חיזוי השתקת ג 'ין באמצעות שליטה Spatiotemporal של siRNA שחרור מ תגובה תגובה פולימרית פולימרית

המטרה הכוללת של שיטות אלה היא לא לחזות את יעילות השתקת הגנים בתיווך RNA מפריע קטן ולהקל על השליטה ברמות ביטוי החלבון המתקבלות, באופן זמני מרחבי. שיטה זו יכולה להבהיר מבנה, תפקוד, יחסים וכלי אספקה מגיבים לגירויים. השגת שליטה טובה יותר על קשירה לעומת שחרור, יכולה לפתוח פלטפורמות הניתנות לתרגום וגילוי תרופות, כמו גם טכנולוגיות רפואה רגנרטיבית.

היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שניתן לשלוט ולחזות את השינויים בביטוי הגנים על הבסיס כמבחני שחרור siRNA פשוטים ומודלים קינטיים. למרות ששיטות אלה משתמשות בפולימרים חדשים המגיבים לאור, ניתן להתאים את מערך הבדיקות הזה בקלות לבדיקת המגוון הרחב של מערכות אחרות המגיבות לגירויים. כדי להתחיל, הכינו תמיסת siRNA של 32 מיקרוגרם למיליליטר, על ידי הוספת siRNA לתמיסת HEPES של 20 מיקרו-מולרית ב-pH 6.

לאחר מכן, הכינו תמיסת פולימר על ידי הוספת פולימרים מומסים של mPEG בלוק polyAPN BMA לתמיסת HEPES של 20 מילי-מולרית ב-pH 6. כדי להשיג ריכוז של 220 מיקרוגרם למיליליטר, ריכוז זה יביא ליחס N ל-P של ארבעה, כלומר יהיו פי ארבעה יותר קבוצות אמין על הפולימר מאשר קבוצות פוספט על siRNA. לאחר מכן, הוסף את תמיסת הפולימר טיפה לנפח שווה של תמיסת ה-siRNA, תוך ערבוב עדין במכונת מערבולת.

המשך למערבולת למשך 30 שניות לאחר הוספת פולימר. לאחר מכן, דגרו את הדגימות בחושך בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. הוסף את תמיסת STS לכל תמיסת ננו-נושא טיפה תוך ערבוב עדין במכונת מערבולת.

המשך למערבולת למשך 30 שניות לאחר מהדורת SDS. צנטריפוגה של הדגימות ב-3,000 גרם למשך חמש שניות, ולאחר מכן, דגירה על הדגימות בחושך בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. כיול והגדר לייזר UV עם פילטר 365 ננומטר לעוצמה של 200 וואט למ"ר.

לאחר מכן, חותכים חור לאטם גומי, מניחים את אטם הגומי על מגלשת זכוכית שטופה ומיובשת. העבר את תמיסת ה-SDS הננו-נושאת על החלקת הזכוכית בתוך החור של אטם הגומי. טען עודף תמיסה על מגלשת הזכוכית, תוך הימנעות ממגע עם אטם הגומי.

הנח את מגלשת הזכוכית השנייה על גבי אטם השקופיות. כדי למנוע יצירת בועות אוויר, הנח תחילה קצה אחד של המגלשה כלפי מטה ולאחר מכן, הורד לאט את הקצה השני. חבר תפסי קלסר לכל צד של תא הזכוכית כדי להחזיק אותו קרוב.

הקרינו את הדגימות למשך הזמן הרצוי, באמצעות לייזר UV עם מסנן 365 ננומטר בעוצמה של 200 וואט למ"ר. הסר את תפסי הקלסר ופתח את החדר. לאחר מכן, פיפטה 25 מיקרוליטר מדגימות הננו-נשא המוקרנות SDS על צינורות מיקרו-צנטריפוגה.

דגרו את התמיסות בחושך בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. הוסף חמישה מיקרוליטר של תמיסת חיץ הטעינה ל-25 מיקרוליטר מכל דגימת SDS ננו-נביא. דגרו את הדגימות בחושך בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.

לאחר מכן, טען 30 מיקרוליטר מכל דגימת SDS של ננו-נשא לתוך ג'ל אגרוז של 2%, מוכתם מראש באתידיום ברומיד. הפעל את הג'ל בחושך על 100 וולט למשך 30 דקות. דמיין את הג'ל, באמצעות מערכת הדמיית ג'ל עם מסנני אתידיום ברומיד.

שמור את קבצי תמונת הג'ל והמשך לכימות עוצמת כיפוף כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הסר את פיסות הנייר ממרווח דבק דו צדדי כדי לחשוף את משטח הדבק. חבר את המרווח לתלוש כיסוי זכוכית.

העבר את תמיסת ה-SDS הננו-נשאית על החלקת הכיסוי. לאחר מכן, הנח שקופית זכוכית שטופה מראש על גבי החלקת הכיסוי עם החור מהמרווח הדביק, במרכזו סביב הדגימה. לחץ על מגלשת הזכוכית כדי להבטיח שמגלשת הזכוכית והחלקת הכיסוי מחוברים היטב ויוצרים אטימה.

השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי עם מטרה אפרכרומלית טבולה פי 40 במים, בעל צמצם מספרי של 1.2 למדידות FCS. השתמש בערוץ לייזר העירור המתאים כדי לאסוף לפחות 30 מדידות של 10 שניות כל אחת, לכל דגימה. לאחר מכן, הזן את נתוני שחרור ה-siRNA מ-FCS למודל קינטי כדי לחזות תגובות השתקת גנים, כמפורט בפרוטוקול הטקסט.

כדי להכין משלוח siRNA במבחנה, הוסף תחילה שני מיליליטר של תרחיף תאים לכל באר של צלחת שש הבארות. תנו לתאים להיצמד ולהתאושש במשך 24 שעות באינקובטור. לאחר שטיפת התאים במי מלח חוצצים פוספט, הכינו אותם לטרנסבקציה על ידי הוספת 1.5 מיליליטר של סרום ומדיום טרנסבקציה ללא אנטיביוטיקה.

לאחר מכן, הוסף 25 מיקרוליטר של תמיסת ננו-נשא, המכילה 30 פיקומולים של siRNA tp כל באר. פיפטה בעדינות את המדיום למעלה ולמטה כדי לערבב. מניחים את התאים בחממה למשך שלוש שעות.

הסר את מדיום הטרנסבקציה ושטוף כל היטב עם PBS. לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של מדיום גידול נוסף והניחו את התאים בחממה להתאוששות למשך 30 דקות. כדי להכין את התאים לטיפול בגירוי פוטו, הסר את מדיום הגידול הנוסף.

לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של מדיום טרנסבקציה לכל באר. לאחר כיול לייזר ה-UV כמתואר בפרוטוקול הטקסט, הנח את התאים על פלטה חמה המוגדרת ל-37 מעלות צלזיוס. הסר את הכיסוי מצלחת שש הבארות.

הקרנת התאים מעל הצלחת למשך הזמן הרצוי, באמצעות לייזר UV עם פילטר 365 ננומטר בעוצמה של 200 וואט למ"ר. הסר את מדיום הטרנסבקציה והוסף שני מיליליטר של מדיום גידול משלים. מניחים את התאים באינקובטור עד לניתוח נוסף.

כדי להכין מסכת צילום החוסמת לחלוטין אור של 365 ננומטר וממזערת השתקפויות, תחילה חותכים, מחוררים ו/או מעבדים את הצורה הרצויה לתוך מסכת הצילום. הדביקו את מסכת הצילום לתחתית צלחת שש הבארות, כאשר התבנית מרוכזת על הבאר המכילה את התאים והצד האנטי-רפלקטיבי פונה לצלחת. הקימו שני עמדות טבעת במרחק של כ-25 מטר זה מזה ונתקו פלטפורמה לכל מעמד טבעת, כך שהפלטפורמות יהיו בגובה שווה.

תלו את לוחית התא בין שני המעמדים על ידי הנחת הצלחת על גבי הרציפים. הקרנת התאים מתחת לדגימה למשך הזמן הרצוי, באמצעות לייזר UV עם פילטר 365 ננומטר, בעוצמה של 200 וואט למ"ר. הסר את מדיום הטרנסבקציה והוסף שני מיליליטר של מדיום גידול משלים.

לאחר מכן, הניחו את התאים באינקובטור כדי להתאושש למשך 24 שעות לפחות. דמיין את התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כפי שתואר קודם לכן. מוצגת כאן דוגמה למודלים קינטיים פשוטים של דינמיקת השתקת גנים.

המודל הופעל כדי לחזות את ריכוזי ה-mRNA, החלבון וה-siRNA, כפונקציה של זמן לאחר שחרור siRNA המושרה על ידי פוטו. הכמויות היחסיות של siRNA שהשתחררו בעקבות מינונים שונים של אור, הוזנו כריכוז ה-siRNA הראשוני במודל הקינטי. תחזיות המודל שהתקבלו לרמות ביטוי החלבון היו הסכמה עם רמות הביטוי שנקבעו בניסוי שהושגו באמצעות Western Blotting.

לצורך הדמיה, תאים המבטאים GFP טופלו ב-GFP המכוון ל-siRNA ומסכת צילום אנולרית הונחה על הצלחת לפני ההקרנה כדי ליצור דפוס מעגלי. תאים שהיו מוגנים מפני האור הפגינו עוצמת פלואורסצנטיות שלא ניתן היה להבחין בה מדגימות ביקורת שלא טופלו ב-siRNA ובאור. עם זאת, כמעט כל התאים בתבנית המעגלית לא הראו ביטוי GFP, מה שמעיד על שחרור יעיל של siRNA והפלת גנים.

יתר על כן, השימוש באור הוא טריגר המאפשר ביטוי גנים, שיש לשלוט בו בסולמות אורך תאים. לסיכום, שיטה זו מאפשרת קביעה מהירה של תנאי הקרנה כדי לשלוט באופן מרחבי-זמני בשחרור siRNA ולחזות השתקת גנים אפריורי. שימוש בפרוטוקול זה יעזור להבהיר את יחסי פונקציית המבנה השולטים ביציבות וביעילות של ננו-נשאים.

טכניקה זו עשויה לאפשר יישומים ברפואה רגנרטיבית הדורשת בקרה מרחבית-זמנית על ביטוי גנים. ניסוחים אלה מתאימים גם לטיפול בהפרעות מקומיות כמו סרטן העור, כמו גם הפרעות דרמטולוגיות.