Microcrystallography של קריסטלים חלבון ו

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להציג מתודולוגיות של קריסטלוגרפיית קרני X המיושמות על מיקרו-גבישים, ובמיוחד על אלו המיוצרים בתוך תאים, הנחשבים לגבישים in vivo. היתרון המרכזי של גישה זו הוא שהיא מספקת תהליך פשוט ויעיל לייצור, זיהוי וניתוח של מיקרו-גבישים. שיטה זו שואפת להקל על השימוש במיקרו-גבישים באמצעות שימוש בגבישים שגדלו בתוך תאים חיים, דבר המבטל את הצורך בתהליכי טיהור מורכבים ובניסיונות שיקוע של Aprocox.

בסרטון זה נתמקד בהכנה ובמניפולציה פשוטות לניסויי עקיפה של קרני X בקו קרן של סינכרוטרון. אנו מציגים את השלבים השונים ביותר מקריסטלוגרפיה קלאסית. בהדגמה זו נשתמש בקריסטלים של חלבון ה-vital polyhedron שגודלו בהצלחה, אך ניתן ליישם את השיטה גם על חלבונים המגבשים קריסטלים בכל תאי חיידקים, חרקים, יונקים או שמרים.

ראשית, דגרו 30 מיליליטר של תאי Sf9 המבטאים באופן יתר את חלבון הפוליהדרון של ה-cypovirus למשך שלושה ימים בטמפרטורה של 27 °C על פלטפורמה מסתובבת. העבירו 500 µL מתרבית תאי ה-Sf9 לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה באמצעות פיפט סרולוגית סטרילית, תוך הקפדה על שמירת הסטריליות של התרבית הראשית באמצעות שימוש במטריס בטיחות ביולוגית class II וביצוע טכניקות אספטיות סטנדרטיות. פפטו 5 µL של תאים משפופרת המיקרו-צנטריפוגה על גשרי זכוכית.

לאחר מכן, הטה בעדינות זכוכית כיסוי מעל הדגימה כך שקצה אחד יגע בטיפה, והורד בזהירות את זכוכית הכיסוי על הנוזל, תוך הימנעות מיצירת בועות אוויר. לאחר מכן, דמיין את הפסליית באמצעות מיקרוסקופ הפוך. בחן את התאים בקפידה, החל מהגדלה של 200x והגדל את הזום להגדלה מקסימלית כאשר מזוהה קריסטל פוטנציאלי.

חפשו קצוות חדים ושינויים במקדם השבירה. אם זוהו גבישים, בחנו את התרבית מדי יום כדי לעקוב אחר צמיחת הגבישים על ידי חזרה על השלבים הקודמים. עבור תאי Sf9, בצעו קציר על ידי העברת התרבית למבחנת צנטריפוגה.

הנח את המבחנה על קרח והמשך לשלב הבא בהקדם האפשרי. לצורך בידוד תאים המכילים גבישים, העבר בפיפט ארבעה מיליליטר של תאי Sf9 מזוהמים למבחנה המותאמת לניתוח בציטומטריית זרימה. הכן מבחנה שנייה עם מספר שווה של תאי Sf9 מתרבית שעברה זיהום דמה (mock infection) כביקורת.

בשלב הבא, הוסיפו propidium iodide לשתי הדגימות עד לריכוז סופי של 1 µg/mL, רגע לפני ההערכה בציטומטריה זרימתית. כעת, העבירו תאי דגימת ביקורת לציטומטר זרימה סטנדרטי המסוגל לבצע מיון תאים על פי FSC ו-SSC. נתחו לפחות 20,000 אירועים.

לאחר הסרת תאים מתים, צברים של תאים ופסולת מהניתוח, צור את תרשים ה-FSC לעומת SSC. לאחר מכן, נתח לפחות 20,000 אירועים מהדגימה המכילה קריסטלים. השווה את תרשים ה-FSC לעומת SSC עם הביקורת וחפש הופעה של אוכלוסייה מובחנת המתאימה לתאים המכילים קריסטלים.

הגדירו את השערים (gates) סביב אוכלוסיית התאים המכילים גבישים, המופיעים בדרך כלל ב-SSC או FSC גבוה יותר. באמצעות סינון זה, מיינו כ-150,000 עד 200,000 מהתאים המכילים גבישים אל תוך מבחנה למיקרו-צנטריפוגה של 1.5 milliliter הממולאת מראש ב-50 microliters של בופר PBS. דמיינו את הדגימות הממוינות באמצעות מיקרוסקופיה של אור כפי שתיארו בעבר, כדי לאשר איזו אוכלוסייה מזוהה עם התאים המכילים גבישים.

בשלב זה ניתן לדגור את התאים עם תמיסות של אטומים כבדים אם נדרש שלב של קביעת פאזה ניסויית (experimental phasing). גישה זו מבוצעת לאחר סריקה של תרכובות וזמני דגירה שונים, כפי שמתואר בטקסט ובסקירות אחרות. הכינו את הכלים להרכבת הדגימה על ידי חיבור ראשוני של micro mesh המורכב על סיכה לקצה של מוט מגנטי.

הנח את המוט לצד החרך של מצוף דיאליזה. לאחר מכן, הרם פתיל נייר באמצעות פינצטה ונעל אותם. ודא שוב שההכנה הושלמה לפני ההמשך.

כעת, ערבבו את התאים עם נפח שווה של תמיסת trypan blue בריכוז 0.4% כדי להגיע לריכוז סופי של 0.2%. לאחר השהיית התאים, העבירו בפיפט 0.5 µL של התאים הממוינים אל המיקרו-רשת (micro mesh). לאחר שהתאים שקעו על פני שטח המיקרו-רשת, הסירו את רוב הנוזל העודף על ידי ספיגה עם פתיל נייר. אם המיקרו-רשת לא תספג מספיק, התאים יהיו בעומקים שונים בתוך הנוזל העודף, דבר שיסבך את יישורם אל קרן ה-X-ray בסינכרוטרון.

בנוסף, עודף נוזלים יגביר את פיזור קרני ה-X ברקע. אם ייספג נוזל רב מדי מהמיקרו-רשת (micro mesh), הנוזל יוסר לחלוטין והדגימה לא תישמר בפתחי הרשת. בספיגה אופטימלית, נותרת על המיקרו-רשת שכבת נוזל דקה בלבד, המגנה על הדגימה ודוחפת אותה אל תוך פתחי הרשת.

חלק מהגבישים ידרשו שימוש בחומר קריו-פרוטקטיבי (cryoprotectant). במקרה שלנו אין בכך צורך, אך הפרוצדורה תהיה זהה לזו של הנחת הדגימה ולאחריה ייבוש (blotting). יש לוודא שנותרה שכבה דקה בלבד של נוזל.

קררו מיד את המיקרו-רשת (micro mesh) בקירור מהיר בחנקן נוזלי והעבירו אותה לדיסקית רובוטית (robot puck) לצורך הובלה לקו קרן של סינכטרון במיקוד מיקרוסקופי (synchrotron microfocus beamline). בשל גודלם הקטן של גבישים in vivo, אספו נתוני diffraction בקו קרן של קריסטלוגרפיה במיקוד מיקרוסקופי. ראשית, רכבו את המיקרו-רשת על הגוניומטר.

כעת, התחילו במרכוז המיקרו-רשת (micro mesh) ביחס למסלול האלומה באמצעות אוריינטציות של מבט חזיתי ומבט צדי. כאשר המיקרו-רשת נמצאת במבט חזיתי, בצעו כיוון עדין של היישור על ידי יישור המרכז של אחד הנתיבים האופקיים של המיקרו-רשת. אספו נתונים לאורך נתיב אופקי זה תוך ביצוע התאמות קלות בלבד ליישור.

לאחר שבדיקת כל הגבישים בנתיב הסתיימה, עברו לנתיב הבא וחזרו על הליך הכיוונון. ודאו כי הנתיבים שכבר עובדו מזוהים בבירור, כדי למנוע מצב שבו גבישים יופספסו או יצולמו פעמיים, כאשר שינוי הצבע של ה-trypan blue ישמש כמדריך. מוצגת סקירה של שתי שיטות לקביעת מבנה באמצעות מיקרו-גבישים in vivo.

השורה העליונה מתארת את הגישה הקלאסית הכוללת ניקוי של גבישים מתאים, בעוד שהשורה התחתונה מציגה את גישת ה-in cellulo crystallography ששומרת על הגבישים בתוך תאי המאכסן לצורך איסוף נתונים. עבור גישת ה-in cellulo, פרופיל ציטומטריית הזרימה של תאים שאינם מזוהמים מושווה לפרופיל של תאים המכילים גבישים, ומשמש לקביעת אוכלוסיית התאים שיש לבחור כדי למיין את התאים המכילים גבישים מהתאים האחרים. בדוגמה זו, לתאים המכילים polyhedra יש פיזור צדדי (side scattering) גבוה יותר מאשר לתאים שאינם מזוהמים.

ניתן להדמיות תאים שנצבעו ב-trypan blue בקלות באמצעות מצלמות הזמינות ברוב קווי הקרן של הסינכרוטרון. בעוד שזיהוי גבישים מטוהרים והתאמתם לקרן ה-X-ray הם תהליכים עתירי עבודה בשל גודלם הקטן, בעת איסוף נתונים מומלץ להתקדם בתבנית של רשת כדי לצמצם את הליכי המרכוז ולהימנע מחשיפה כפולה של אותו תא או גביש, או מהסמקה של תאים וגבישים. לאחר השליטה בשיטה, תהליך זה אורך כחצי יום, מרגע קצירת התאים המכילים את הגבישים ועד לאיסוף הנתונים.

נוהל זה תואם להספגות של אטומים כבדים לצורך פאזינג (phasing) ניסויי. במקרה של הפוליהדרון, המבנה הרגיל התקבל תוך שמונה ימים מתחילת ביטוי החלבון. זכרו שעבודה עם חנקן נוזלי עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש לנקוט באמצעי זהירות מפני חנק וכוויות.