פיתוח HiPSC נגזר סרום חינם גופים embryoid לחקירת 3-D תא תרבויות גזע באמצעות מבחנים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה עבור גופי העוברים החופשיים בסרום iPSC אנושי תלת מימדי, היא לספק מערכת חוץ גופית המתקרבת להתפתחות קליפת המוח המוקדמת האנושית, שיכולה לשמש לגילוי תרופות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום תאי הגזע כגון, כיצד נוירונים נובעים מ-iPSCs, יוצרים רשתות פונקציונליות ברקמה תלת-ממדית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לנו למדל היבטים של התפתחות קליפת המוח בצלחת, מרקמה אנושית המכילה גנטיקה של אנשים חולים, ובכך המערכת משמשת כפלטפורמה מבוססת תאים לסינון תרופות הניתנת להרחבה וניתן להשתמש בה לחקר הפרעות נוירוביולוגיות רבות ושונות.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הפרעות נוירוביולוגיות או התפתחות נוירולוגית, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות, כגון אלה המתמקדות במודלים של תפקוד נוירו-אימוני או מידע עצבי. עבור פרוטוקול זה, התחל בהקמת תאים עובריים. כדי לבסס תרבית זו, צלחו 600,000 תאי עובר לכל באר של צלחת שש בארות, עם 300 מיליליטר מדיום לבאר.

לאחר תרבית תאי העובר במשך 48 שעות, החלף את המדיום. דוגרים על הצלחות למשך שעה, תוך הכנת תאי הגזע. הפשירו את תאי הגזע באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר ההפשרה, העבירו את התאים לצינור חרוטי של 15 מיליליטר ומלאו את הצינור לחמישה מיליליטר במדיום תרבית, בתוספת טיפה. לאחר מכן, צנטריפוגה בעדינות את התאים למשך ארבע דקות, שאפו את הסופרנטנט והשעו בעדינות את הגלולה במיליליטר אחד של מדיום תאי גזע עם מעכב ROCK. לאחר כימות צפיפות התאים, צלח 300,000 תאי גזע על תאי ההזנה.

לאחר מכן גדל והרחיב את התרביות, בחר מעת לעת תאים בריאים, לאחר הרחבה והקפאת תאים לגיבוי. גדל את מושבות תאי הגזע על צלחות סטנדרטיות עד שהן מגיעות למפגש של 50% עד 70%. לאחר מכן, השתמש בטיפול אנזימטי קל וטריטורציה עדינה עם קצה הפיפטה של מיליליטר אחד כדי לקצור את ה-hiPSCs להתמיינות תאים מבשרים עצביים.

צנטריפוגה בעדינות את המתלים, שאפו את הסופרנטנט ותלו מחדש את הגלולה במדיום iPSC אנושי של חמישה מיליליטר. לאחר מכן, העבירו את תרחיף התאים לצלחת תרבית תאים מצופה ג'לטין של 0.1% באורך חמישה סנטימטרים, ודגרו על הצלחת למשך שעה. לאחר שעה, העבירו את התאים הלא נדבקים לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר.

לאחר מכן שוטפים בעדינות את הצלחת בשלושה מיליליטר בינוני ומעבירים אותה לאותו צינור. לאחר מכן, חזור על שלב ההשעיה מחדש עם צנטריפוגה עדינה, ולאחר מכן, קבע את צפיפות התאים וצלחת את התאים לצלחת תחתונה V של 96 באר, הידבקות נמוכה ב-9,000 תאים לבאר. כעת, סובב את הצלחת במשך שלוש דקות והתחל לגדל את התאים.

במהלך 14 הימים הבאים, כל יומיים החליפו חצי מדיום במדיום מבדיל טרי. לאחר שבועיים של תרבית התאים, הכינו שש צלחות באר עם תוספות תרבית תאים של 40 מיקרון ומיליליטר אחד של מדיום DM1. דגרו על צלחות אלה לפחות ארבע שעות לפני הוספת התאים המתורבתים.

לאחר מכן, בעזרת קצה פיפטה ברוחב 200 מיקרוליטר, אספו אגרגטים של תאים בני שבועיים בשווי של כ -20 מיקרוליטר בינוני. העבירו ארבעה עד שישה אגרגטים על כל תוספת עם תמיסה מינימלית, הסירו עודפים. במהלך שלב זה, חשוב לעבוד במהירות וביד יציבה, תוך הסרת מדיום מסביבת SFEBs, ייתכן שתראה את ה-SFEBs נעים על פני התמיסה עקב מתח פנים.

זה בסדר למקם אותם מחדש לאחר הסרת המדיום. לאחר שכל האגרגטים נטענים על תוספות, החליפו את המדיום למיליליטר אחד של DM2 והמשיכו לגדל את התאים כל יומיים. החלף שלושה רבעים מהמדיום במדיום טרי.

לאחר 14 יום של תרבית, התחל להוסיף מדיום DM3 לתרביות. המשיכו בתרבית במשך 16 ימים נוספים כדי לגדל את ה-SFEBs. כעת נתק בעדינות את ה-SFEBs מהתוספת, באמצעות קצה פיפטה ברוחב 200 מיקרוליטר.

העבירו את ה-SFEBs ל-12 צלחות באר, והעמיסו ארבע עד שמונה לבאר. לאחר מכן, הכתים אותם כמתאר בפרוטוקול הטקסט. להכנת 12 הבאר ושמונה הצלחות, יש לשטוף אותם תחילה שלוש פעמים במים סטריליים.

לאחר מכן, שטפו אותם פעם אחת עם 75% אתנול ופעם נוספת עם 100% אתנול. לאחר מכן, אופים את הצלחות בחום של 50 מעלות צלזיוס במשך ארבע עד חמש שעות הפוכות, כדי להשלים את תהליך העיקור. לאחר האפייה מוסיפים לכל באר 500 מיקרוליטר של תמיסת 0.2% PEI ונותנים לצלחת לשבת בטמפרטורת החדר למשך שעה.

לאחר מכן, שאפו את ה-PEI ושטפו את הבארות ארבע פעמים במים המזוקקים הסטריליים וייבשו אותם באוויר למשך הלילה. למחרת מכינים למינציה טרייה בבינוני L15 ומוסיפים 10 מיקרוליטר למרכז כל באר. לאחר מכן, הוסיפו מים מזוקקים למאגרים שמסביב כדי למנוע אידוי ודגרו על הצלחת למשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

הקפד להקרין את הלמינציה במרכז האלקטרודות, היזהר לא לחרוג מהחלל של אלקטרודות ההארקה, אם חורג מחלל זה, נוירונים יגדלו מעל אלקטרודות ההארקה, ויגרמו לחפצי רעש וישפיעו על נאמנות ההקלטה. כעת, הוסף SFEB מוכן אחד לכל באר, באמצעות יניקה עדינה עם פיפטה רחבה. לאחר מכן, הוסיפו 200 מיקרוליטר DM2 לכל באר ותרבבו את הצלחת למשך הלילה.

מאוחר יותר, כדי לתעד את הפעילות העצבית, הכניסו צלחת לקורא הצלחות. מחממים אותו ל -37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, השתמש בתוכנה כדי לתעד 10 דקות של פעילות מכל באר.

SFEB גדל בשיטה המתוארת, רקמה מניבה בעלת מאפיינים מורפולוגיים הדומים לאזור תת-חדרי קליפת המוח המתפתח מוקדם גדוש בנוירונים חיוביים נרחבים של Tuj1, כמו גם אבות נוירולוגיים. שושנות קליפת המוח המתפתחות רבות נצפו בשכבות החיצוניות ובשכבות הפנימיות של הגופים. הקצה החיצוני של הגופים דומה לצלחת קליפת המוח המתפתחת המכילה נוירונים פוסט-מיטוטיים, זה נתמך על ידי ביטוי של Brn2, סמן לאבות עצביים ולשכבות קליפת המוח החיצוניות הגחונות ביותר.

השכבות החיצוניות מכילות גם תאים חיוביים של רילין שעשויים להיות תאי גרץ מזדמנים או אבותיהם. הגופות גם ביטאו סמנים התואמים את מקורם של הגנגליונים המעורבים והגנגליונים המדיאליים. מבוסס על הביטוי של סמני TF2 ו- Nkx2.1 מבושלים.

ה-SFEBs המתורבתים מניבים הן ב-CalR והן ב-CalB חיוביים. כמו גם, נוירונים מעוררים חיוביים VGLUT ואבות עצביים גלוטמטרגיים חיוביים Tbr1. בהתאם לדיווחים אחרים, 61% מהתאים מהגוף היו חיוביים ל-VGLUT ו-43% היו חיוביים ל-Tbr1.

הקלטות MEM שנעשו מהגופות, ניתנות לצילום לפרקי זמן ארוכים וההקלטות הראו התפתחות של התפרצות ברמת הרשת בקליפת המוח. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לגדל SFEBs מ-iPSCs אנושיים, לאפיין את תכולת העצבים של רוזטות קליפת המוח המתפתחות בענישה עם NSFEBs. ולבצע בדיקות נוירופיזיולוגיות על SFEBs מתבגרים.

באופן כללי, אנשים חדשים בשיטה הזו עשויים להתקשות מאחר שלוקח זמן ותרגול לפתח את השדה המדעי הדרוש להתנהגות של iPSCs ושל iPSC כדי להגיע לתאי עצב בתרבית. יש לעקוב אחר התאים המתורבתים מדי יום. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו הדמיית סידן על מנת לענות על שאלות נוספות, כגון מה טיפולים תרופתיים עשויים לעשות לתנודות רשת קליפת המוח.