לא פולשנית דגימה של נוזל שורות Mucosal עבור כימות של In Vivo דרכי הנשימה העליונות החיסון-מגשרת רמות
7 באוגוסט 2017
פרוטוקול זה מתאר שיטה לא פולשנית עבור הדגימה של נוזל ללא הפרעה של שורות mucosal של דרכי הנשימה העליונות. זה יכול לשמש כדי לבצע כימות של ויוו רמות של חלבונים מתווכים, כגון ציטוקינים, נוגדנים, המקצועות לכל הגילאים.
המטרה הכללית של שיטה זו לדגימת נוזל ציפוי רירי היא לחקור את החתימה החיסונית המקומית של דרכי הנשימה ללא צורך בהליכי גרייה. שיטה זו מאפשרת לחקור שאלות מפתח בתחום מחלות נשימה בילדים, כגון זיהומים, אסטמה ואלרגיה. יתרונות השיטה הם היכולת למדוד רמות נמוכות מאוד של מתווכי חיסון ברירית דרכי הנשימה הבלתי מגורה in vivo.
הדגמת הפרוצדורה תבוצע על ידי Dr.Wolsk. לצורך איסוף דגימות מילודים, ראשית גזרו לפחות שני פסים של 3 על 15 מילימטר מדפי מסנן פוליאסטר הידרוקסילתיים סיביים. לאחר מכן, הניחו את היילוד על מיטה והבחירו אם קיימים תסמינים של זיהום בדרכי הנשימה.
לאחר מכן, השתמשו בפינצטה כדי להחדיר פיסת נייר סינון אחת למרחק של כסנטימטר אחד אל החלק הקדמי של הקונכיה התחתונה בכל נחיר של התינוק, והגisho למחולל מים מתוקים לנוחותו במידת הצורך. שימו לב לכל עיטוש, בכי מתמשך או איפיסטקסס (דימום מהאף) המתרחשים במהלך תקופת הדגימה. לאחר שתי דקות של ספיגה, העבירו את ניירות הסינון לשפרובית מסומנת לאחסון מיידי בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס.
ליסבת' רוסהולם, טכנאית במעבדה שלי, תדגים את ההליך הניסויי. לצורך כימות מתווכי חיסון בדרכי הנשימה, העבירו עד 10 דגימות מאחסון בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס אל קרח ורשמו את מספרי הזיהוי שלהן. לאחר הפשרת הדגימות, טבולו את שני ניירות המסנן של כל נבדק ב-150 מיקרוליטר של בופר שהוכן טרי לכל נייר מסנן, בתוספת טבלית אחת של מעכב פרוטאז שלם לכל 25 מיליליטר של תמיסת בופר מלאי.
העבירו את הדגימות למנער פלטות במהירות של 400 rpm למשך חמש דקות. העבירו את התמיסת בופר ואת ניירות הסינון לכוסות של מסנני צינורות מתאצטט צלולוז אינדיבידואליים. ביצעו סנטריפוגה לדגימות כדי לאסוף את תמצית האף המסוננת בתחתית מבחנות המיקרו-צנטריפוגה.
לאחר מכן, הסירו את הכוסות והניחו את המבחנות על קרח. כעת, העבירו מנות של 150 µL של תמצית האף לבארות בודדות בלוחות אחסון בעלי קישור חלבון נמוך (low protein binding storage plates), ואחסנו את הלוחות בטמפרטורה של 80- °C עד למועד הניתוח. לאחר מכן, מדדו את ריכוז המתווכים החיסוניים של האף הרלוונטיים באמצעות מערך Multiplexed מבוסס electrochemiluminescence ברגישות גבוהה, בהתאם לפרוטוקולי בדיקה סטנדרטיים.
בניתוח מייצג זה של 620 רכיביו של רכיב הניאונטלים, רוב המתווכים החיסוניים שנמדדו הראו רמת גילוי נמוכה. רמות IFN gamma היו מתחת לסף הגילוי התחתון בכמעט מחצית מהדגימות, בעוד שרמות TNF alpha, CCL4 ו-TGF beta היו מתחת לסף הגילוי התחתון בפחות מ-1% מהדגימות. מולטי-קוליניאריות חזקה הייתה ניכרת עבור 20 רמות המתווכים שזוהו, כפי שמוצג במפת החום.
בקרב רכים בחיים אסימפטומטיים המודבקים בפיקורנאווירוס (picornavirus), נצפתה פרופיל מוגבר המורכב בעיקר ממתווכי חיסון מסוג 1, דבר המרמז על תפקיד של חיידקים ווירוסים מקולוניזציה בהפעלת מערכת החיסון בשלב המוקדם ביותר של החיים. כמו כן, נקבע קשר בין נוכחותם של אחים בבית בעת הלידה לבין תגובה חיסונית רירית ספציפית המכוונת לסוג 1 וסוג 17, עם ראיות לקורלציה של תופעה זו עם אפקט של הכשרה חיסונית בעובר (in utero immune priming), אשר נמצא במתאם הפוך לזמן שחלף מאז הלידה האחרונה. בנוסף, ילדים שנולדו לאמהות שקיבלו תוספים במינון גבוה לעומת פלצבו התאפיינו בהגברה של מתווכי חיסון ספציפיים, דבר המצביע על כך שוויטמין D מקדם תגובה חיסונית אנטי-בקטריאלית ללא קשר לזו המושרה על ידי וירוסים, חיידקים, אחים או אטופיה אימהית.
ניתן להשתמש בשיטה זו לדגימה מיקרוסקופית גם באמצעות ברונכוסקופ, דבר המאפשר לחקור את המתווכים החיסוניים בדרכי הנשימה התחתונות. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכישו הבנה טובה לגבי אופן מדידת המתווכים ברירית דרכי הנשימה הבלתי מגורה in vivo בניונובטים ובילדים גדולים יותר.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר טכניקה לא פולשנית לדגימה של נוזל רירית לא מופרע מדרכי הנשימה העליונות. הוא מאפשר כימות של רמות in vivo של מתווכי חלבון, כגון cytokines ו-chemokines, בנבדקים בכל הגילאים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מחלות נשימה
- אימונולוגיה
- פדיאטריה
רקע
- שיטה זו בוחנת את החתימה החיסונית המקומית של דרכי הנשימה ללא הליכי גרייה.
- היא ישימה למחלות נשימה בילדים, כגון זיהומים, אסתמה ואלרגיה.
- הטכניקה מאפשרת מדידה של רמות נמוכות של מתווכי חיסון ברירית דרכי נשימה שאינה מגורה in vivo.
- הדגמת הפרוצדורה מבוצעת על ידי ד"ר Wolsk.
מטרת המחקר
- לבדיקת התגובה החיסונית ברירית דרכי הנשימה.
- לספק תובנות לגבי מצבים נשימתיים בילדים.
- להקל על טכניקות דגימה לא פולשניות למטרות מחקר.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- איסוף נוזל רירית מהדרכים הנשימיות העליונות.
- שימוש בגילי סינון מפוליאסטר הידרוקסילאטי סיבי לאיסוף דגימות.
- מעקב אחר תסמינים של זיהום בדרכי הנשימה בילודים.
- כימות של ציטוקינים וכימוקינים בדגימות שנאספו.
תוצאות עיקריות
- איסוף מוצלח של נוזל רירית ללא פרוצדורות פולשניות.
- יכולת למדוד מתווכי חיסון in vivo.
- תובנות לגבי הפרופיל החיסוני של מטופלים פדיאטריים.
- יישומים פוטנציאליים בהבנת מחלות נשמתיות.
מסקנות
- שיטת הדגימה הבלתי פולשנית יעילה לחקר החסינות של דרכי הנשימה.
- טכניקה זו יכולה לשפר את המחקר בתחום בריאות הנשימה של ילדים.
- מחקרים עתידיים עשויים להרחיב את הממצאים הקשורים למתווכי חיסון.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו לדגימה לא פולשנית של נוזל רירית המגנה מאפשרת כימות ישיר של מתווכי חיסון in vivo ברירית דרכי הנשימה העליונות ללא גירוי, ובכך מספקת מדד רלוונטי פיזיולוגית לפעילות החיסונית בדרכי הנשימה. הטכניקה תומכת בפרופיל חיסוני בשלבי חיים מוקדמים ובניטור לאורך זמן, ובכך מסייעת בהפחתת סיכונים מנגנוניים בפיתוח טיפולים נשימתיים על ידי קישור חשיפות גנטיות וסביבתיות לפנוטיפים חיסוניים. יישומה בקוהורטות של ילודים וילדים מציע ערך ניבוי עבור אנדוטיפינג (endotyping) וניטור התקדמות מחלה, במיוחד בהקשרים של אסתמה, אלרגיה ומחלות זיהומיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי מדידת רמות בסיס ורמות מושראות של מתווכי חיסון ברקמה רירית שאינה מעוררת.
- ערך תפעולי: מספק מטריקס הניתן לשחזור ופולשני במינימום עבור תיקוף תפקודי של מטרות באוכלוסיות ילדים.
- ערך ניבוי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות קורלציה בין פרופילי מתווכים לבין פנוטיפים קליניים, כגון זיהום נגיפי אסימפטומטי והשפעות של חשיפה דרך אחים.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay Development)
- מוכנות לבדיקה: מייצר דגימות חלבון שנסחפו (eluted), התואמות למערכי Multiplex של אלקטרו-כימילומינצנציה ברגישות גבוהה לצורך פרופיל חיסוני כמותי.
- סטנדרטיזציה: משתמש בפרוטוקולי ספיגה ושטיפה עקביים של נייר סינון כדי להבטיח השגה (recovery) הדירה של אנליטים בין נבדקים ונקודות זמן שונות.
- יכולת הרחבה (Scalability): הוכח כי השיטה ישימה בקוהורטים גדולים של רכים ליום (n=620), דבר התומך ביישומים של סריקה בספיקה גבוהה במחקרים אפידמיולוגיים ומחקרים התערבותיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מאפשרת דגימה לאורכית מרגע הלידה ועד הילדות, ומקשרת בין חתימות חיסוניות בשלב מוקדם של החיים לבין תוצאות של מחלות נשימתיות בשלב מאוחר יותר.
- סנכרון סממנים ביולוגיים: מזהה עלייה בביטוי (upregulation) של מתווכי חיסון מסוג 1 ומסוג 17 בילודים נגועים בפיקורנו-וירוס ללא תסמינים, מה שמצביע על תועלת בזיהוי אנדוטיפים חיסוניים.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: חושפת קשרים בין תוספת ויטמין D אימהית לבין תגובות חיסוניות אנטי-בקטריאליות, ובכך תומכת בתעדוף מטרות להתערבויות אימונו-מודולטוריות.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת בשלב הביולוגיה של הגילוי על ידי כך שהיא מאפשרת מדידה ישירה של מתווכי חיסון in vivo, ובכך מספקת מידע לבחירת מטרה ולהבהרת מסלולים לפני זיהוי מולקולת מובילה (lead).
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי הפעלת מסלולים חיסוניים ברקמה רירית ללא מניפולציות ex vivo או ארטיפקטים של גרייה.
- סריקה: מייצר תמציות (eluates) סטנדרטיות המתאימות לקריאות של בדיקות חיסוניות מרובות (multiplex immunoassay), דבר המקל על ניתוח השוואתי בין קבוצות טיפול או חשיפה.
- אנליטיקה: מייצר רמות כמותיות של מדיאטורים המאפשרות הערכה סטטיסטית של קולינאריות, פעילות רשת חיסונית וקשרי פנוטיפ.
- מחקר תרגומי: מקשר בין פרופילים חיסוניים של ילודים לבין תסמינים נשימתיים בילדות וחשיפות סביבתיות, ובכך תומך בהחלטות קידום מבוססות רמות סיכון.
- שימוש חוזר ארגוני: מהווה טכניקת דגימה תואמת-פלטפורמה, הישמה במגוון מודלים של מחלות נשימה ושיטות טיפוליות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה על ידי לכידה של פעילות חיסונית אנדוגנית במיקרו-סביבה רירית טבעית.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזור באמצעות נהלי איסוף, אלוציה ואחסון סטנדרטיים, ובכך מצמצם שונות פרה-אנליטית.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי קישור מנגנונים אימונומודולטוריים לחתימות חיסוניות בשלבים מוקדמים של החיים, ובכך מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בתוכניות נשימתיות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מועמדים מותאם-סיכון על בסיס השפעות מוכחות על מסלולים חיסוניים ריריים במודלים אנושיים רלוונטיים ואורכיים.
שיקולי יישום
- נדרשת הכשרה באנטומיה של דרכי הנשימה של יילודים ובטכניקת דגימה עדינה כדי להבטיח את נוחות הנבדק ואת שלמות הדגימה.
- תלוי בגישה לפתעות סינון אולטרה (ultrafilter tubes), לנעורי פלטות (plate shakers) ולתשתית של בדיקת אימונו-סבסבסנציה (electrochemiluminescence immunoassay) לזיהוי האנליט.
- מחייב הכנה סטנדרטית של תמיכה (buffer) עם מעכבי פרוטאז כדי למנוע פירוק של המתווכים במהלך החילוץ.
- נדרש התאמה של משך הדגימה או גודל המסנן כאשר הפרוטוקול מיושם על ילדים מבוגרים יותר או על אתרים ריריים חלופיים.
- מוגבל על ידי שכיחות האנליט, כאשר חלק מהמתווכים נמצאים לעיתים קרובות מתחת לסף הגילוי, מה שמחייב אופטימיזציה של רגישות הבדיקה עבור מטרות בעלות ביטוי נמוך.
