובוליים תורמים לביסוס הקוטביות של התא. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מייעלת את הגילוי והכימות של אוכלוסיות נבדלות של מיקרוטובוליים in situ.בדרך כלל, אנשים שאינם מורגלים בשיטה זו יתקלו בקשיים בשל המורכבות של שמירה על שלמות המיקרוטובולים. לאחר הסרת הכלור מעוברים של דגי זברה בשלבים שונים בהתאם לפרוטוקול הכתוב, העבירו אותם למבחנות צנטריפוגה בנפח 1.5 milliliter, תוך הסרת כמה שיותר מהתווך. הוסיפו one milliliter של 4%PFA בבופר להרכבת מיקרוטובולים (MAB), כדי לקבע את העוברים בטמפרטורה של 28.5 degree celsius למשך חמש דקות.לאחר מכן, השתמשו בפיפטה כדי לשאוב את המקבע והחליפו אותו ב-1 ml של מקבע טרי. הדגרימו את הדגימות על רוקר בטמפרטורת החדר למשך שלוש שעות. שאבו את המקבע והוסיפו 1 ml של בופר TBS NP-40.נער את העובריים בעדינות על מכשיר rocker למשך חמש דקות. חזור על השטיפה פעמיים נוספות. לאחר מכן, לאחר החלפת התמיסה ב-1 mL של TBS NP-40 טרי, אחסן את העובריים בטמפרטורה של 4 °C למשך לא יותר משבעה ימים.לאחר הסרת החלמון והטמעת העוברים באגרוז בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הניחו את כלי החיתוך הממולא ב-TBS NP-40, והשתמשו בויברטום (vibratome) כדי להפיק חתכים של 40 micrometers מהציר הגבוה ביותר של העוברים המוטמעים באגרוז. השתמשו בפינצטה עדינה כדי להעביר את החתכים הרלוונטיים ל-500 microliters של TBS NP-40 בפלטה בעלת 24 בארות. הסירו את הבאפר והוסיפו 500 microliters של תמיסת חסימה.לאחר מכן, נערו את הפרוסות בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת לפחות. החליפו את תמיסת החסמה ב-300 microliters של נוגדנים ראשוניים המדוללים בבופר חסמה, והדגירו את הדגימות על נערור בטמפרטורה של ארבעה degree celsius למשך 36 עד 72 שעות. השתמשו ב-600 microliters של TBS NP-40 כדי לשטוף את הדגימות פעמיים.הנח אותם על נדנדה (rocker) בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות כל אחד. הוסף לחתכים 300 µL של נוגדנים משניים המשורשריים לפלואורופור, המדוללים בבופר חסימה, והדגר אותם בחושך על נדנדה בטמפרטורה של 4 °C למשך 16 עד 24 שעות. לאחר מכן, שטוף את הדגימות פעמיים כפי שהודגם כעת.לאחר מכן, יש להוסיף 500 µL של תמיסת DAPI לעוברים ולהדגיר אותם בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, יש להשתמש ב-TBS NP-40 כדי לשטוף את הדגימות שלוש פעמים בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר השטיפות, יש להניח טיפה של תמיסת קיבוע (mounting medium) עם חומר למניעת דהייה (anti-fade agent) במרכז של סלייד נקי מאבק.השתמשו בפינצטה עדינה כדי להעביר את הנתחים לטיפת חומר ההטמעה. לאחר מכן, הניחו זכוכית כיסוי נקייה מאבק מעל הדגימה. אחסנו את הפלטות עטופות בנייר אלומיניום, במקום יבש, חשוך וקריר, עד לביצוע הדמיה.בהתאם לפרטים המפורטים בפרוטוקול הכתוב, רכשו תמונות קונפוקליות ב-z stack עם הגדרות ערוץ המתאימות לפלואורופורים של הנוגדנים המשניים שנבחרו, ושמרו את קבצי התמונה. באמצעות תוכנה לניתוח תלת-ממדי, כגון Image J, פתחו את עותק קובץ הנתונים. צרו תמונה ממוזגת על ידי הלבשת הערוצים הרלוונטיים דרך בחירה ב-image, color, merge channels.בחרו את הערוצים 594 ננומטר, 488 ננומטר ו-DAPI כדי שייצבעו בצבעי אדום, ירוק וכחול בהתאמה. סמנו את הבחירה, צרו תמונה מורכבת (composite) ובחרו באישור (okay). הדמיפו את ה-z stack הממוזג כתמונה דו-ממדית (2D) אחת על ידי ביצוע השלכה בעוצמה מקסימלית (maximum intensity projection) של ה-z stack באמצעות images, stack, z project.הזינו את מיקומי ההתחלה והסיום של מישורי ה-z הטובים ביותר הפנימיים כפרוסה התחילה (start slide) ופרוסת סיום (stop slice), בהתאמה. בחרו ב-max intensity כסוג ההקרנה (projection type) ולחצו על אישור. בתוכנת הניתוח התלת-ממדית, בחרו ב-"create library" והקלידו שם תיאורי לספריית התמונות.לחצו, צרו וגררו קבצי תמונות גולמיים אל הספרייה. לאחר מכן, בחרו קובץ לניתוח. לאחר מכן, מתוך תפריט התצוגה, בחרו במיקוד מורחב (extended focus) כדי להציג את תמונת המיזוג של הערוצים בחלון הראשי.בחרו את כלי ה-ROI של יד חופשית (free hand ROI) ותחמו את אזור העניין המיועד לניתוח. בחרו בלשונית הפעולות (actions), ולאחריה ב-"crop to selection" כדי לחתוך את התמונה. לאחר מכן, שמרו את קובץ התמונה החתוכה תחת שם חדש.בשלב הבא, לחצו על לשונית המדידות (measurements) כדי ליצור את הפרוטוקול לסינון אובייקטים ספציפיים הרלוונטיים לאנליזה בתלת-ממד. לאחר מכן, גררו את "find objects" לחלון הפרוטוקול ושנו את שם הפרוטוקול הראשון ל-DAPI. בחרו בערוץ beta tubulin מהתפריט הנפתח.כעת גררו את ההגדרות הבאות לפרוטוקול של beta tubulin והניחו אותן תחת "find objects" בסדר הבא: Fill holes and objects, separate touching objects, exclude objects by size ו-exclude not touching ROIs. כעת בחרו ב-measure בתחתית כל פרוטוקול.לאחר מכן, עבור כל הערוצים למעט DAPI, בחרו במדידת עוצמה ונפח (intensity and volume measurement) ובאורך שלד (skeletal length) עבור כל סימוני הטוביולין. שרטטו ROI מסביב לאזור למדידה. תחת לשונית הסיכום (summary), התבוננו במדדים לאחר שהתוכנה תעבד את האזור.לאחר מכן העתיקו את הנתונים ושמרו אותם בגיליון אלקטרוני נוח לעבודה כפי שמוצג כאן. כדי להרכיב התקן זרימה רב-בארים, חלקו בעזרת מזלג או מסור פס מבחנה לצנטריפוגה בנפח 50 milliliter לשני חצאים לאורכה. חתכו שבעה חצאי עיגול ברדיוס של שלושה סנטימטרים מרשת ניילון של 70 micrometer, וגזרו אותם כך שיתאימו בדיוק לאחד מחצאי מבחנת הצנטריפוגה שחולקה.בעזרת חומר איטום סיליקוני הבטוח לשימוש באקווריומים, הדביקו את חצאי העיגול לתוך מבחנת הצנטריפוגה במקביל לסימוני המדידה של 10 מיליליטר. לאחר ייבוש המכשיר למשך יומיים, שטפו אותו על ידי השריה בכלי ביקר עם מים למשך שעתיים עד שלוש שעות. רפדו את הקצה העליון המהולחלק של מבחנת הצנטריפוגה הגזוזה בחימר פיסולי, כך שעומק הנוזל שיישאר במכשיר הזרימה יהיה רבע אינץ'.הכינו את מכשיר השטיפה על ידי הסרת הבוכנה ממזרק של 50 milliliter והכנסת צינור דק באורך 12 inches לקצה המזרק. דחפו את הצינור פנימה עד למרב והשתמשו בחימר פיסול כדי לאטום את החיבור. הרטיבו מראש את הרשת באמצעות מצע גידול לעוברים כדי לאפשר לנוזל לזרום דרך כל מכשיר הזרימה.הטה את המכשיר על קרח כך שנוזלים יימשכו לכל התאים אך עדיין יתרוקנו מהחלק הקדמי שבו נמצא שפת החימר. תלה את מכשיר השטיפה על מעמד טבעת מעל מכשיר הזרימה הנמצא על קרח. קירר 200 milliliters של מצע עוברים על קרח ושפוך כמות מספיקה למכשיר השטיפה כדי להבטיח שכל בועות האוויר יסולקו ושקצב הזרימה יהיה בערך שבעה milliliters לדקה.כווננו את קצב הזרימה על ידי שינוי גובה המזרק. לאחר הסרת הכלור מהעובריים והכנת נוקודזול (nocodazole) בהתאם לפרוטוקול הכתוב, השתמשו ב-10 milliliters של תמיסת עבודה קרה של נוקודזול כדי להחליף את מצע העובריים של קבוצת הטיפול בנוקודזול. הניחו את צלוחיות הפטרי על קרח למשך זמן מתאים לשלב ההתפתחותי.לאחר מכן, באמצעות פיפטת זכוכית של 1 מיליליטר שעברה ליטוש באש, העבירו את העוברים למערכת הזרימה הרציפה (flow through apparatus), תוך שימוש במדורים נפרדים עבור כל קבוצה ניסויית. התחילו את שטיפת ה-nocodazole על ידי מזיגת מצע גידול עוברים קר מאוד (בטמפרטורת קרח) לחלק העליון של מזרקה בנפח 50 מיליליטר. אפשרו למיקרוטובוליים לגדול מחדש לאחר 20 דקות של שטיפה בטמפרטורת החדר, על ידי העברת העוברים למכלי פטרי מזכוכית המכילים מצע גידול עוברים חם, באמצעות פיפטת זכוכית של 1 מיליליטר שעברה ליטוש באש.מיד עם העברת העובריים, הפעילו טיימר. לבסוף, קבעו את עוברי הביקורת ואת העובריים שעברו שטיפה בנקודות זמן של דקה אחת, חמש דקות ו-10 דקות, על ידי העברת כ-10 עובריים באמצעות פיפט למבחנה לצנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר המולאת ב-1 מיליליטר של מקבע 4%PFA MAB, וקבעו את הדגימות כפי שהודגם קודם לכן בסרטון זה. השתמשו ב-glu-tubulin וב-tyr tubulin כסמנים עבור מיקרוטובוליים יציבים ודינמיים.נמצא כי מיקרוטובוליים דינמיים הם השולטים במוח האחורי בשלב ה-neural keel. ככל שה-keel מתפתח ל-neural rod, שלב של אפיתליזציה מוגברת, ניתן לראות באופן איכותי כי פחות מיקרוטובוליים הם אימונוריאקטיביים עם הנוגדן anti tyr-tubulin, במיוחד ב-ventral rod. לעומת זאת, glu-tubulin מפוזר ונקודתי לאורך כל ה-neural keel, אך הוא מועשר ב-ventral neural rod לאורך מסלול המיקרוטובוליים.ראשי החצים מצביעים על צמרות מיקרוטובוליים או מבנים ספציפיים שבהם הסימון מוגבר. הטיפול ב-nocodazole גורם לדה-פולימריזציה של המיקרוטובולים, מה שמוביל לסימון מפוזר. עם צמיחתם מחדש של המיקרוטובולים, הם מתארכים מהסנטרוזום.עם זאת, הדבר עשוי שלא להיות ברור במישור בודד בשל מסלוליהם הבלתי-מישוריים. למרות זאת, תוכנות מסוימות לניתוח תמונות מסוגלות למדוד אורכים בתלת-ממד, מה שמאפשר הערכה של צמיחת המיקרוטובולים לאחר שטיפת ה-nocodazole. נראה כי אורך הממוצע של המיקרוטובולים עולה עם הזמן לאחר שטיפת ה-nocodazole בכל אזורי צינור העצבים שנותחו.לאחר סיום ניתוח הנתונים באמצעות תוכנת ניתוח התמונות בתלת-ממד ובקרת האיכות, ניתן להפיק מידע שימושי מהנתונים הגולמיים, כגון אורך ממוצע של מיקרוטובולות כוללות ושל מיקרוטובולות יציבות, וכן את היחס בין מיקרוטובולות יציבות למיקרוטובולות כוללות. לאחר רכישת המיומנות, טכניקה זו אינה אורכת יותר משבוע מהתחלה ועד לסיום. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לאסוף ולעבד את הדגימות בזמן, שכן מיקרוטובולות עוברות דפולימריזציה בקלות.ניתן להחיל פרוצדורה זו גם על ניתוח מוטנטים. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של האופן שבו ניתן ללכוד אוכלוסיות נפרדות של מיקרוטובוליים בעובר שלם.

use-immunolabeling-to-analyze-stable-dynamic-nascent-microtubules

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

פרוטוקול זה מתאר הדמיה של נוירונים בודדים או תאים הרכס העצבי החיים עוברים דג הזברה. שיטה זו משמשת כדי לבחון התנהגויות הסלולר לוקליזציה אקטין פלואורסצנטי באמצעות מיקרוסקופיה confocal זמן לשגות.

הדמיה חיה של תנועתיות התא ואת cytoskeleton אקטין של נוירונים בודדים לבין תאים קרסט עצבית בעוברים דג הזברה

מפתח להבנת תהליכים המוךפו"גנטי שהולך המעצבים את העובר המוקדם הוא היכולת תאים תמונה ברזולוציה גבוהה. אנו מתארים כאן טכניקה תיוג תאים בודדים או קבוצות קטנות של תאים עוברי דג הזברה שלם עם חלבון הממברנה ממוקד, פלורסנט ירוק.

סימון תאים הדמיה למוח האחורי של דג הזברה

הדמיית ההתנהגות הדינמית של אברונים ומבנים תת-תאיים אחרים in vivo יכולה לשפוך אור על תפקודם במצבים פיזיולוגיים ומחלות. כאן, אנו מציגים שיטות לתיוג גנטי של שני אברונים, צנטרוזומים ומיטוכונדריה, והדמיית הדינמיקה שלהם בעוברי דג זברה חיים באמצעות מיקרוסקופיה רחבת שדה וקונפוקלית.

הדמית מבני subcellular בעובר דג הזברה החייה

טכניקות מתוארים כדי immunostain-אפיטופים phospho כולן עוברי דג הזברה ולאחר מכן לנהל לוקליזציה confocal ניאון בשני צבעים במבנים הסלולר קטן כמו cilia העיקרי. טכניקות לתיקון והדמיה יכול להגדיר את המיקום ואת קינטיקה של המראה או הפעלה של חלבונים ספציפיים.

Phospho-אפיטופים Immunostaining באיברים ריסי של עוברי דג הזברה שלמים הר

בשילוב של השתלת תאים, תיוג שלד ציטו וגישות אובדן/רווח תפקוד, פרוטוקול זה מתאר כיצד ניתן להשתמש בצלחת הקדם-כורדלית הפוטנציאלית של דג הזברה הנודד כדי לנתח את תפקודו של גן מועמד בנדידת תאים in vivo.

ניתוח<em&gt; In vivo</em&gt; נדידת תאים באמצעות השתלות תא והדמיה זמן לשגות עוברי דג הזברה

מיטוזה היא קריטית לכל אורגניזם חי ופגמים מובילים לעתים קרובות לסרטן ולהפרעות התפתחותיות. באמצעות פרוטוקול הדמיה זה ודגי הזברה כמערכת מודל, חוקרים יכולים לדמיין מיטוזה באורגניזם בעל חוליות חי ואת שלל הפגמים המתעוררים כאשר תהליכים מיטוטיים פגומים.

התבוננות mitotic חטיבת Dynamics בעובר דג הזברה לחיות

פיתוח cilia חיוני organogenesis נכונה. פרוטוקול זה מתאר שיטת אופטימיזציה תווית, דמיינו תאים ciliated של דג זברה.

להמחיש Multiciliated בתאים דג זברה באמצעות פרוטוקול משולב של פלורסנט הר שלמה בחיי עיר הכלאה, Immunofluorescence

פרוטוקול זה ממחיש החיסונית רציפים של האנטי ואימונוהיסטוכימיה על קריודורים מן השלב המוקדם של העוברים ומאפשרים לניתוחי לוקליזציה מדויקים באוכלוסיות תאים ספציפיות.

מרפאוולוגיה רציפה ואימונוהיסטוכימיה על קריוסינות עוברי דג

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור נוגדן הפלורסנט בתיווך זיהוי של חלבונים בהכנות שלמות של עוברי הדגים והזחלים.

כל הר אימונוהיסטוכימיה בזיבפיש עוברים וזחלים

אנו מדגימים שיטה המנצלת סריקה מהירה של מיקרוסקופ קונפוקלי כדי לבצע הדמיה חיה של תאי מיקרוגליה בטקטום האופטי המתפתח של דגי זברה, המאפשר ניתוח של הדינמיקה של תאים אלה in vivo.

הדמיה חיה ואפיון דינמיקה של תאי מיקרוגליה בעובר דג הזברה

מתוארת אסטרטגיית הכנת דגימה להדמיית עוברים מוקדמים של דגי זברה בתוך כוריון שלם באמצעות מיקרוסקופ יריעות אור. הוא מנתח את הכיוונים השונים שהעוברים רוכשים בתוך הכוריון בשלבי 70% אפיבולי וניצן ומפרט אסטרטגיות הדמיה להשגת רזולוציה בקנה מידה תאי בכל העובר באמצעות מערכת יריעות האור.

אסטרטגיות הדמיה והרכבה של מיקרוסקופ גיליון אור עבור עוברים מוקדמים של דגי זברה

למד שיטות אימונולייבלינג לניתוח מיקרוטובולים יציבים, דינמיים ומתהווים במוח המתפתח של דג זברה. פרוטוקולים אלה מאפשרים זיהוי וכימות מדויק של אוכלוסיות מיקרוטובולים שונות במקומן הטבעי.

השימוש Immunolabeling כדי לנתח Microtubules יציב, דינמי, המתהווה של העובר דג זברה

גלה סרטונים נוספים