Name: הכנה בינונית של תסיסנית עוברי תמציות עבור ניסויים פרוטאומיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: למדו שיטה פשוטה וזולה להכנת תמציות חלבון מעוברי Drosophila בקנה מידה בינוני. הפרוטוקול מאפשר יישומים פרוטאומיים כמו AP-MS לחקר תקשורת תאית בביולוגיה התפתחותית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לחברי המעבדה Veraksa להערות מועילות על כתב היד והצעות לשיפורים בפרוטוקול. AV נתמך על ידי NIH מענקים GM105813 ו NS096402. LY נתמך על ידי אוניברסיטת מסצ &#39;וסטס בוסטון סנופי Genzyme דוקטורט אחוות.

1. הכנת 5 L כלובי זבוב (כדי להתאים 15 ס&quot;מ צלחות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את החומרים הדרושים: מיכל 5-quart (4.7-L) עם מכסה ( איור 1 א &#39; ), רשת ניילון, סכין גילוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן מעגל בקוטר 12 ס&quot;מ לחתוך חור בחלק התחתון של המיכל באמצעות סכין גילוח ( איור 1 ב ). חותכים חור בקוטר 15 ס&quot;מ במכסה ( איור 1C ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור רשת ניילון לתוך 25 x 25 ס&quot;מ ריבועים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הרשת מעל השפה העליונה של המיכל ולחץ למטה עם המכסה ( איור 1 ג ). ודא את הרשת הוא הדוק ואת המכסה אינו מוטה. הכלוב מוכן להיות מאוכלס עם זבובים (ראה שלב 5.3). </li></ol> 2. הכנת 1 L כלובים זבוב (כדי להתאים 10 ס&quot;מ צלחות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את החומרים הדרושים: מקדחה חשמלית, 3 אינץ &#39;(76 מ&quot;מ) כלי חיתוך ( איור 1E ו Fצורה 1F), צנצנת פלסטיק חד צדדית עם מכסה, רשת ניילון, סכין גילוח, נייר זכוכית, משקפי מגן וכפפות עבודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים 3 אינץ &#39;(76 מ&quot;מ) חורים בתחתית המכסה של צנצנת פלסטיק ( איור 1G ), עם מכסה דפוק בחוזקה על המיכל בעת קידוח. מקם את כלי חיתוך במרכז המעגל כאשר מתחילים לעשות חור. זהירות: ללבוש הגנה על העיניים וכפפות עבודה במהלך שלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליק את הקצוות של החורים עם סכין גילוח ונייר זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור רשת ניילון לתוך 18 x 18 ס&quot;מ ריבועים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הרשת מעל השפה העליונה של הצנצנת ולהדק על ידי הברגה את המכסה על ( איור 1G ). ודא את הרשת הוא הדוק ואת המכסה אינו מוטה. הכלוב מוכן להיות מאוכלס עם זבובים (ראה שלב 5.3). </li></ol> 3. הכנת מיץ תפוחים (AJ) צלחות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 19 גרם אגר ו 1 L של 18.2 MΩ · מים ס&quot;מ לתוך בקבוק 2 L.מוסיפים את הסיר ומערבבים בקצרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיטוי למשך 30 דקות. בינתיים, להפשיר 100% מיץ תפוחים להתרכז מלאי קפוא, ולהכין 10 מ&quot;ל של 10% (משקל / נפח) מתיל 4-hydroxybenzoate פתרון באתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר החיטוי, להתחיל לערבב את אגר על צלחת ומערבבים, ולהוסיף 80 מ&quot;ל של 100% מיץ התפוחים להתרכז 10 מ&quot;ל של 10% (משקל / נפח) מתיל 4-hydroxybenzoate פתרון הבקבוק. בואו להתקרר בטמפרטורת החדר עם ערבוב מתמיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 15 ס&quot;מ צלחות פטרי (עבור 5 כלובים L) או 10 ס&quot;מ צלחות פטרי (עבור כלובים 1 L), כך רמת אגר בכל מנה הוא כ 5 מ&quot;מ עובי. אפשר לחזק בטמפרטורת החדר, לעטוף בשקיות ניילון. לוחות AJ ניתן לאחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך שבועיים. הערה: ניתן לשטוף את הכלים של פטרי ולעשות בהם שימוש חוזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן להדביק שמרים רטובים: לשפוך קצת שמרים יבשים פעיל לתוך מיכל 100 מ&quot;ל עם מכסה שיאפשר ערבוב קל, ולהוסיף מים בכמויות קטנות תוך ערבוב, כדי לקבל עבה אבל מעורבב היטבלְהַדבִּיק. חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 2 שבועות. </li></ol> 4. הכנת ריאגנטים תמוגה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ 5x תמוגה: 250 מ&quot;מ טריס pH 7.5, גליצרול 25%, 1% octylphenoxy פולי (ethyleneoxy) אתנול (IGEPAL CA-630), 7.5 מ&quot;מ MgCl 2 , 625 מ&quot;מ NaCl, 125 מ&quot;מ NaF, 5 מ&quot;מ Na 3 VO 4 . <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך 200 מ&quot;ל: להמיס לחלוטין 1 גרם אבקת NaF ו 184 מ&quot;ג Na 3 VO 4 אבקה ב 71 מ&quot;ל מים עם ערבוב מתמיד. הוסף 50 מ&quot;ל 1 M טריס pH 7.5, 2 מ&quot;ל 100% IGEPAL, 1.5 מ&quot;ל 1 M MgCl 2 , ו 25 מ&quot;ל 5 M NaCl. ואז מוסיפים 50 גליצרול מ&quot;ל (להוסיף האחרון) ולהמשיך לבחוש במשך 1 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן לעקר באמצעות 250-מסנן יחידות מסנן. צעד זה יכול להיות איטי, אבל סינון הפתרון חשוב להסיר חלקיקים מסיסים. Aliquot ידי 10 מ&quot;ל צינורות 50 מ&quot;ל לחנות ב -80 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 M dithiothreitol (DTT) פתרון במים. חנות ב -20 מעלות צלזיוס 1 aliquots מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג פרוטאיןטבליות קוקטייל אסאי, עם חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA). חנות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג 10 מזרקים מ&quot;ל מסננים מזרק: 26 מ&quot;מ קוטר, ללא פעילי שטח תאית אצטט (SFCA), 0.45 מיקרומטר גודל הנקבוביות. </li></ol> 5. אוסף של עוברי זבוב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביר את קווי זבוב מהונדס נושא את החלבון מתויג עניין בקבוקים (כ -100 זבובים לכל בקבוק), ולהעביר את הבקבוקים כל יומיים עד 25-30 בקבוקים הם צברו עבור כל קו לעוף. להגביר את מלאי שליטה ( למשל את קו yw ) בצורה דומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חם AJ צלחות לטמפרטורת החדר (כ 1-2 שעות, ניתן לעשות בן לילה). באמצעות אצבע כפפה, להפיץ קצת שמרים לחות להדביק במרכז צלחות AJ, כדי לעשות כ. מעגל 6 ס&quot;מ עבור צלחת 15 ס&quot;מ ומעגל 4 ס&quot;מ עבור צלחת 10 ס&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את הזבובים עם זרימת דו תחמוצת הפחמן באמצעות תקן שלב תסיסנית שלב, ולהעביר לתוךהכלובים (כ -15 בקבוקי זבובים גדולים לכלוב 5 L, 5 בקבוקים לכלוב 1 L). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את תחתית כלוב עם צלחות AJ מוכן משלב 5.2, ואת הקלטת צלחת AJ לכלוב באמצעות שתי רצועות של קלטת ( דמויות 1D ו 1H ). זה שימושי לקפל מעל קצות הקלטת כי ללכת על הצלחת לקילוף קל בעת שינוי צלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר זבובים להתאושש הרדמה, לשמור על הכלובים עם הצלחות בתחתית רשת מעל. הערה: חשוב לחכות עד זבובים לחלוטין להתאושש, כפי שהם אחרת מקל על צלחת AJ ואת שמרים להדביק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף הניסוי, כדי להכין את הכלוב לניקוי, במקום הכלוב במקפיא במשך כמה שעות. השריית הרשת במים למשך מספר שעות תאפשר ניקוי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הכלובים עם זבובים בטמפרטורת החדר במשך 2-3 ימים ולשנות צלחות AJ פעמיים ביום. כדי לשנות את הצלחות, להפוך את הכלוב במהופך,לקלף את הקלטת מהצלחת, אבל להחזיק את הצלחת לכלוב, להקיש את הכלוב בעדינות על הספסל, ולהחליף במהירות את הצלחת הישנה למגש חדש, בניסיון לא לאפשר לזבובים לברוח. הערה: זבובים צריך להתאים את הכלוב יהיה להטיל הכי טוב החל ביום 3. הם ימשיכו הנחת ברמה שיא במשך כ 4-5 ימים. שני 5 כלובים L בראש קיבולת הנחת יכול לייצר עד 1 גרם של עוברים באוסף לילה. השתמש בכלובים 1 L עבור ניסויים בקנה מידה קטן יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר זבובים להניח עוברים על לוחות AJ טריים לילה (כ 16 שעות), או לכל אורך אחר הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, סמן ולשקול מכולות רשת עבור אוסף העובר, אחד לכל קו לעוף בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ 1x תמוגה, באמצעות ריאגנטים מקטע 4 (הערה: מוכן לשימוש 1x תמוגה חיץ צריך להיות מוכן ממש לפני החילוץ): להוסיף 40 מ&quot;ל מים ל 10 מ&quot;ל של 5x חיץ תמוגה מרוכז (מאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס) בצינור 50 מ&quot;ל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μL של 1 MDTT לריכוז סופי של 1 מ&quot;מ, מערבבים היטב נפרדים לשני צינורות 50 מ&quot;ל, 25 מ&quot;ל בכל. כדי אחד הצינורות, להוסיף אחד מעכב פרוטאז מעכב לסובב ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. בעוד הטבליה הוא המסת, לאסוף עוברי dechorionate (צעדים 5.8 עד 6.6). בדוק כדי לוודא את הטבליה יש מומס לחלוטין, ולשמור את המאגר על הקרח. הערה: הצינור השני של חיץ 1x עם DTT ניתן לאחסן ב -80 מעלות צלזיוס יהיה רק ​​דורשים תוספת של הלוח לפני הניסוי הבא. 25 מ&quot;ל של חיץ תמוגה מספיקה עד 2 דגימות, תוך לקיחה בחשבון שוטף הבאים במהלך טיהור חלבון צעדים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן את לוחות AJ על הכלובים עם גנוטיפים של הקווים זבוב בשימוש, להחליף את הצלחות עבור אלה טריים. הערה: עודף שמרים להדביק ניתן לגרד את הצלחת בשלב זה. עוברים ניתן הזדקנות על צלחות ב 25 ° C או בטמפרטורת החדר כדי לקבל את החלון הרצוי של זמן התפתחותי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מספיק מים לאO לכסות כל צלחת AJ. בעדינות לעקור את העוברים מהצלחת עם מברשת צבע רכה (ראש שטוח כ 10 מ&quot;מ רחב עובד היטב עבור צלחות גדולות). יוצקים את העוברים לתוך שקלול בעבר מיכל רשת מסומנים, ולנקז עודף מים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש צורך, לבצע שטיפה השני צחצוח של הצלחת כדי להסיר את כל העוברים. שלב את העוברים מצלחת נוספת (ים) עבור אותו לטוס לקו לתוך מיכל רשת זהה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קצר כתם את הרשת על מגבות נייר כדי להסיר עודף מים. </li></ol> 6. העובר Dechorionation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חצי למלא צלחת פטרי 6 ס&quot;מ עם אקונומיקה 50% (כרך / כרך פתרון במים). הערה: ראה תגובה חשובה על המותג אקונומיקה בטבלה של חומרים ריאגנטים. זהירות: ללבוש כפפות ולהימנע אקונומיקה על בגדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו 2 מנות פטרי גדול עם מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את מיכל רשת עם עוברים ב 50% אקונומיקה במשך 90 s. הקש את הרשת בעדינות במהלך incuBation כמה פעמים כדי להשעות את העוברים בפתרון אקונומיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף הדגירה 90 s, לשטוף את מיכל רשת בכל אחד 2 מנות עם מים על 10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את מיכל רשת היטב עם מים 18.2 MΩ · ס&quot;מ באמצעות בקבוק גמירה. כמו כן, לשטוף את הצדדים ואת החיצוני של מיכל רשת. הערה: אין ריח אקונומיקה צריך להיות מזוהה לאחר לשטוף יסודי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם את מיכל הרשת על מגבות נייר. לשקול את מיכל רשת עם העוברים ואת להפחית את המשקל של מיכל ריק שהושג בשלב 5.6. רשום את המשקל המתקבל של העוברים. כמות טובה של עוברים לכוון הוא 0.5 - 1 גרם. </li></ol> 7. הכנת תמצית העובר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של חיץ תמוגה עם מעכבי פרוטאז (משלב 5.7) כדי homogenizer זכוכית dounce ולשמור אותו על הקרח. מעבירים את העוברים מן המיכל רשת לתוך homogenizer. הערה: עוברים ניתן הרים עם סוף שטוח oמתכת spatula או מברשת ומועברים ישירות למאגר. בצע את כל השלבים בסעיף זה על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את העוברים הנותרים על הרשת עם חיץ נוסף 1 מ&quot;ל תמוגה ולהוסיף חומר homogenizer. בואו העוברים להתיישב לתחתית homogenizer, בזהירות לשאוב supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חיץ תמוגה עם מעכבי פרוטאז (משלב 5.7) כדי homogenizer, מכוון 5-6 מ&quot;ל של חיץ תמוגה לגרם של עוברי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize את העוברים על ידי 4-6 משיכות עם עליון רופף. הערה: במהלך שבץ הראשון, תהיה התנגדות יותר. נסו להזיז את העלי בתנועה מתמשכת כדי להימנע מתיז הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize את העוברים על ידי 8-10 משיכות עם העלי הדוקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה homogenate על קרח במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את homogenate לתוך צינורות microcentrifuge ו צנטריפוגה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות במהירות העליון (כ 13,000 XG). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> AvoidiNg את כדורי ואת השכבה העליונה מאוד השומנים, להעביר supernatants לתוך צינורות microcentrifuge טריים צנטריפוגות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות במהירות הגבוהה ביותר (כ 13,000 XG). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב supernatants עם קצה 1 מ&quot;ל עומס לתוך מזרק 10 מ&quot;ל מזרק עם 0.45 מיקרומטר מסננים המצורפת (לשלב aliquots של אותו מדגם לתוך מזרק אחד). דחוף את כל הפתרון לתוך צינור שכותרתו 15 מ&quot;ל על הקרח. תמצית ניתן להשתמש באופן מיידי עבור ניסויים טיהור חלבון הבאים או הצמד קפוא בחנקן נוזלי נשמר ב -80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי. הערה: עדיף להקפיא את תמציות ולא את העוברים, כי במהלך ההפשרה הבאים של פרוטאזות עוברי עשוי להיות מופעל ולהוביל השפלה חלבון. </li></ol>

<ol><li>Veraksa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+developmental+processes%3A+insights+from+mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of developmental processes: insights from mass spectrometry-based proteomics.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 723-734 (2013).</li>
<li>Gavin, A. C., Maeda, K., Kuhner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+charting+protein-protein+interaction%3A+mass+spectrometry-based+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Recent advances in charting protein-protein interaction: mass spectrometry-based approaches.</a> Curr Opin Biotechnol. 22 (1), 42-49 (2011).</li>
<li>Arbeitman, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+during+the+life+cycle+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene expression during the life cycle of Drosophila melanogaster.</a> Science. 297 (5590), 2270-2275 (2002).</li>
<li>Soeller, W. C., Poole, S. J., Kornberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+transcription+of+the+Drosophila+engrailed+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">In vitro transcription of the Drosophila engrailed gene.</a> Genes Dev. 2 (1), 68-81 (1988).</li>
<li>Kamakaka, R. T., Kadonaga, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+soluble+nuclear+fraction%2C+a+highly+efficient+transcription+extract+from+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The soluble nuclear fraction, a highly efficient transcription extract from Drosophila embryos.</a> Methods Cell Biol. 44, 225-235 (1994).</li>
<li>Kyriakakis, P., Tipping, M., Abed, L., Veraksa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+affinity+purification+in+Drosophila%3A+The+advantages+of+the+GS-TAP+system%5BTitle%5D)+AND+%22Fly+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">Tandem affinity purification in Drosophila: The advantages of the GS-TAP system.</a> Fly (Austin). 2 (4), 229-235 (2008).</li>
<li>Shaffer, C. D., Wuller, J. M., Elgin, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raising+large+quantities+of+Drosophila+for+biochemical+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Raising large quantities of Drosophila for biochemical experiments.</a> Methods Cell Biol. 44, 99-108 (1994).</li>
<li>Sisson, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+large+populations+of+Drosophila+for+protein+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing large populations of Drosophila for protein biochemistry.</a> CSH Protoc. 2007, (2007).</li>
<li>Caravaca, J. M., Lei, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+a+Drosophila+melanogaster+Population+Cage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage.</a> J Vis Exp. (109), (2016).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minibrain+and+Wings+apart+control+organ+growth+and+tissue+patterning+through+down-regulation+of+Capicua%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Minibrain and Wings apart control organ growth and tissue patterning through down-regulation of Capicua.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (38), 10583-10588 (2016).</li>
<li>Neumuller, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stringent+analysis+of+gene+function+and+protein-protein+interactions+using+fluorescently+tagged+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Stringent analysis of gene function and protein-protein interactions using fluorescently tagged genes.</a> Genetics. 190 (3), 931-940 (2012).</li>
<li>Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+protein+complexes+in+Drosophila+with+tandem+affinity+purification-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry.</a> Dev Dyn. 232 (3), 827-834 (2005).</li>
<li>Mukherjee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Notch+signalling+by+non-visual+beta-arrestin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of Notch signalling by non-visual beta-arrestin.</a> Nat Cell Biol. 7 (12), 1191-1201 (2005).</li>
<li>Gilbert, M. M., Tipping, M., Veraksa, A., Moberg, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Screen+for+Conditional+Growth+Suppressor+Genes+Identifies+the+Drosophila+Homolog+of+HD-PTP+as+a+Regulator+of+the+Oncoprotein+Yorkie%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A Screen for Conditional Growth Suppressor Genes Identifies the Drosophila Homolog of HD-PTP as a Regulator of the Oncoprotein Yorkie.</a> Dev Cell. 20 (5), 700-712 (2011).</li>
<li>Anjum, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Toll+Signaling+and+Inflammation+by+beta-Arrestin+and+the+SUMO+Protease+Ulp1%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Regulation of Toll Signaling and Inflammation by beta-Arrestin and the SUMO Protease Ulp1.</a> Genetics. 195 (4), 1307-1317 (2013).</li>
<li>Degoutin, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Riquiqui+and+minibrain+are+regulators+of+the+hippo+pathway+downstream+of+Dachsous%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Riquiqui and minibrain are regulators of the hippo pathway downstream of Dachsous.</a> Nat Cell Biol. 15 (10), 1176-1185 (2013).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ecdysone+receptor+coactivator+Taiman+links+Yorkie+to+transcriptional+control+of+germline+stem+cell+factors+in+somatic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The ecdysone receptor coactivator Taiman links Yorkie to transcriptional control of germline stem cell factors in somatic tissue.</a> Dev Cell. 34 (2), 168-180 (2015).</li>
<li>Lemmon, M. A., Schlessinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+signaling+by+receptor+tyrosine+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell signaling by receptor tyrosine kinases.</a> Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).</li>
<li>Vincent, J. P., Girdham, C. H., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-autonomous%2C+ubiquitous+marker+for+the+analysis+of+Drosophila+genetic+mosaics%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A cell-autonomous, ubiquitous marker for the analysis of Drosophila genetic mosaics.</a> Dev Biol. 164 (1), 328-331 (1994).</li>
<li>Zhai, B., Villen, J., Beausoleil, S. A., Mintseris, J., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteome+analysis+of+Drosophila+melanogaster+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteome analysis of Drosophila melanogaster embryos.</a> J Proteome Res. 7 (4), 1675-1682 (2008).</li>
<li>Franco, M., Seyfried, N. T., Brand, A. H., Peng, J., Mayor, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+strategy+to+isolate+ubiquitin+conjugates+reveals+wide+role+for+ubiquitination+during+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A novel strategy to isolate ubiquitin conjugates reveals wide role for ubiquitination during neural development.</a> Mol Cell Proteomics. 10 (5), (2011).</li>
<li>Ramirez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Analysis+of+the+Ubiquitin+Landscape+in+the+Drosophila+Embryonic+Nervous+System+and+the+Adult+Photoreceptor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Proteomic Analysis of the Ubiquitin Landscape in the Drosophila Embryonic Nervous System and the Adult Photoreceptor Cells.</a> PLoS One. 10 (10), 0139083(2015).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הפרוטוקול המוצג כאן הוא הליך פשוט כללי להקמת כלוב האוכלוסייה תסיסנית בקנה מידה בינוני ועושה תמציות חלבון התא כולו מעוברים. תמציות וכתוצאה מכך ניתן להשתמש במגוון של יישומים במורד הזרם, כגון טיהור של מתחמי חלבון על שרף זיקה. זה קריטי לבצע את שלבי החילוץ על קרח ולהשתמש עיכוב פרוטאז חזקה, כדי למזער השפלה חלבון. כמתואר, הפרוטוקול מתאים לבידוד של רוב cytoplasmic וכמה קרום חלבונים גרעיניים מסיסים 6 , 10 , <sup...

מסכים גנטיים, ולאחרונה, גישות גנומיות חוללו מהפכה במחקר של פונקציות ביולוגיות. עם זאת, מידע סלולרי חשוב מקודדים חלבונים האנסמבל שלהם של שותפים אינטראקציה. בעוד המסכים הגנטיים המסורתיים יכולים לזהות את רכיבי המסלול המגבילים את קצב התגובה ולהחלים אינטראקציות עקיפות, כוחן של הגישות הפרוטאומטיות טמון ביכולתן לזהות רשתות של אינטראקציה מיידית של חלבונים בעלי עניין. פרוטאומיקס היא אפוא שיטת אורתוגונלית חשובה כדי לחקור מערכות ביולוגיות, ומשלימה גנומים, תמלילי טקסטים ומסכים גנטיים מסורתיים. זיקה טיהור ספקטרומטריית מסה (AP-MS) הוכיח להיות גישה רבת עוצמה לחקר אינטראקציות חלבון חלבון (PPIs) בסביבתם הטבעית בתאים ורקמות 1 , 2 . שיטה זו מאפשרת זיהוי של אינטראקציות ישירות או עקיפות בפיתוח ספציפיאל השלבים או רקמות, והוא שימש בהצלחה לזהות PPIs רומן חדש במגוון מסלולים התפתחותיים (הנסקרת בהתייחסות 1 ). למרות ההצלחה הבלתי מעורערת של מחקרים PPI, רובם בוצעו בתאים בתרבית, שבו חלבונים &quot;הפיתיון&quot; של עניין היו overexpressed. ישנם שני נושאים עם חקר PPIs בתרבית תאים: הראשון, קו תא מסוים לא יכול לספק להשלים מלא של אינטראקציות בשל חוסר ביטוי של חלבונים מסוימים. שנית, overexpression גבוה בדרך כלל מועסקים ב ניתוחים כאלה עלול להוביל חפצים כגון חלבונים misfolding או זיהוי של אינטראקציות חיוביות כוזבות. שתי המגבלות הללו ניתן להתגבר על ידי ניתוח PPIs in vivo . צעד מגביל בניסויים כאלה הוא הזמינות של חומר המוצא לטיהור קומפלקסים חלבונים. תסיסנית melanogaster מזה זמן רב שימש מודל לניתוח פונקציונליSis, ולאחרונה זה הוכח גם להיות מערכת מצוינת לחקר PPIs in vivo . תסמונת עוברים תסיסנית מייצגת סוג רקמה אטרקטיבי במיוחד כדי למדוד PPIs, כי עוברי ניתן לאסוף בקלות בכמויות גדולות, וגם בגלל שרוב הגנים (&gt; 88%) באים לידי ביטוי במהלך embryogenesis, ובכך לספק עשיר בסביבה vivo לאיתור רלוונטי PPIs 3 . באופן מסורתי, מחקרים ביוכימיים זבובים השתמשו מאוד בקנה מידה גדול אוספים אוספים (100-150 גרם), כגון אלה הדרושים לטהור lysates תעתיק פונקציונלי 4 , 5 . מחקרים קודמים AP-MS ב תסיסנית גם צורך כמויות גדולות של עוברים (5-10 גרם), כי הם הסתמכו על גישה טיהור שני שלבים כגון טיהור זיקה טנדם (TAP), עם אובדן הקשורים של חומר בכל שלב 6 . Amoun גדולTS של חומר המוצא הכרחי הגדרת אוספי העובר בכלובים האוכלוסייה גדול, אשר יכול להיות גם יקר (כאשר רכש מסחרית) ודורש זמן כדי לשמור ולנקות 7 , 8 , 9 . ההתקדמות לאחרונה בפיתוח של זוויות צעד אחד טיהור זיקה, כמו גם את הרגישות הגוברת של ספקטרומטרים המונית, צמצמו את הכמות הנדרשת של חומר המוצא על ידי סדר גודל. באמצעות תגים כגון פפטיד מחייב streptavidin (SBP) או חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ו החל מ 1 גרם של עוברים, ניתן לבודד את כמויות של חלבון הפיתיון רכיבים אינטראקציה זה יהיה מספיק עבור זיהוי על ידי ספקטרומטריית מסה 10 , 11 . מטרת הפרוטוקול המוצג כאן היא לסייע לחוקרים overcoלי מחסום נתפס ניתוח ביוכימי של PPIs in vivo . לשם כך, אנו מספקים הליך פשוט וזול כדי לאסוף עוברים תסיסנית בקנה מידה בינוני (0.5-1 גרם), ואחריו הכנה צעד אחד של תמציות חלבון שלם התא המתאימים לניתוח שלאחר מכן על ידי AP-MS או גישות אחרות . השיטה שלנו מסתמכת על שימוש בכלובי אוכלוסייה מותאמים אישית של 1-L או 5-L שניתן לייצר בקלות על ידי כל מעבדה. יתר על כן, תנאי החילוץ המוצגים כאן אומתו במספר מחקרים, הן בתאים בתרבית והן ב- vivo 10 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .

<table><tbody><tr><td>Leaktite 5-Qt. מיכל מולטי מיקס טבעי (חבילה של 3)</td> <td>הום דיפו</td><td>209330</td><td>להכנת כלובי 5 ליטר.</td></tr><tr><td>Leaktite 5-Qt. מכסה מולטי מיקס טבעי (חבילה של 3)</td> <td>הום דיפו</td><td>209320</td><td>קוטר 8.37 אינץ'. מכסים לכלובי 5 ליטר.</td></tr><tr><td>כלי פטרי פישרברנד עם מכסה שקוף, 100 על 15 מ"מ</td><td>חומר FB0875712 פישר סיינטיפיק</td><td></td>: <td>פוליסטירן. לשימוש עם כלובי 1 ליטר.</td></tr><tr><td>צלחות פטרי פישרברנד עם מכסה שקוף, 150 על 15 מ"מ</td><td>חומר FB0875714 פישר סיינטיפיק</td><td></td>: <td>פוליסטירן. לשימוש עם כלובי 5 ליטר.</td></tr><tr><td>כלי פטרי פישרברנד עם מכסה שקוף, 60 על 15 מ"מ</td><td>חומר FB0875713A פישר סיינטיפיק</td><td></td>: <td>פוליסטירן. משמש במהלך הפחתת עוברים.</td></tr><tr><td>רשת ניילון ספר NITEX</td><td>ספר</td><td>03-180/44</td><td>180 מיקרון, 44% שטח פתוח, משמש לכלובי זבובים.</td></tr><tr><td>מילווקי 3 אינץ'. מסור חורים דחפור חורים עם ארבור</td><td>הום דיפו</td><td>49-56-9670</td><td>כלי חיתוך 3 אינץ' להכנת כלובי 1 ליטר.</td></tr><tr><td>צנצנות PMP עם פה רחב עם פה ישר עם סגירת בורג פוליפרופילן לבן</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>11-823-33</td><td>להכנת כלובי 1 ליטר. חתול תרמו מדעי # 21171000. ניתן להשתמש במיכלים חלופיים של 1 ליטר.</td></tr><tr><td>שמרים יבשים של הכוכב האדום הפעיל, נרתיק של 2 פאונד</td><td>כוכב אדום&nbsp;</td><td></td><td>ניתן לרכוש מספקים Amazon.com או אחרים.</td></tr><tr><td>תרכיז מיץ תפוחים 100% קפוא&nbsp;</td><td></td><td></td><td>ניתן לרכוש במכולת. צריך לומר "100% מיץ תפוחים" על הפחית.</td></tr><tr><td>מתיל 4-הידרוקסיבנזואט</td><td>Acros Organics</td><td>AC126965000</td><td>הידוע גם בשם מתילפרבן, או טגוספט. משמש כחומר משמר בצלחות AJ.</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630 לביולוגיה מולקולרית, 100 מ"ל</td><td>Sigma</td><td>I8896</td><td>המשמש להכנת מאגר ליזה.</td></tr><tr><td>יחידות מסנן חד פעמיות סטריליות סטריליות של Nalgene עם קרום CN&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>09-740-2A</td><td>0.2 &mu; גודל נקבוביות מ '. משמש לסינון מאגר ליזה פי 5. חתול תרמו סיינטיפיק # 1260020.</td></tr><tr><td>CO-RO ROCHE cOmplete מעכב פרוטאז קוקטייל</td><td>סיגמא</td><td>11697498001</td><td>בקבוקון של 20 טבליות. משמש לעיכוב פרוטאז במאגר ליזה.</td></tr><tr><td>מסנני מזרק קורנינג SFCA&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>09-754-21</td><td>ממברנת SFCA, קוטר 26 מ"מ, גודל נקבוביות 0.45 &mu;m. משמש לסינון דגימות תמצית סופיות.</td></tr><tr><td>BD&nbsp; מזרקים חד פעמיים Luer-Lok ללא מחטים</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-2A</td><td>לסינון דגימות תמצית סופיות. חתול BD # 309604.</td></tr><tr><td>אקונומיקה</td><td>קלורוקס</td><td></td><td>המשמשת לפירוק עוברים ב-50% (נפח/נפח) במים, ניתן לרכוש בכל סופרמרקט. חשוב להשתמש במותג Clorox, מכיוון שמותגים אחרים עלולים לגרום לניקוי לא שלם או עלולים להיות רעילים לעוברים.</td></tr><tr><td>Corning Costar Netwell Plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-213</td><td>מיכלי רשת לאוספי עוברים. 74 &mu; גודל רשת M, 6 בארות.</td></tr><tr><td>מטחנות רקמות Wheaton Dounce, קיבולת 15 מ"ל</td><td>הומוגנייזר Fisher Scientific</td><td>06-435B</td><td>לעוברים, עם עליים רופפים ומהודקים. חתול ויטון # 357544.</td></tr></tbody></table>

הכנה בינונית של<em&gt; תסיסנית</em&gt; עוברי תמציות עבור ניסויים פרוטאומיים

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

ניתוח אינטראקציות בין חלבונים לחלבון (PPI) הפך לגישה הכרחית לחקר תהליכים ומנגנונים ביולוגיים, כגון איתות תא, התפתחות אורגניזם ומחלות. זה רצוי לעתים קרובות להשיג מידע PPI באמצעות חומר vivo , כדי לקבל את התצוגה הטבעית ביותר ללא דעות מוקדמות של רשתות האינטראקציה. זבוב הפירות תסיסנית melanogaster היא פלטפורמה מצוינת ללמוד PPIs in vivo , וכן משאיל את עצמו גישות פשוטות לבידוד חומר ניסויים ביוכימיים. בפרט, עוברי זבוב הפירות מייצגים סוג נוח של רקמות לבדיקת PPI, בשל הקלות באיסוף בעלי חיים בשלב ההתפתחותי הזה והעובדה שרוב החלבונים באים לידי ביטוי בעובר, ובכך מספקים סביבה רלוונטית לחשוף את רוב ה- PPI. כאן אנו מציגים פרוטוקול אוסף של עוברי תסיסנית בקנה מידה בינוני (0.5-1 גרם), אשר הוא סכום אידיאלי עבור מגוון רחב שליישומי proteomic, כולל ניתוח של PPIs על ידי זיקוק טיהור ספקטרומטריית מסה (AP-MS). אנו מתארים את העיצובים שלנו עבור כלובים 1 L ו 5 L עבור אוספים העובר כי ניתן בקלות ובזול להגדיר במעבדה כלשהי. כמו כן, אנו מספקים פרוטוקול כללי עבור אוסף העובר ואת החילוץ חלבון לייצר lysates כי ניתן להשתמש ישירות ביישומים במורד הזרם כגון AP-MS. המטרה שלנו היא לספק אמצעי נגיש לכל החוקרים לבצע את הניתוחים של PPIs in vivo .

כדי להמחיש את השימוש בפרוטוקול זה בניסוי טיהור חלבון מורכב, יצרנו קו זבוב הומוזיגואי קיימא, הזרוע EGFP-ERK , המבטא EGFP מתויג תסיסנית תאיים אותות קינאז מוסדר (ERK, מקודד על ידי הגן מגולגל ) תחת שליטה של ארמדיל לידי ביטוי בכל מקום ( זרוע ) האמרגן 18 , 19 . יוזם הזרוע פעיל במהלך רוב השלבים של תסיסנית עוברי 19</su...

מטרת פרוטוקול זה היא לספק גישה פשוטה וזולה לאיסוף עוברים תסיסנית בקנה מידה בינוני (0.5-1 גרם) והכנת תמציות חלבון שניתן להשתמש ביישומים proteomic במורד הזרם, כגון זיקה טיהור ספקטרומטריית מסה (AP-MS ).

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, ...

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לספק גישה פשוטה וזולה לאיסוף עוברי דרוזופילה (Drosophila) בקנה מידה בינוני, ולהכנת תמריתי חלבון שניתן להשתמש בהם ביישומים פרוטאומיים המשכיים, כגון ספקטרומטריית מסות עם טיהור באמצעות זיקה (affinity purification mass spectrometry). שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחומי העברת אותות בתאים וביולוגיה התפתחותית.לדוגמה, כיצד חלבון ספציפי או אינטראקציות בין חלבונים מתווכים תקשורת תאית במהלך התפתחות האורגניזם. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא שיטה פשוטה וזולה להפקת ליזיס (Lysis) של עובר Drosophila, אשר ניתן להשתמש בה ליישומים המשכיים כגון טיהור חלבונים באפיניות (protein affinity purification).באופן מסורתי, חוקרים אספו עוברים של Drosophila בתוך כלובים לאוכלוסיות גדולות מאוד. אנו מציגים כאן הליך ידידותי למשתמש לאסוף עוברים בכלובים בגודל בינוני שניתן להקים בקלות בכל מעבדה. לאחר הכנת מכלים בנפח חמישה ליטרים וגזירת ריבועי רשת ניילון בגודל 25 על 25 סנטימטרים, בה accordance עם פרוטוקול הטקסט, הניחו את הרשת מעל המכל והדCיקו אותה באמצעות המכסה.יש לוודא שהרשת מתוחה והמכסה אינו נטוי. הכלוב מוכן כעת להכנסת זבובים. לאחר הכנת צנצנות פלסטיק בנפח של ליטר אחד וריבועי רשת ניילון בגודל 18 על 18 סנטימטר, הניחו את הרשת על השפה העליונה של הצנצנת והבריגו את המכסה כדי להדק אותה.ודאו שהרשת מתוחה ושהמכסה אינו נטוי. הגבירו את קווי הזבובים הטרנסגניים הנושאים את חלבון העניין המבוקש. העבירו את הבקבוקים מדי יומיים עד להצטברות של 25 עד 30 בקבוקים עבור כל קו זבובים.הגבירו מלאי בקרה באופן דומה. לאחר מכן, חממו את צלחות מיץ התפוחים לטמפרטורת החדר. לאחר מכן, בעזרת אצבע עם כפפה, מרחו מעט ממשחת שמרים רטובה במרכז הצלחות.הכינו עיגול של כשישה סנטימטרים עבור צלחת של 15 סנטימטרים, ועיגול של ארבעה סנטימטרים עבור צלחת של 10 סנטימטרים. לאחר הרדמת הזבובים והעברתם לכלובים שהוכנו עם הרשת הפונה כלפי מטה, כסו את הכלובים בצלחות מיץ תפוחים.אפשרו לזבובים להתעורר. לאחר מכן, הפכו את הכלובים והדגרו את הזבובים בטמפרטורת החדר למשך יומיים עד שלושה ימים. החליפו את המצעים פעמיים ביום, על ידי הפיכת הכלוב מלמעלה למטה, ובזמן החזקת המצע אל הכלוב, קלפו את הסרט מהמצע.הקישו בעדינות על הכלוב כולו על גבי השולחן והחליפו במהירות את הפלטה הישנה בחדשה, תוך ניסיון למנוע מהזבובים לברוח. אפשרו לזבובים להטיל עוברים על פלטות מיץ תפוחים טריות למשך לילה, או לכל פרק זמן רצוי אחר. למחרת בבוקר, סמנו ושקלו את מיכלי הרשת לאיסוף העוברים.אחד עבור כל קו זבובים שבו נעשה שימוש. הכין Lysis Buffer בריכוז 1x במבחנה של 50 מיליליטר באמצעות ריאגנטים שהוכנו מראש, על ידי הוספת 40 מיליליטר מים ל-10 מיליליטר של Lysis Buffer מרוכז 5x במבחנה של 50 מיליליטר. הוסף 50 מיקרוליטר של DTT בריכוז one molar לריכוז סופי של one mili molar.ערבב היטב וחלק את התמיסה בין שתי מבחנות של 50 milliliter. לאחת המבחנות הוסף טבלייה אחת של מעכב פרוטאז. הנח את המבחנה על רוטטור בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius למשך 30 דקות.בזמן שהטבליה נמסה, התחילו באיסוף העוברים על ידי סימון צלחות מיץ התפוחים על הכלובים, עם הגנוטיפים של קווי הזבובים שנעשה בהם שימוש. החליפו את הצלחות בחדשות. הוסיפו מספיק מים כדי לכסות כל צלחת מיץ תפוחים.לאחר מכן, בעזרת מכחול רך, הוצאו בעדינות את העוברים מהצלחת. שפכו את העוברים אל תוך מיכל הרשת שנשקל וסומן מראש, ונקזו את עודפי המים. לאחר מכן, ספגו קצרה את הרשת בנייר סופג כדי להסיר את עודפי המים.כדי להסיר את הדופרן מהעובריים, מלאו למחצית פטריה של שישה סנטימטרים ב-50% bleach. לאחר מכן, הכינו שתי פטריות גדולות יותר עם מים. טבלו את מיכל הרשת עם העובריים ב-50% bleach למשך 90 שניות.הקישו בעדינות על הרשת במהלך הדגירה מספר פעמים, כדי להשעות את העוברים בתמיסת האקומיקה. בסיום הדגירה, השתמשו במים לשטיפת מיכל הרשת בכל אחת משתי הצלחות, למשך כ-10 שניות. לאחר מכן, השתמשו במים בעלי התנגדות של 18.2 megohm centimeter בבקבוק נתזים, כדי לשטוף ביסודיות את מיכל הרשת, כולל הדפנות והחלק החיצוני.לא יעלה ריח של חומר הלבנה לאחר שטיפה יסודית. ייבשו את מיכל הרשת בעזרת נייר סופג. לאחר מכן, שקלו את מיכל הרשת עם העוברים והפחיתו את משקל המיכל הריק.יש לרשום את המשקל שהתקבל עבור העובריים. להכנת תמצית עוברית, יש להוסיף מיליליטר אחד של Lysis Buffer עם מעכבי פרוטאז למחצץ זכוכית מסוג Dounce ולשמור אותו על קרח. לאחר מכן, יש להעביר את העובריים ממכל הרשת אל המחצץ.השתמשו ב-1 mL של Lysis Buffer כדי לשטוף את העוברים שנותרו על הרשת. לאחר מכן, העבירו את העוברים ואת הבאפר אל החומר שנמצא בהומוגנייזר. המתינו עד שהעוברים ישקעו לתחתית ההומוגנייזר ושאבו בזהירות את הנוזל העליון (supernatant).בשלב הבא, הוסיפו למי homogenizer תמיסת ליזיס (Lysis Buffer) עם מעכבי פרוטאוז, במטרה להגיע לחמישה עד שישה מיליליטרים של תמיסת ליזיס לגרם של עוברי. לאחר מכן, הכניסו פסטל (pestle) במידה רפויה כדי להומוגניзировать את העוברים באמצעות ארבעה עד שישה תנועות ריסוק. במהלך התנועות הראשונות תורגש התנגדות רבה יותר.נסו להניע את העלי בשקיעה רציפה, כדי למנוע נתזי תמיסה. לאחר מכן, עברו להשתמש בעלי בעל התאמה הדוקה. הומוגניזו את העובריים באמצעות שמונה עד 10 תנועות ריסוק.דגרו את ההומוגנאט על קרח למשך 20 דקות. לאחר מכן, העבירו את ההומוגנאט למבחנות מיקרו-צנטריפוגה. צנטריפוגו במהירות של 13,000 ×g ובטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.תוך הימנעות מהמשקעים בשכבת השומן העליונה ביותר, העבירו את העל-משקעים למבחנות מיקרו-צנטריפוגה חדשות על קרח. לאחר חזרה על הצנטריפוגה, השתמשו בטיפ של 1 ml כדי לאסוף בזהירות את העל-משקעים. העבירו אותם למזרקים מקוררים של 10 ml, עם מסננים של 0.45 µm המחוברים אליהם.העבירו את כל התמיסה למבחנות מיקרו-צנטריפוגה של 2 mL המסומנות, על קרח. הקפיאו את הדגימות באופן מהיר בחנקן נוזלי ואחסנו אותן בטמפרטורה של 80°C-. לחילופין, ניתן להשתמש בהן באופן מיידי לניסויי טיהור חלבונים.באמצעות הפרוטוקול המתואר בסרטון זה, הוכנו ליזאטים מעוברי Drosophila המבטאים באופן גורף את חלבון ה-EGFP-ERK, תחת בקרה של מקדם arm-odillo. ביטוי החלבון אומת באמצעות Western Blotting לחלבון ERK כולל, כדי לזהות בו-זמנית את הרמות של ERK אנדוגני ושל EGFP-ERK טרנסגני, אשר נעים ב-42 kilodaltons ו-69 kilodaltons בהתאמה. פס אחד, המתאים ל-ERK אנדוגני ללא תג, זוהה בקו הבקרה yellow white, מה שאישר מיצוי מוצלח של ERK ו-EGFP-ERK מעוברים.כדי לבחון האם פרוטוקול המיצוי מתאים לניקוי עוקב של חלבון מתויג, תמציות מזבובים צהובים ולבנים, ומזבובים מסוג arm-EGFP-ERK, הועברו לניקוי זיקה (affinity purification) באמצעות חרוזי GFP Agarose. צביעת כסף של דגימות שהורצו ב-SDS-PAGE במדרג מראה ניקוי מוצלח של חלבון הפיתיון EGFP-ERK. מלבד EGFP-ERK, נצפו בנתיב הניסויי פסים נוספים שלא נצפו בדגימת הביקורת, מה שמעיד על כך שהניקוי השקיע חלבונים פוטנציאליים בעלי אינטראקציה עם ERK.לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע את שלבי איסוף העובריים והמיצוי בתוך כשעתיים. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לבצע את שלבי המיצוי על קרח, ולהשתמש במעכבי פרוטאז כדי לצמצם את פירוק החלבונים.לאחר צפייה בסרטון זה, תשיגו הבנה טובה של אופן הקמת כלובים לאוכלוסיית Drosophila בקנה מידה בינוני, וכן של הכנת מיצויי חלבוני תאים שלמים מעובריו.

medium-scale-preparation-drosophila-embryo-extracts-for-proteomic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

אנו מתארים תהליך להטבעת קיבעון, חתך, הדמיה של שלב...

הכנת עוברים אלקטרונים מיקרוסקופית של תסיסנית לב עוברי צינור

אנו מתארים את הליך להכין...

ויזואליזציה של מערכת העצבים כולה עובריים-Mount תסיסנית עוברים

כאן אנו מתארים שלם הר...

הר כולו RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

קומפלקסי חלבונים מרובים רכיבים ממלאים תפקידים חיוניים בתפקוד ופיתוח סלולריים. כאן אנו מתארים שיטה המשמשת לבודד חלבון מתחמי יליד מעוברי דרוזופילה לאחר in vivo crosslinking ואחריו טיהור של מתחמי crosslinked לניתוח מבנה פונקציה שלאחר מכן.

In vivo גישת Crosslinking לבודד חלבון מן מכלולים דרוזופילה עוברים

מבוא של מולקולות קטנות לעובר דרוזופילה הפיתוח מציע פוטנציאל גדול לאפיון פעילות ביולוגית של תרכובות רומן, סמים ורעלים כמו גם לחיטוט מסלולים התפתחותיים בסיסיים. שיטות שתוארו במסמך זה מתארים את שלבים שלהתגבר על מחסומים טבעיים לגישה זו, המרחיב את התועלת של מודל עובר דרוזופילה.

שיטה של ​​permeabilization של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים למבחנים של מולקולה קטנה פעילות

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) מסוגל ללכוד תרגום ספציפי לסוג התא של mRNA. כאן אנו מדווחים על פרוטוקול TRAP הראשון המוקדש לבידוד mRNA באוכלוסיות תאים נדירות של עוברי דרוזופילה.

מלכודת RC, תרגום ריבוזום זיקה טיהור מאוכלוסיות תאים נדירות של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

עבודה זו מפרטת שיטת אימונוהיסטוכימיה סטנדרטית כדי לדמיין תחזיות נוירונים מוטוריים של שלב מאוחר 16 תסיסנית עוברי melanogaster . הכנת הפילה של עוברי קבוע מוכתמים נוגדן FasII מספק כלי רב עוצמה לאפיין את הגנים הנדרשים עבור pathoninding האקסון המנוע ואת ההכרה היעד במהלך התפתחות עצבית.

ויזואליזציה של דפוס היטל אקסונל של נוירונים מוטוריים עובריים ב<em&gt; תסיסנית</em

מוצג כאן פרוטוקול microinject ובו זמנית תמונה עוברי Drosophila מרובים במהלך התפתחות עוברית באמצעות צלחת מבוססת, דימוי תוכן גבוה.

הכנת עובר Drosophila ומיקרו-היתוך למיקרוסקופיה של תאים חיים שבוצעו באמצעות מנתח תוכן גבוה אוטומטי

כאן, אנו מתארים פרוטוקול לגילוי ולוקליזציה של חלבון עובר Drosophila ו- RNA מאוסף להטבעה והטבעה מראש, אימונוסטיור ו- mRNA בהכלאה במקום .

פרוטוקול לאימונוהיסטוכימיה והפצת RNA In-situ בתוך עובר דרוזופילה מוקדם

כאן מוצג פרוטוקול ליישום מיקרוסקופ הרחבה בעוברי דרוזופילה מוקדמים להשגת הדמיה ברזולוציית על באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי קונפוקלי קונבנציונלי לסריקת לייזר.

שימוש במיקרוסקופ הרחבה להגדלה פיזית של עוברי דרוזופילה שלמים לצורך הדמיה ברזולוציית על

פרוטוקול זה מתאר תיוג פלואורסצנטי מותאם אישית מבוסס נוגדנים והזרקה לעוברים מוקדמים של דרוזופילה כדי לאפשר הדמיה חיה של חלבונים בשפע נמוך או שינויים לאחר תרגום שמאתגרים לזיהוי באמצעות גישות GFP/mCherry-tag מסורתיות.

הדמיה של חלבונים בשפע נמוך ושינויים לאחר תרגום בעוברי דרוזופילה חיים באמצעות הזרקת נוגדנים פלואורסצנטיים

למדו שיטה פשוטה וזולה להכנת תמציות חלבון מעוברי Drosophila בקנה מידה בינוני. הפרוטוקול מאפשר יישומים פרוטאומיים כמו AP-MS לחקר תקשורת תאית בביולוגיה התפתחותית.

הכנה בינונית של

גלה סרטונים נוספים