Name: Hypoxic Preonditioning של תאים יליד מארו נגזר כמקור לדור של תאים שוואן בוגרת (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: למדו טכניקת תרבית תאים לעשרת תאי עצם נוירונליים מתוך תאי מסטroma מוח עצם ולהפיכתם לתאי שוואן בוגרים. שיטה זו משפרת טיפול אוטולוגי בשחזור עצבים פוסט-טראומטיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים היו רוצים להודות ד&quot;ר Nai-Sum וונג על מתן המנגנון קאמרית היפוקסיה וגברת אליס לואי עבור התמיכה הטכנית.

<ol><li>Wiliams, R. R., Bunge, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cell+transplantation%3A+a+repair+strategy+for+spinal+cord+injury%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Schwann cell transplantation: a repair strategy for spinal cord injury?</a> Prog Brain Res. 201, 295-312 (2012).</li>
<li>Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cell+transplantation+for+spinal+cord+injury+repair%3A+its+significant+therapeutic+potential+and+prospectus%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Schwann cell transplantation for spinal cord injury repair: its significant therapeutic potential and prospectus.</a> Rev Neurosci. 26 (2), 121-128 (2015).</li>
<li>Lindvall, O., Kokaia, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+human+neurodegenerative+disorders--time+for+clinical+translation%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Stem cells in human neurodegenerative disorders--time for clinical translation?</a> J Clin Invest. 120 (1), 29-40 (2010).</li>
<li>Terzic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+Differentiation+of+Oligodendrocyte+Progenitor+Cells+From+Mouse+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Directed Differentiation of Oligodendrocyte Progenitor Cells From Mouse Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Transplant. 25 (2), 411-424 (2016).</li>
<li>Takashima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroepithelial+cells+supply+an+initial+transient+wave+of+MSC+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Neuroepithelial cells supply an initial transient wave of MSC differentiation.</a> Cell. 129 (7), 1377-1388 (2007).</li>
<li>Felling, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem%2Fprogenitor+cells+participate+in+the+regenerative+response+to+perinatal+hypoxia%2Fischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural stem/progenitor cells participate in the regenerative response to perinatal hypoxia/ischemia.</a> J Neurosci. 26 (16), 4359-4369 (2006).</li>
<li>Shea, G. K., Tsui, A. Y., Chan, Y. S., Shum, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow-derived+Schwann+cells+achieve+fate+commitment--a+prerequisite+for+remyelination+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Bone marrow-derived Schwann cells achieve fate commitment--a prerequisite for remyelination therapy.</a> Exp Neurol. 224 (2), 448-458 (2010).</li>
<li>Jessen, K. R., Mirsky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+development+of+glial+cells+in+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The origin and development of glial cells in peripheral nerves.</a> Nat Rev Neurosci. 6 (9), 671-682 (2005).</li>
<li>Mung, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+generation+of+neural+progenitors+from+adult+bone+marrow+stromal+cells+by+hypoxic+preconditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient generation of neural progenitors from adult bone marrow stromal cells by hypoxic preconditioning.</a> Stem Cell Res Ther. 7 (1), 146(2016).</li>
<li>Ao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regeneration+of+transected+sciatic+nerves+of+adult+rats+using+chitosan+nerve+conduits+seeded+with+bone+marrow+stromal+cell-derived+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The regeneration of transected sciatic nerves of adult rats using chitosan nerve conduits seeded with bone marrow stromal cell-derived Schwann cells.</a> Biomaterials. 32 (3), 787-796 (2011).</li>
<li>Tondreau, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+BM+mesenchymal+stem+cells+by+plastic+adhesion+or+negative+selection%3A+phenotype%2C+proliferation+kinetics+and+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Isolation of BM mesenchymal stem cells by plastic adhesion or negative selection: phenotype, proliferation kinetics and differentiation potential.</a> Cytotherapy. 6 (4), 372-379 (2004).</li>
<li>Baksh, D., Song, L., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mesenchymal+stem+cells%3A+characterization%2C+differentiation%2C+and+application+in+cell+and+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy.</a> J Cell Mol Med. 8 (3), 301-316 (2004).</li>
<li>Jirsova, K., Sodaar, P., Mandys, V., Bar, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+jet%3A+a+method+to+obtain+pure+Schwann+cell+cultures+without+the+need+for+cytotoxic%2C+apoptosis-inducing+drug+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Cold jet: a method to obtain pure Schwann cell cultures without the need for cytotoxic, apoptosis-inducing drug treatment.</a> J. Neurosci. Methods. 78 (1-2), 133-137 (1997).</li>
</ol>

כל המחברים של כתב היד הזה אין כל גילוי כדי להכריז.

זה חיוני כדי לשמר את &quot;גזע&quot; של MSCs לפני העשרה של אבות עצביים באמצעות תנאים מוקדמים היפוקסי ותרבות neurosphere. מניסיוננו, MSCs ריבוי יכול להיות מזוהה באופן מהימן על ידי מורפולוגיה fibroblast שלהם מוארך כמו. לעומת זאת, MSCs אשר אימצו מורפולוגיה מרובעת יותר, מרובעת, עם סיבי הלחץ הבולטים cytoskeletal, לא בקלות לאמץ גורל תאים עצביים יש להשליך. באופן כללי, אנחנו לא משתמשים MSCs עם מספרי המעבר יותר משמונה. כדי לשמור על הגבעול שלהם, חשוב לעבור מיד MSCs לפני שהם מגיעים המפגש 100...

השתלת אבות עצביים ונגזרותיהם מדגימה את ההבטחה כאסטרטגיה טיפולית בעקבות פגיעה עצבית טראומטית 1 , 2 ונוירוגנרטיון 3 , 4 . לפני היישום הקליני, זה חיוני כדי להבטיח: א) שיטה לגישה והרחבה על מקור אוטולוגי של גזע / תאים אב ו 2) אמצעי לכוון אותם סוגי תאים רלוונטיים, בוגרת 3 . ההתעניינות שלנו בטיפול בתאי פציעה בחוט השדרה הובילה אותנו לחפש מקור תא אוטולוגי חזק ואבולוצי של אבות עצביים ברקמות של מבוגרים. תת אוכלוסיות של MSC מקורן בכף עצבי, והוא נגיש בקלות מחלל המפרק. תאים אלה הם אבות עצביים שיכולים ליצור נוירונים וגליה 5 . מודלים של בעלי חיים של איסכמיה מוחית מראים כי היפוקסיה מקדמת את ההרגעה<html> Iferation ו multipotency של אבות עצביים בתוך המוח 6 . זה היה הבסיס לשימוש התנאי היפוקסי כאמצעי להרחבת על אבות עצביים הנגזרים על מוח. השתלת תאי Schwann לתוך חוט השדרה הפצוע מקדם התחדשות 2 . SCLCs ניתן לייצר MSCs באמצעות תוספת עם גורמים gliogenic ( כלומר, β-Heregulin, bFGF, ו PDGF-AA), אבל להפגין יציבות פנוטיפית. עם הנסיגה של גורמי גדילה, הם לחזור פנוטיפ דמוי fibroblast 7 . אי-יציבות פנוטיפית אינה רצויה בהשתלות תאים בשל הסיכון של הבחנה חריגה וסרטן. כמו מבשרי התא Schwann קשורות עם צרורות האקסון בתוך העצב ההיקפי עובריים 8 , הובילו cLCulture coculture עם נוירונים DRG מטוהרים עובריים 7 ,התחת = &quot;xref&quot;&gt; 9. תאים בוגרת שוואן בשלבים הם גורל מחויבים להפגין פונקציה במבחנה 7 , 9 ו in vivo 10 . הפרוטוקול שלנו להעשרת אבות עצביים מ MSC הוא פשוט ויעיל ותוצאות גידול במספר התא עבור מבחני הבאים. הגזירה של תאי גורן מחויבים באמצעות פלטפורמת coculture מאפשר לימוד של הבדל גלייה ועל הדור של תאים שוואן יציבה ופונקציונלית עבור יישומים קליניים פוטנציאליים.

<table><tbody><tr><td>ואלפא; MEM</td><td>Sigmaaldrich</td><td>M4526</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermofisher scientific</td><td>12400-024</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Thermofisher scientific</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biosera</td><td>FB-1280/500</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Thermofisher scientific</td><td>17504-001</td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה אפידרמיס (EGF)</td> <td>Thermofisher מדעי</td><td></td><td></td>PHG0313</tr><tr><td>גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF)&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>100-18B/100UG</td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה עצבי (NGF)&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>NC011</td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה שמקורו בטסיות-AA (PDGF-AA)</td><td>פפרוטק</td><td>100-13A</td><td></td></tr><tr><td>הרגולין בטא-3, תחום EGF (&beta;-Her)</td><td>Millipore</td><td>01-201</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigmaaldrich</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluro-2' - deoxyuridine (FDU)</td><td>Sigmaaldrich</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>פולי-D-ליזין (PDL)</td><td>Sigmaaldrich</td><td>P7886-1G</td><td></td></tr><tr><td>למינין</td><td>Thermofisher מדעי</td><td>23017015</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין / סטרפטומיצין (P/S)</td> <td>Thermofisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 10 ס"מ לתרבית</td> <td>דבקהTPP</td><td>93100</td><td>משמש לבחירת MSCs על ידי הדבקות בתרבית רקמה</td></tr><tr><td>צלחת 6 בארות לתרבית דבקה</td><td>TPP</td><td>92006</td><td>משמש להרחבת MSCs לאחר מעבר</td></tr><tr><td>צלחת UltraLow 6 בארות לתרבית שאינה נדבקת</td><td>Corning</td><td>3471</td><td>משמש להעשרת אב עצבי</td></tr><tr><td>CD90 (Thy-1) BD Biosciences אנטי אנושי CD90 (Thy-1)</td> <td>BD Biosciences</td><td>555593</td><td></td></tr><tr><td>CD73</td> <td>אנטי אנושיBD Biosciences</td><td>550256</td><td></td></tr><tr>מו"פ<td>אנטי-אנושי/חולדות STRO-1</td><td> D Systems</td><td>MAB1038</td><td></td></tr><tr><td>מחקר ומחקר אנטי-אנושי</td><td> D Systems</td><td>MAB1259</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-אנושי CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>555480</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-חולדות CD90(Thy-1)</td><td>BD Biosciences</td><td>554895</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-חולדות CD73</td><td>BD Biosciences</td><td>551123</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-חולדות נסטין</td><td>BD Biosciences</td><td>MAB1259</td><td></td></tr><tr><td>נגד חולדות CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>554875</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-S100&בטא;</td><td>Dako</td><td>Z031101</td><td></td></tr><tr><td>Anti-p75</td><td>Millipore</td><td>MAB5386</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFAP</td><td>Sigmaaldrich</td><td>G3893</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Class III-beta tubulin (Tuj-1)</td> <td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td></td></tr><tr><td>גרעינים אנטי-אנושיים</td><td>Millipore</td><td>MAB1281</td><td></td></tr><tr><td>תא היפוקסיה</td><td>Billups-Rothenberg</td><td>MIC-101</td><td></td></tr><tr><td>HEPES מאגר</td><td>Sigmaaldrich</td><td>H4034-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

hypoxic preonditioning של תאים יליד מארו נגזר כמקור לדור של תאים שוואן בוגרת

Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells As a Source for the Generation of Mature Schwann Cells

כתב יד זה מתאר אמצעי להעשרתם של אבות עצביים מאוכלוסיית תאי החלב (MSC) ולאחר מכן להפנותם אל גורל התא הבוגר של שוואן. ערכנו חולדות וחולי סרטן אנושיים לתנאים היפוקסיים חולפים (חמצן של 1% ל -16 שעות), ולאחר מכן התרחבות כנוירוספרה על מצע נמוך עם גורם גדילה של אפידרמיס (EGF) / תוספת גורמי גידולי פיברובלסטים בסיסיים (bFGF). Neurospheres היו seeded על פולי-D- ליזין / laminin מצופה רקמה תרבות פלסטיק ו מתורבת בקוקטייל gliogenic המכיל β-Heregulin, bFGF, ו טסיות הנגזרות גורם הצמיחה (PDGF) לייצר תאים דמויי תא שוואן (SCLCs). SCLCs היו מופנים למחויבות הגורל באמצעות coculture במשך 2 שבועות עם נוירונים השורש הגבי מטוהרים (DRG) נוצרים המתקבלים E14-15 הרות חולדה Sprague Dawley. תאים בשלה שוואן להוכיח התמדה ביטוי S100β / p75 ויכול ליצור קטעי myelin. תאים שנוצרו באופן זה יש פוטנציאל אPplications ב השתלת תאים אוטולוגיים בעקבות פגיעה בחוט השדרה, כמו גם דוגמנות המחלה.

סקירה של שלבי המפתח בפרוטוקול שלנו הוא באיור 1 . לסיכום, חולדה MSCs אנושיים נבחרים על ידי דבקות פלסטיק תרבות רקמות. MSC מורחב מותנים מראש עם היפוקסיה והם כפופים לתנאי נוירופר. Neurospheres הם מצופה מותר להבדיל SCLCs. SCLCs הם cocultured עם נוירונים DRG מטוהרים לייצר גורל מחויבים תאים Schwann. מורפולוגיה של עכברוש תרבות...

תאים מוחיים סטרומליים (MSC) עם פוטנציאל עצבי קיימים בתוך מוח העצם. הפרוטוקול שלנו מעשיר אוכלוסייה זו של תאים באמצעות תנאים מוקדמים היפוקסי ולאחר מכן מפנה אותם להפוך לתאי Schwann בוגרת.

Hypoxic Preonditioning של תאים יליד מארו נגזר כמקור לדור של תאים שוואן בוגרת

This manuscript describes a means to enrich for neural progenitors from the marrow stromal cell (MSC) population and thereafter to direct them to the ...

המטרה הכללית של טכניקה זו לתרבית תאים היא להעשיר פרוגניטורים עצביים ממח העצם כדי להקל על גזירתם לתאי שוואן (Schwann cells) תפקודיים. שיטה זו נותנת מענה לסוגיה מרכזית ברפואה רגנרטיבית ובתאי גזע: כיצד להשתמש במקור מוגבל של פרוגניטורים עצביים כדי להפיק גליות שיסייעו בצמיחה מחדש של אקסונים ובדמיאלינציה לאחר טראומה. יתרון של טכניקה זו הוא השימוש בהתניית תרבית יעילה להגברת התרחבות תאים עצביים מתאי סטרומה של מח העצם, לצורך שימושם בטיפול תאיים אוטולוגי.לאחר יומיים בתרבית, הסר 75% מהמצע המרוקן ומהתאים שאינם נצמדים, ושטוף את התאים הנצמדים בשלושה שטיפות של 10 מיליליטר PBS. לאחר השטיפה השלישית, החלף את ה-PBS ב-10 מיליליטר מצע גידול לתאי סטרומה של מוח עצם, או MSC, והחזר את התרבית לאינקובטור. מושבות נראות לעין אמורות להופיע עד היום השישי או השביעי.ביום ה-10, שטפו את התרבית ב-PBS רענן ונתקו את התאים באמצעות 1.5 milliliters של ריאגנט רקומביננטי אנזימטי לפירוק תאים. לאחר חמש דקות ב-37 degrees Celsius, הוסיפו שלושה milliliters של מצע גידול ל-MSC כדי לנטרל את התגובה ואספו את התאים שנותקו באמצעות סנטריפוגציה. השביחו מחדש את המשקע בחמישה milliliters של מצע גידול רענן ל-MSC והזריעו את התאים בצפיפות של 4×10⁴ תאים לסנטימטר רבוע בתוך צלחת תרבית רקמה חדשה של 10 סנטימטרים.על התאים להגיע ל-80 עד 90% התמסרות (confluency) בתוך יומיים מהמעבר (passaging). עבור התנייה מוקדמת להיפוקסיה, שחררו תחילה את תפסן הטבעה ונקו את החלקים החשופים באתנול 70%. פרקו לאחר מכן את תא ההיפוקסיה לרכיביו והניחם במנדף זרימה למינרית לעיקור תחת קרני UV למשך 15 דקות.בשלב הבא, שטפו תרבית MSC בהסอดูסיביות (confluency) של 80% עד 90% עם 10 milliliters של PBS כפי שהודגם זה עתה, והטריקו על התרביות מצע גידול MSC טרי תומך ב-25 millimolar hepes. העבירו את התרבית המטופלת לתוך תא ההיפוקסיה המורכב מחדש והדקו את טבעת הסגירה. אטמו את קצות החיבור של התא כדי להבטיח שאין דליפת גז, והזרימו לתא תערובת גזים של 99% nitrogen ו-1% oxygen בקצב זרימה של 10 liters לדקה.לאחר חמש דקות, העבירו את התא למקטרת תרבית תאיים למשך 16 שעות. למחרת בבוקר, נתקו את התאים כפי שהודגם כעת ואספו אותם באמצעות צנטריפוגציה. השעיכו מחדש את המשקע במצע תאי אב עצביים וזרעו 6 × 10³ תאים לסנטימטר רבוע בלוחיות 6 באריים בעלות הידבקות נמוכה, לתרבית ב-37 °C ו-5% CO2 למשך 12 ימים.יש לצפות להיווצרות כדורי תאים גדולים שאינם דבקים עד היום השישי או השביעי. בימים 10 עד 12, ייראו נוירוספירות רבות יותר בתרביות שהותנו בתנאי היפוקסיה מאשר באלו שהותנו בתנאי נורמוקסיה. ביום ה-12, השתמש בפיפט של 10 milliliters כדי להעביר את הנוירוספירות למבחנה קונית של 15 milliliters ואסוף את הנוירוספירות באמצעות סבב (צנטריפוגציה).שחזר את הכדורים ב-DMEM/F12 והעבר חמישה עד 10 נוירוספירות לסמ"ר לצלחות 6 בארי עם ציפוי poly-D-lysine laminin, ב-1.5 מיליליטר של מצע השראה גליאלית למשבצת. תחזק את תרבית תאי הכדורים למשך שבעה ימים לפחות, תוך חידוש המצע מדי שלושה ימים. כדי לאסוף את הגנגליונים של השורש האחורי, העבר את העובר הראשון לצלחית תרבית של 10 ס"מ המכילה PBS בטמפרטורת החדר תחת מיקרוסקופ דיסקציה במצב שכיבה על הבטן, והכנס פינצטת מיקרו-דיסקציה לאורך שני צדי חוט השדרה.באמצעות דיסקציה קהה, הפרידו את חבל השדרה מהרקמה הרכה שסביבו בעזרת פינצטה, כדי להוציא את חבל השדרה לאורך פתח הצוואר ושורש הזנב. הסירו את שאריות הרקמה הרכה מחבל השדרה המשוחרר, עד שנותרו רק חבל השדרה, שורשי העצבים וגנגליון השורש הדורסלי המחובר אליהם. נתקו את גנגליוני השורש הדורסלי הבודדים משורשי העצבים המחברים אותם.לאחר מכן, השתמשו בפיפט עם טיפ של 1 milliliters כדי להעביר עד 100 ganglia של שורש גבי (dorsal root ganglia) למבחנת מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 milliliters המכילה PBS. אספו את הגנגליונים באמצעות סנטריפוגה והשעיקו מחדש את המשקעים ב-200 microliters של ריאגנט רקומביננטי לפירוק אנזימטי של תאים לכל מבחנה. לאחר 10 דקות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius, סנטריפוגו שוב את ה-dorsal root ganglia והשתמשו בטיפ פיפט של 200 microliter כדי לבצע טריטורציה עדינה של המשקעים במצע לתחזוקת נוירונים של dorsal root ganglion.זריעה של תאי גנגליון השורש האחורי (dorsal root ganglion) בריכוז של 5×10³ תאים לסמ"ר על פלטות של 6 בארות מצופות ב-poly-D-lysine laminin, ב-1.5 מיליליטר של מצע תחזוקה לתאי גנגליון השורש האחורי לכל בארה. לאחר יומיים של תרבית ב-37 °C ו-5% CO2, יש לשטוף את התאים ולהחזיר את תרביות התאי העצבונים למדגרה במצע טרי לטיהור תאי גנגליון השורש האחורי למשך יומיים נוספים. לאחר שלושה עד ארבעה מחזורי תחזוקה וטיהור, תרביות תאי גנגליון השורש האחורי אמורות להראות תוצאה חיובית לסמן העצבוני Tuj-1 ותוצאה שלילית לסמן התאים הגליאליים S100 beta.ביום השביעי של תרבית התאים דמויי תאי שוואן (Schwann cell-like cells), שטפו את התאים ב-PBS ולאחר מכן בצעו דיסוציאציה באמצעות 0.5 מיליליטר של ריאגנט רקומביננטי אנזימטי לדיסוציאציית תאים לכל באר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. השעיקו מחדש את משקע התאים במצע תרבית משולבת (co-culture medium) ושתלו את התאים דמויי תאי שוואן על תרבית של נוירונים מזקיקים של שורש הגב (dorsal root ganglion) מופקים בריכוז של 1*10³ תאים לסמ"ר למשך 14 ימי תרבית משולבת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5%CO2. תאי MSC בריאים מראים מורפולוגיה מחודדת, בניגוד למראה המרובע של תאי MSC שעברו מספר רב של מעברים ואיבדו את הרב-פוטנציאליות שלהם.מושבות MSC מורחבות אמורות להפגין ביטוי של סממני MSC, היעדר של סממני תאי גזע המטופואטיים, ויכולת התמיינות לשורות אדיפוגניות, אוסטאוגניות וכונדרוגניות. תרביות MSC בריאות שעברו עיבוד מוקדם היפוקסי, מראות נוירוספרות גדולות יותר הן במספרן והן בגודלן. ניתן לאשר את טוהר רשת הנוירונים של הגנגליון השורשי האחורי על ידי ביטוי הסמן הנוירונלי Tuj-1 וההיעדר הנלווה של סמן תאי שוואן S100.לאחר 14 ימים של תרבית משותפת עם נוירונים של גנגליון השורש האחורי (dorsal root ganglion), תאים דמויי תאי שוואן רוכשים את המאפיינים והתכונות התפקודיות של תאי שוואן בוגרים בעלי גורל תאי נקבע. ברגע שהשיטה נשלטת, ניתן להרחיב את תת-אוכלוסיית התאי הגזע העצביים בתוך BMSCs של בני אדם או חולדות תוך 10 ימים, במידה שטכניקת הרחבת התאים מבוצעת כראוי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לוודא שדגימת ה-BMSC כוללת תאי גזע עצביים חיוביים ל-nestin ושכל התאי הגזע ההמטופויטיים החיוביים ל-CD45 הוסרו.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן השגתן של BMSCs, העשרה של תת-אוכלוסיית תאי המוצא העצביים, והכוונת התמיינות תאי מוצא עצביים לתאי שוואן (Schwann cells) בעלי גורל תאי מוגדר, לצורך שיפור צמיחה מחדש של אקסונים ורמיאלינציה לאחר טראומה. בעקבות הליך זה, ניתן להפיק גלייה מיאליניזית, כגון תאי שוואן בוגרים, לשימוש בפיתוח טיפולים לפגיעות ומחלות דמיאליניזציה במערכת העצבים ההיקפית והמרכזית כאחד.

hypoxic-preconditioning-marrow-derived-progenitor-cells-as-source-for

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

שיטה לנתח את התפלגות אבות היווצרות הדם במח העצם ב cytometry זרימה, כמו גם ביעילות לבודד מטוהרים מאוד בתאי גזע hematopoietic (HSCs) מתואר. הליך הבידוד מבוסס בעיקרו על העשרת המגנטי של כ-Kit תאים + תא מיון לטהר HSCs ללימודי תאית ומולקולרית.

ניתוח בידוד פנוטיפי של Murine בתאי גזע hematopoietic ו-Lineage מחויבים אבות

סרטון זה מדגים שיטה להשגת תאים דמויי תאי Schwann מתאי סטרומה רב-פוטנטיים של מח עצם (BMSCs). בתחילה, BMSCs לעבור טיפול היפוקסיה, ואחריו התמיינות מכוונת לתוך תאי אב עצביים. לאחר מכן, נעשה שימוש בתנאי מדיה ותרבית ספציפיים כדי לגרום לטרנספורמציה של תאי אב אלה לתאים דמויי תאי Schwann.

יצירת תאים דמויי תאי Schwann מתאי סטרומה של מח עצם

סרטון זה מדגים הליך לבידוד נוירונים של גנגליון שורש גבי (DRG) מעוברי חולדות וטיפוחם יחד עם מבשרי תאי Schwann ליצירת תאי Schwann בוגרים. ה-DRGs המבודדים מעובדים כדי לבודד תאי עצב ותאי גלייה. התאים המבודדים מתורבתים כדי לטהר את תאי העצב, אשר לאחר מכן מתורבתים יחד עם תאים דמויי תאי Schwann (SCLCs) במדיום של תרבית משותפת. אינטראקציה עם נוירוני DRG מובילה להבשלה של SCLCs לתוך תאי Schwann.

בידוד של נוירוני DRG והתרבות משותפת עם מבשרי תאי Schwann ליצירת תאי Schwann

דור של תאי גזע pluripotent מושרה מספק סיכויים מרתקים לגזירה של השתלות אוטולוגית. עם זאת, ההתקדמות במדינת pluripotent מחדש בידול מייגע עדיין מעכבת תרגום קליני. כאן אנו מתארים את הגזירה של fibroblasts אדם הבוגר וההמרה הישירה שלהם לתאים עצביים מושרה ובידול שלאחר מכן לשושלות עצביות.

גזירה של fibroblasts אדם הבוגר וההמרה ישירה שלהם לתאים להרחבה עצבי אב

נדגים כיצד לזהות ולבודד 6 קבוצות משנה של אבות מיאלואידית ממח העצם מאתר באמצעות שילוב של מגנטי קרינה פלואורסצנטית מיון (מקינטוש ו- FACS). פרוטוקול זה יכול לשמש in vitro לקשרי תרבות מבחני (תרבויות methylcellulose או נוזל), ויוו המאמצת העברת הניסויים של RNA/חלבון ניתוחים.

זיהוי ובידוד של Oligopotent, ביצע לשושלת אבות מיאלואידית ממח העצם העכבר

האינטראקציות הנוירוניות-גליאליות בניוון עצבי אינן מובנות היטב בשל כלים ושיטות לא מספקים. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקולים ממוטבים להשגת תאי עצב מושרים, תאים מבשרי אוליגודנדרוציטים ואוליגודנדרוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ומספקים דוגמאות לערכים של שיטות אלה בהבנת תרומות ספציפיות לסוג התא במחלת אלצהיימר.

יצירת נוירונים אנושיים ואוליגודנדרוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים למידול אינטראקציות נוירון-אוליגודנדרוציטים

אנו מתארים שלוש שיטות של השתלת מח עצם (BMT): BMT עם הקרנת גוף כוללת, BMT עם הקרנה מוגנת, ושיטת BMT ללא מיזוג מראש (BMT מאמץ) לחקר המטופוזיס שיבוטים במודלים של עכבר.

הליכים השתלת מח עצם בעכברים ללמוד Hematopoiesis שיבוט

פרוטוקול זה מתאר הזרקה תוך-פמורלית של כמה תאי גזע המטופויטיים או לוקמיים, כולל תאים ערוכים גנטית, במודלים של קסנוגרפט מורין, אשר לא רק יאפשרו השתלה מהירה ובטוחה של תאים אלא גם ניתוחים סדרתיים של מח העצם.

הזרקות תוך עצם הירך הפשוטות באמצעות עכברים חיים מאפשרות ניתוח רציף של מח עצם

כאן, הקמנו in vivo אוסטאו-אורגנואידים המופעלים על ידי פיגומי ג'לטין טעונים בחלבון מורפוגנטי-2 עצם כדי לקצור תאי גזע / אב המטופויטיים טיפוליים לשחזור של מערכת המטופויטית וחיסונית פגומה. בסך הכל, גישה זו יכולה לספק מקור תאי מבטיח לטיפולים תאיים.

In Vivo גישת אוסטאו-אורגנואיד לקצירת תאי גזע/אב המטופויטיים טיפוליים

בפרוטוקול זה, יודגם גזירה של תאי אב לבביים מתאי גזע עובריים של עכבר ושל בני אדם. אסטרטגיה עיקרית בפרוטוקול זה היא להעשיר תאי אב לבביים בזרימה ציטומטרית באמצעות מדווחים פלואורסצנטיים שהונדסו לתוך קווי תאי הגזע העובריים.

גזירה של תאי לב ותאים מתאי גזע עובריים

למדו טכניקת תרבית תאים לעשרת תאי עצם נוירונליים מתוך תאי מסטroma מוח עצם ולהפיכתם לתאי שוואן בוגרים. שיטה זו משפרת טיפול אוטולוגי בשחזור עצבים פוסט-טראומטיים.

Hypoxic Preonditioning של תאים יליד מארו נגזר כמקור לדור של תאים שוואן בוגרת

גלה סרטונים נוספים