Hypoxic Preonditioning של תאים יליד מארו נגזר כמקור לדור של תאים שוואן בוגרת

המטרה הכוללת של טכניקת תרבית תאים זו היא להעשיר את האבות העצביים של מח העצם כדי להקל על התמיינותם לתאי שוואן פונקציונליים. שיטה זו מטפלת בסוגיית מפתח בתאי גזע וברפואה רגנרטיבית: כיצד להשתמש במקור מוגבל של אבות עצביים ליצירת גליה כדי לסייע בצמיחה מחדש של אקסונל פוסט-טראומטי ורמיאלינציה. יתרון בטכניקה זו הוא השימוש בהתניה יעילה של תרבית כדי להקל על התרחבות תאים עצביים מתאי סטרומה של מח העצם לשימושם בטיפול בתאים אוטולוגיים.

לאחר יומיים בתרבית, הסר 75% מהמדיום המושקע והתאים הלא נדבקים ושטוף את התאים הדבקים בשלוש שטיפות PBS של 10 מילימטר. לאחר הכביסה השלישית, החלף את ה- PBS ב -10 מיליליטר של תאי סטומל מח, או MSC, מדיום גידול והחזיר את התרבות לחממה. מושבות גלויות אמורות להופיע ביום השישי עד השביעי.

ביום 10 יש לשטוף את התרבית ב- PBS טרי ולנתק את התאים עם 1.5 מיליליטר של מגיב דיסוציאציה אנזימטי רקומביננטי. לאחר חמש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, הוסף שלושה מיליליטר של מצע גידול MSC כדי לנטרל את התגובה ולאסוף את התאים המנותקים על ידי צנטריפוגה. השעו מחדש את הגלולה בחמישה מיליליטר של מצע גידול MSC טרי וזרעו את התאים בצפיפות של ארבע פעמים 10 עד רביעית לסנטימטר רבוע בצלחת תרבית רקמה חדשה של 10 סנטימטרים.

התאים צריכים להגיע למפגש של 80 עד 90% תוך יומיים מהמעבר. למיזוג מוקדם היפוקסי, שחרר תחילה את מהדק הטבעת ונקה את החלקים החשופים עם 70% אתנול. פרק עוד יותר את תא ההיפוקסיה לרכיבים והנח אותם במכסה זרימה למינרי לעיקור באור UV למשך 15 דקות.

לאחר מכן, שטפו תרבית MSC של 80 עד 90% עם 10 מיליליטר PBS כפי שהודגם זה עתה וטפלו בתרביות עם מדיום גידול MSC טרי בתוספת 25 מילימולארי. הנח את התרבית המטופלת בתא ההיפוקסיה שהורכב מחדש והדק את מהדק הטבעת. אטום את הקצוות המחברים של החדר כדי להבטיח שאין דליפת גז ושטוף תערובת גז של 99% חנקן ו-1% חמצן לתוך החדר בקצב זרימה של 10 ליטר לדקה.

לאחר חמש דקות, הכניסו את החדר לחממת תרבית התאים למשך 16 שעות. למחרת בבוקר, נתק את התאים כפי שהודגם זה עתה ואסוף אותם באמצעות צנטריפוגה. השעו מחדש את הגלולה במדיום אב עצבי וזרע שש פעמים 10 עד שלישי תאים לסנטימטר רבוע על צלחות 6 בארות בעלות חיבור נמוך לתרבית שלהם ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 12 ימים.

יש להקפיד על כדורי תאים גדולים שאינם נדבקים עד היום השישי עד השביעי. עם יותר נוירוספרות ניכרות בתרבויות מותנות היפוקסיה מאשר אלה תחת נורמוקסיה בימים 10 עד 12. ביום ה-12, השתמשו בפיפט של 10 מיליליטר כדי להעביר את הנוירוספרות לצינור חרוטי של 15 מיליליטר ולאסוף את הנוירוספרות על ידי צנטריפוגה.

השעו מחדש את הכדורים ב-DMEM/F12 וצלחו 5 עד 10 נוירוספרות לסנטימטר רבוע על למינין מצופה פולי-D-ליזין 6 לוחות באר ב-1.5 מיליליטר של מדיום אינדוקציה גליאלי לבאר. שמרו על תרבית תאי הכדור למשך שבעה ימים לפחות, רעננו את המדיום כל שלושה ימים. כדי לקצור את גרעיני השורש הגביים, העבירו את העובר הראשון לצלחת תרבית של 10 סנטימטרים המכילה PBS בטמפרטורת החדר תחת מיקרוסקופ מנתח במצב נוטה והכניסו מלקחיים מיקרו-מנתחים משני צידי חוט השדרה.

באמצעות דיסקציה קהה, הפרד את חוט השדרה מהרקמה הרכה שמסביב באמצעות מלקחיים כדי לכרות את חוט השדרה לאורך פתח הצוואר ובדל הזנב. הסר את שאריות הרקמה הרכה מחוט השדרה המשוחרר עד שיישארו רק חוט השדרה, שורשי העצבים וגנגליון השורש הגבי המחובר. נתק את גרעיני השורש הגבי הבודדים משורשי העצבים המחברים שלהם.

לאחר מכן, השתמש בעט פיפט המצויד בקצה פיפט מיליליטר אחד כדי להעביר עד 100 גרעיני שורש גב לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר של PBS. אסוף את הגרעינים על ידי צנטריפוגה והשהה מחדש את הכדורים ב-200 מיקרוליטר של מגיב דיסוציאציה של תאים אנזימטיים רקומביננטיים לכל צינור. לאחר 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, צנטריפוגה שוב את גרעיני השורש הגבי באמצעות קצה פיפט של 200 מיקרוליטר כדי לשלש בעדינות את הכדורים במדיום תחזוקת נוירוני גנגליון שורש גבי.

זרע את תאי הגנגליון של שורש הגב בחמש פעמים 10 עד התאים השלישיים לסנטימטר רבוע על למינין מצופה פולי-D-ליזין 6 לוחות באר ב-1.5 מיליליטר של מדיום תחזוקת נוירוני גנגליון שורש גבי לכל באר. לאחר יומיים בתרבית ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2, שטפו את התאים והחזירו את תרביות התאים העצביים לחממה במדיום טיהור נוירונים גנגליון שורש גבי טרי למשך יומיים נוספים. לאחר שלושה עד ארבעה מחזורי תחזוקה וטיהור, תרביות תאי גנגליון שורש הגב אמורות להיבדק חיוביות לסמן העצבי Tuj-1 ושליליות לסמן תאי הגליה S100 beta.

ביום השביעי של תרבית התאים דמויי התאים של שוואן, שטפו את התאים ב-PBS ואחריו דיסוציאציה עם 0.5 מיליליטר של ריאגנט דיסוציאציה אנזימטי רקומביננטי לבאר ב-37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. השעו מחדש את כדור התא במדיום של תרבית משותפת וזרעו את התאים דמויי תאי שוואן על תרבית הנוירונים של גנגליון השורש הגבי המטוהר בבת אחת 10 עד תאים שלישיים לסנטימטר רבוע למשך 14 ימים של תרבית משותפת ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2. MSCs בריאים מציגים מורפולוגיה מחודדת בניגוד למראה המרובע של MSCs שנשמרו במשך מספר רב של מעברים ואיבדו את המולטיפוטנטיות שלהם.

מושבות MSC מורחבות צריכות להדגים את הביטוי של סמני MSC, היעדר סמני תאי גזע המטופויאטיים ואת היכולת להתמיין לשושלות אדיפוגניות, אוסטאוגניות וכונדרוגניות. תרבית MSC בריאה שהייתה נתונה להתניה מוקדמת היפוקסית, מדגימה נוירוספרות גדולות יותר הן במספרן והן בגודלן. ניתן לאשר את טוהר רשת הנוירונים של גנגליון השורש הגבי על ידי ביטוי הסמן העצבי Tuj-1 והיעדר סמן תאי שוואן S100.

לאחר 14 יום בתרבית משותפת עם נוירונים של גנגליון שורש גבי, תאים דמויי תאי שוואן רוכשים את התכונות והתכונות התפקודיות של תאי שוואן בוגרים המחויבים לגורל. לאחר השליטה, ניתן להרחיב את תת-אוכלוסיית האב העצבי ב-BMSCs אנושיים או חולדות תוך 10 ימים אם טכניקת הרחבת התאים מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לאשר שדגימת ה-BMSC ניחנה באבות עצביים חיוביים לנסטין והאבות ההמטופויאטיים החיוביים ל-CD45 הוסרו כולם.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשיג BMSCs, להעשיר עבור תת-אוכלוסיית האב העצבי, ולכוון את התמיינות האב העצבי לתאי שוואן מחויבים לגורל לשימוש בשיפור צמיחה מחדש ורמיאלינציה אקסונלית פוסט-טראומטית. בעקבות הליך זה, ניתן להפיק גליה מיאלינית, כגון תאי שוואן בוגרים, לשימושם בפיתוח טיפולים לפציעות ומחלות של מערכת העצבים ההיקפית והמרכזית כאחד.