לא פולשנית דגימה של נוזל שורות Mucosal עבור כימות של In Vivo דרכי הנשימה העליונות החיסון-מגשרת רמות
August 7th, 2017
פרוטוקול זה מתאר שיטה לא פולשנית עבור הדגימה של נוזל ללא הפרעה של שורות mucosal של דרכי הנשימה העליונות. זה יכול לשמש כדי לבצע כימות של ויוו רמות של חלבונים מתווכים, כגון ציטוקינים, נוגדנים, המקצועות לכל הגילאים.
המטרה הכוללת של שיטת דגימת נוזל רירית זו היא לחקור את החתימה החיסונית המקומית של דרכי הנשימה ללא צורך בהליכי גירוי. שיטה זו מאפשרת לך ללמוד שאלות מפתח בתחום מחלות נשימה בילדים כמו זיהומים, אסטמה ואלרגיה. היתרונות של השיטה הם שניתן למדוד רמות נמוכות מאוד של מתווכים חיסוניים ברירית דרכי הנשימה הלא מגורה in vivo.
הדגמת ההליך תיעשה על ידי ד"ר וולסק. לאיסוף מדגם יילודים, ראשית לחתוך לפחות שתיים רצועות שלוש על 15 מילימטר מיריעות סינון פוליאסטר הידרוקסיל סיביות. לאחר מכן, הניחו את היילוד על מיטה ושימו לב לכל תסמינים של זיהום בדרכי הנשימה.
לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי להכניס פיסת נייר סינון אחת כסנטימטר אחד לחלק הקדמי של הטורבינת התחתונה של כל נחיר של התינוק ולתת מי סוכר ליילוד לנוחות לפי הצורך. שימו לב לכל התעטשות, בכי מתמשך או אפיסטקסיס המתרחשים במהלך תקופת הדגימה. לאחר שתי דקות של ספיגה, העבירו את ניירות הסינון לצינור מסומן לאחסון מיידי בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס.
מי שתדגים את הליך הניסוי תהיה ליסבת רוזהולם, טכנאית במעבדה שלי. לכימות מתווך חיסוני של דרכי הנשימה, הניחו עד 10 דגימות מאחסון שלילי של 80 מעלות צלזיוס על קרח ורשמו את מספרי הזיהוי שלהן. לאחר שהדגימות הופשרו, טבלו את שני ניירות הסינון לכל נבדק ב-150 מיקרוליטר של חיץ טרי שהוכן לכל נייר סינון, בתוספת טבליה אחת שלמה של מעכב פרוטאז לכל 25 מיליליטר של תמיסת מלאי חיץ.
מעבירים את הדגימות לשייקר צלחת ב -400 סל"ד למשך חמש דקות. העבירו את ניירות המאגר והסינון לכוסות של מסנני צינור אצטט תאית בודדים. צנטריפוגה את הדגימות כדי לאסוף את תמצית האף המסוננת בתחתית צינורות המיקרו-צנטריפוגה.
לאחר מכן, הסר את הכוסות והניח את הצינורות על קרח. לאחר מכן, העבירו 150 מיקרוליטר של תמצית האף לבארות בודדות של צלחות אחסון נמוכות חלבון ואחסנו את הצלחות בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס עד לניתוח. לאחר מכן, מדוד את ריכוז המתווכים החיסוניים באף המעניינים על ידי מערך מרובה מבוסס אלקטרוכימילומינסנציה ברגישות גבוהה על פי פרוטוקולי בדיקה סטנדרטיים.
בניתוח מייצג זה של 620 יילודים, רוב המתווכים החיסוניים שנמדדו הראו רמת זיהוי נמוכה. רמות הגמא של IFN היו מתחת לגבול הזיהוי התחתון בכמעט מחצית מהדגימות, בעוד שרמות TNF alpha, CCL4 ו-TGF beta היו מתחת לגבול הזיהוי התחתון בפחות מ-1% מהדגימות. רב-קולינאריות חזקה ניכרה עבור 20 רמות המתווך שזוהו, כפי שמודגם על ידי מפת החום.
בילודים נגועים בנגיף הפיקורנה ללא תסמינים, נצפה פרופיל מווסת שנפגע בעיקר של מתווכים חיסוניים מסוג 1, מה שמרמז על תפקיד מעורר חיסון של חיידקים ווירוסים מתיישבים בחלק המוקדם ביותר של החיים. נקבע גם קשר בין נוכחות של אחים במשק הבית בלידה, לבין תגובה חיסונית מכוונת ספציפית מסוג 1 מסוג 17 עם ראיות למתאם של תופעה זו עם אפקט תחול חיסוני ברחם שנמצא בקורלציה הפוכה לזמן שחלף מאז הלידה האחרונה. בנוסף, ילדים שנולדו לאימהות שקיבלו תוספי תזונה ברמה גבוהה לעומת פלצבו התאפיינו בוויסות מוגבר במתווכים חיסוניים ספציפיים, מה שמרמז על כך שוויטמין D מקדם תגובה חיסונית אנטיבקטריאלית שאינה תלויה בזו הנגרמת על ידי וירוס, חיידקים, אחים או אטופיה אימהית.
ניתן להשתמש בשיטה זו של מיקרו-דגימה גם באמצעות ברונכוסקופ, המאפשר לחקור את המתווכים החיסוניים בדרכי הנשימה התחתונות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד למדוד מתווכים ברירית דרכי הנשימה הלא מגורה in vivo ביילודים ובילדים גדולים יותר.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר טכניקה לא פולשנית לדגימה של נוזל רירית לא מופרע מהמעברים האוויריים העליונים. היא מאפשרת כימות רמות in vivo של מתווכים חלבוניים, כגון ציטוקינים וכימוקינים, בנבדקים בכל הגילאים.
מרכיבי המחקר העיקריים
תחום המדע
- מחלות נשימה
- אימונולוגיה
- רפואת ילדים
רקע
- שיטה זו חוקרת את חתימת החיסון המקומית של דרכי הנשימה ללא הליכי גירוי.
- היא חלה על מחלות נשימה פדיאטריות כמו זיהומים, אסטמה ואלרגיה.
- הטכניקה מאפשרת מדידה של רמות נמוכות של מתווכים חיסוניים ברירית דרכי הנשימה הלא מגורה in vivo.
- הדגמת ההליך נערכת על ידי ד"ר וולסק.
מטרת המחקר
- לחקור את התגובה החיסונית ברירית דרכי הנשימה.
- לספק תובנות לגבי מצבים נשימתיים פדיאטריים.
- לאפשר טכניקות דגימה לא פולשניות למחקר.
שיטות ששימשו
- איסוף נוזל רירית מדרכי הנשימה העליונות.
- שימוש בגלילי פילטר מפולסטר הידרוקסילי במבנה סיבי לאיסוף דגימות.
- תצפית על תסמינים של זיהום בדרכי הנשימה בתינוקות.
- כימות ציטוקינים וכימוקינים בדגימות שנאספו.
תוצאות עיקריות
- איסוף מוצלח של נוזל רירית ללא הליכים פולשניים.
- יכולת למדוד מתווכים חיסוניים in vivo.
- תובנות לגבי הפרופיל החיסוני של חולים פדיאטריים.
- יישומים פוטנציאליים בהבנת מחלות נשימה.
מסקנות
- שיטת הדגימה הלא פולשנית יעילה לחקר חסינות דרכי הנשימה.
- טכניקה זו יכולה לשפר את המחקר בבריאות נשימתית פדיאטרית.
- מחקרים עתידיים עשויים להרחיב את הממצאים הקשורים למתווכים חיסוניים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This noninvasive mucosal lining fluid sampling method enables direct quantification of in vivo immune mediators in the upper airway mucosa without stimulation, providing a physiologically relevant readout of airway immune activity. The technique supports early-life immune profiling and longitudinal monitoring, facilitating mechanistic de-risking in respiratory therapeutic development by linking genetic and environmental exposures to immune phenotypes. Its application in neonatal and pediatric cohorts offers predictive value for endotyping and monitoring disease progression, particularly in asthma, allergy, and infectious disease contexts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by measuring baseline and induced levels of immune mediators in unstimulated mucosal tissue.
- Operational Value: Provides a reproducible, minimally invasive matrix for functional target validation in pediatric populations.
- Predictive Value: Supports biological de-risking through correlation of mediator profiles with clinical phenotypes such as asymptomatic viral infection and sibling exposure effects.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates eluted protein samples compatible with high-sensitivity electrochemiluminescence multiplex arrays for quantitative immune profiling.
- Standardization: Uses consistent filter paper absorption and elution protocols to ensure reproducible recovery of analytes across subjects and timepoints.
- Scalability: Demonstrated feasibility in large neonatal cohorts (n=620), supporting high-throughput screening applications in epidemiologic and interventional studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Enables longitudinal sampling from birth through childhood, linking early-life immune signatures to later respiratory disease outcomes.
- Biomarker Alignment: Detects upregulation of type 1 and type 17 immune mediators in asymptomatic picornavirus-infected neonates, suggesting utility in identifying immune endotypes.
- Mechanistic De-risking: Reveals associations between maternal vitamin D supplementation and antibacterial immune responses, supporting target prioritization for immunomodulatory interventions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology phase by enabling direct measurement of immune mediators in vivo, informing target selection and pathway elucidation prior to lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of immune pathway activation in mucosal tissue without ex vivo manipulation or stimulation artifacts.
- Screening: Produces standardized eluates suitable for multiplex immunoassay readouts, facilitating comparative analysis across treatment or exposure groups.
- Analytics: Generates quantitative mediator levels that allow statistical assessment of collinearity, immune network activity, and phenotype associations.
- Translational Research: Connects neonatal immune profiles to childhood respiratory symptoms and environmental exposures, supporting risk-stratified advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Represents a platform-compatible sampling technique applicable across respiratory disease models and therapeutic modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by capturing endogenous immune activity in the native mucosal microenvironment.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized collection, elution, and storage procedures, minimizing pre-analytical variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking immunomodulatory mechanisms to early-life immune signatures, reducing late-stage biological risk in respiratory programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on demonstrated effects on mucosal immune pathways in relevant, longitudinal human models.
Implementation Considerations
- Requires training in neonatal airway anatomy and gentle sampling technique to ensure subject comfort and sample integrity.
- Dependent on access to ultrafilter tubes, plate shakers, and electrochemiluminescence immunoassay infrastructure for analyte detection.
- Necessitates standardized buffer preparation with protease inhibitors to prevent mediator degradation during extraction.
- Requires adaptation of sampling duration or filter size when applied to older children or alternative mucosal sites.
- Limited by analyte abundance, with some mediators frequently below detection limit, necessitating assay sensitivity optimization for low-expression targets.
