Hypoxic Preonditioning של תאים יליד מארו נגזר כמקור לדור של תאים שוואן בוגרת

המטרה הכללית של טכניקה זו לתרבית תאים היא להעשיר פרוגניטורים עצביים ממח העצם כדי להקל על גזירתם לתאי שוואן (Schwann cells) תפקודיים. שיטה זו נותנת מענה לסוגיה מרכזית ברפואה רגנרטיבית ובתאי גזע: כיצד להשתמש במקור מוגבל של פרוגניטורים עצביים כדי להפיק גליות שיסייעו בצמיחה מחדש של אקסונים ובדמיאלינציה לאחר טראומה. יתרון של טכניקה זו הוא השימוש בהתניית תרבית יעילה להגברת התרחבות תאים עצביים מתאי סטרומה של מח העצם, לצורך שימושם בטיפול תאיים אוטולוגי.

לאחר יומיים בתרבית, הסר 75% מהמצע המרוקן ומהתאים שאינם נצמדים, ושטוף את התאים הנצמדים בשלושה שטיפות של 10 מיליליטר PBS. לאחר השטיפה השלישית, החלף את ה-PBS ב-10 מיליליטר מצע גידול לתאי סטרומה של מוח עצם, או MSC, והחזר את התרבית לאינקובטור. מושבות נראות לעין אמורות להופיע עד היום השישי או השביעי.

ביום ה-10, שטפו את התרבית ב-PBS רענן ונתקו את התאים באמצעות 1.5 milliliters של ריאגנט רקומביננטי אנזימטי לפירוק תאים. לאחר חמש דקות ב-37 degrees Celsius, הוסיפו שלושה milliliters של מצע גידול ל-MSC כדי לנטרל את התגובה ואספו את התאים שנותקו באמצעות סנטריפוגציה. השביחו מחדש את המשקע בחמישה milliliters של מצע גידול רענן ל-MSC והזריעו את התאים בצפיפות של 4×10⁴ תאים לסנטימטר רבוע בתוך צלחת תרבית רקמה חדשה של 10 סנטימטרים.

על התאים להגיע ל-80 עד 90% התמסרות (confluency) בתוך יומיים מהמעבר (passaging). עבור התנייה מוקדמת להיפוקסיה, שחררו תחילה את תפסן הטבעה ונקו את החלקים החשופים באתנול 70%. פרקו לאחר מכן את תא ההיפוקסיה לרכיביו והניחם במנדף זרימה למינרית לעיקור תחת קרני UV למשך 15 דקות.

בשלב הבא, שטפו תרבית MSC בהסอดูסיביות (confluency) של 80% עד 90% עם 10 milliliters של PBS כפי שהודגם זה עתה, והטריקו על התרביות מצע גידול MSC טרי תומך ב-25 millimolar hepes. העבירו את התרבית המטופלת לתוך תא ההיפוקסיה המורכב מחדש והדקו את טבעת הסגירה. אטמו את קצות החיבור של התא כדי להבטיח שאין דליפת גז, והזרימו לתא תערובת גזים של 99% nitrogen ו-1% oxygen בקצב זרימה של 10 liters לדקה.

לאחר חמש דקות, העבירו את התא למקטרת תרבית תאיים למשך 16 שעות. למחרת בבוקר, נתקו את התאים כפי שהודגם כעת ואספו אותם באמצעות צנטריפוגציה. השעיכו מחדש את המשקע במצע תאי אב עצביים וזרעו 6 × 10³ תאים לסנטימטר רבוע בלוחיות 6 באריים בעלות הידבקות נמוכה, לתרבית ב-37 °C ו-5% CO2 למשך 12 ימים.

יש לצפות להיווצרות כדורי תאים גדולים שאינם דבקים עד היום השישי או השביעי. בימים 10 עד 12, ייראו נוירוספירות רבות יותר בתרביות שהותנו בתנאי היפוקסיה מאשר באלו שהותנו בתנאי נורמוקסיה. ביום ה-12, השתמש בפיפט של 10 milliliters כדי להעביר את הנוירוספירות למבחנה קונית של 15 milliliters ואסוף את הנוירוספירות באמצעות סבב (צנטריפוגציה).

שחזר את הכדורים ב-DMEM/F12 והעבר חמישה עד 10 נוירוספירות לסמ"ר לצלחות 6 בארי עם ציפוי poly-D-lysine laminin, ב-1.5 מיליליטר של מצע השראה גליאלית למשבצת. תחזק את תרבית תאי הכדורים למשך שבעה ימים לפחות, תוך חידוש המצע מדי שלושה ימים. כדי לאסוף את הגנגליונים של השורש האחורי, העבר את העובר הראשון לצלחית תרבית של 10 ס"מ המכילה PBS בטמפרטורת החדר תחת מיקרוסקופ דיסקציה במצב שכיבה על הבטן, והכנס פינצטת מיקרו-דיסקציה לאורך שני צדי חוט השדרה.

באמצעות דיסקציה קהה, הפרידו את חבל השדרה מהרקמה הרכה שסביבו בעזרת פינצטה, כדי להוציא את חבל השדרה לאורך פתח הצוואר ושורש הזנב. הסירו את שאריות הרקמה הרכה מחבל השדרה המשוחרר, עד שנותרו רק חבל השדרה, שורשי העצבים וגנגליון השורש הדורסלי המחובר אליהם. נתקו את גנגליוני השורש הדורסלי הבודדים משורשי העצבים המחברים אותם.

לאחר מכן, השתמשו בפיפט עם טיפ של 1 milliliters כדי להעביר עד 100 ganglia של שורש גבי (dorsal root ganglia) למבחנת מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 milliliters המכילה PBS. אספו את הגנגליונים באמצעות סנטריפוגה והשעיקו מחדש את המשקעים ב-200 microliters של ריאגנט רקומביננטי לפירוק אנזימטי של תאים לכל מבחנה. לאחר 10 דקות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius, סנטריפוגו שוב את ה-dorsal root ganglia והשתמשו בטיפ פיפט של 200 microliter כדי לבצע טריטורציה עדינה של המשקעים במצע לתחזוקת נוירונים של dorsal root ganglion.

זריעה של תאי גנגליון השורש האחורי (dorsal root ganglion) בריכוז של 5×10³ תאים לסמ"ר על פלטות של 6 בארות מצופות ב-poly-D-lysine laminin, ב-1.5 מיליליטר של מצע תחזוקה לתאי גנגליון השורש האחורי לכל בארה. לאחר יומיים של תרבית ב-37 °C ו-5% CO2, יש לשטוף את התאים ולהחזיר את תרביות התאי העצבונים למדגרה במצע טרי לטיהור תאי גנגליון השורש האחורי למשך יומיים נוספים. לאחר שלושה עד ארבעה מחזורי תחזוקה וטיהור, תרביות תאי גנגליון השורש האחורי אמורות להראות תוצאה חיובית לסמן העצבוני Tuj-1 ותוצאה שלילית לסמן התאים הגליאליים S100 beta.

ביום השביעי של תרבית התאים דמויי תאי שוואן (Schwann cell-like cells), שטפו את התאים ב-PBS ולאחר מכן בצעו דיסוציאציה באמצעות 0.5 מיליליטר של ריאגנט רקומביננטי אנזימטי לדיסוציאציית תאים לכל באר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. השעיקו מחדש את משקע התאים במצע תרבית משולבת (co-culture medium) ושתלו את התאים דמויי תאי שוואן על תרבית של נוירונים מזקיקים של שורש הגב (dorsal root ganglion) מופקים בריכוז של 1*10³ תאים לסמ"ר למשך 14 ימי תרבית משולבת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5%CO2. תאי MSC בריאים מראים מורפולוגיה מחודדת, בניגוד למראה המרובע של תאי MSC שעברו מספר רב של מעברים ואיבדו את הרב-פוטנציאליות שלהם.

מושבות MSC מורחבות אמורות להפגין ביטוי של סממני MSC, היעדר של סממני תאי גזע המטופואטיים, ויכולת התמיינות לשורות אדיפוגניות, אוסטאוגניות וכונדרוגניות. תרביות MSC בריאות שעברו עיבוד מוקדם היפוקסי, מראות נוירוספרות גדולות יותר הן במספרן והן בגודלן. ניתן לאשר את טוהר רשת הנוירונים של הגנגליון השורשי האחורי על ידי ביטוי הסמן הנוירונלי Tuj-1 וההיעדר הנלווה של סמן תאי שוואן S100.

לאחר 14 ימים של תרבית משותפת עם נוירונים של גנגליון השורש האחורי (dorsal root ganglion), תאים דמויי תאי שוואן רוכשים את המאפיינים והתכונות התפקודיות של תאי שוואן בוגרים בעלי גורל תאי נקבע. ברגע שהשיטה נשלטת, ניתן להרחיב את תת-אוכלוסיית התאי הגזע העצביים בתוך BMSCs של בני אדם או חולדות תוך 10 ימים, במידה שטכניקת הרחבת התאים מבוצעת כראוי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לוודא שדגימת ה-BMSC כוללת תאי גזע עצביים חיוביים ל-nestin ושכל התאי הגזע ההמטופויטיים החיוביים ל-CD45 הוסרו.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן השגתן של BMSCs, העשרה של תת-אוכלוסיית תאי המוצא העצביים, והכוונת התמיינות תאי מוצא עצביים לתאי שוואן (Schwann cells) בעלי גורל תאי מוגדר, לצורך שיפור צמיחה מחדש של אקסונים ורמיאלינציה לאחר טראומה. בעקבות הליך זה, ניתן להפיק גלייה מיאליניזית, כגון תאי שוואן בוגרים, לשימוש בפיתוח טיפולים לפגיעות ומחלות דמיאליניזציה במערכת העצבים ההיקפית והמרכזית כאחד.