הכנה בינונית של תסיסנית עוברי תמציות עבור ניסויים פרוטאומיים

המטרה הכוללת של ניסוי זה, היא לספק גישה פשוטה וזולה לאיסוף עוברי דרוזופיליה בקנה מידה בינוני. והכנת תמציות חלבון שניתן להשתמש בהן ביישומים פרוטאומיים במורד הזרם, כגון ספקטרומטריית מסה לטיהור זיקה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי איתות התא וביולוגיה התפתחותית.

לדוגמה, כיצד אינטראקציות ספציפיות של חלבון וחלבון מבצעות תקשורת תאית במהלך התפתחות האורגניזם. היתרון העיקרי של טכניקה זו, הוא שמדובר בשיטה קלה וזולה ליצירת ליזה של עובר דרוזופילה. שיכול לשמש ליישומים במורד הזרם כמו טיהור זיקה לחלבון.

באופן מסורתי, חוקרים אספו עוברי דרוזופילה בכלובי אוכלוסייה גדולים מאוד. אבל אנחנו מציגים הליך ידידותי למשתמש לאיסוף עוברים בכלובים בגודל בינוני שניתן להקים בקלות בכל מעבדה. לאחר הכנת מיכלים של חמישה ליטר וחיתוך ריבועי רשת ניילון בגודל 25 על 25 ס"מ, על פי פרוטוקול הטקסט, הניחו את הרשת מעל המיכל ולחצו כלפי מטה עם המכסה.

ודא שהרשת הדוקה והמכסה אינו מוטה. הכלוב מוכן כעת לאכלוס בזבובים. לאחר הכנת צנצנות פלסטיק של ליטר אחד וריבועי רשת ניילון בגודל 18 על 18 ס"מ, מניחים את הרשת על השפה העליונה של הצנצנת ומבריגים את המכסה להידוק.

ודא שהרשת הדוקה והמכסה אינו מוטה. הגברת קווי הזבוב הטרנסגניים נושאים את החלבון המסווג המעניין. ומעבירים את הבקבוקים כל יומיים עד שמצטברים 25 עד 30 בקבוקים לכל קו זבוב.

להגביר מלאי שליטה באופן דומה. לאחר מכן, מחממים צלחות מיץ תפוחים לטמפרטורת החדר. לאחר מכן בעזרת אצבע עטויה כפפה מורחים מעט רסק שמרים רטוב במרכז הצלחות.

יצירת עיגול של כשישה סנטימטרים לצלחת של 15 סנטימטר. ועיגול של ארבעה סנטימטרים לצלחת של 10 סנטימטרים. לאחר הרדמת הזבובים, והעברתם לכלובים המוכנים כשהרשת פונה כלפי מטה, מכסים את הכלובים בצלחות מיץ תפוחים.

אפשרו לזבובים להתעורר. לאחר מכן הפכו את הכלובים ודגרו על הזבובים בטמפרטורת החדר למשך יומיים-שלושה. החלף את הצלחות פעמיים ביום, על ידי הפיכת הכלוב הפוך, ותוך כדי החזקת הצלחת לכלוב, קלף את הקלטת מהצלחת.

הקש בעדינות על כל הכלוב על הספסל והחלף במהירות את הצלחת הישנה בחדשה, מנסה לא לאפשר לזבובים לברוח. אפשר לזבובים להטיל עוברים על צלחות מיץ תפוחים טרי למשך הלילה, או לכל פרק זמן רצוי אחר. למחרת בבוקר, סמנו ושקלו מיכלי רשת לאיסוף עוברים.

אחד לכל קו זבוב בשימוש. הכן מאגר ליזה 1x בצינור של 50 מיליליטר באמצעות ריאגנטים שיוצרו בעבר, על ידי הוספת 40 מיליליטר מים ל-10 מיליליטר של מאגר ליזה מרוכז פי 5 בצינור של 50 מיליליטר. הוסף 50 מיקרוליטר של DTT טוחנת אחת בריכוז סופי של מילי-טוחנת אחת.

מערבבים היטב ומחלקים את התמיסה בין שני צינורות של 50 מיליליטר. לאחת הצינורות יש להוסיף טבליה אחת של מעכב פרוטאז. והניחו את הצינור על מסובב בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

בזמן שהטבליה מתמוססת, התחל לאסוף את העוברים על ידי סימון צלחות מיץ התפוחים על הכלובים, עם הגנוטיפים של קווי הזבובים בשימוש. והחליפו את הצלחות בטריות. מוסיפים מספיק מים כדי לכסות כל צלחת מיץ תפוחים.

ואז בעזרת מברשת צבע רכה, עקרו בעדינות את העוברים מהצלחת. שופכים את העוברים למיכל הרשת שנשקל וסומן בעבר ומנקזים את עודפי המים. ואז מחק בקצרה את הרשת על מגבות נייר כדי להסיר את עודפי המים.

כדי לפרק את העוברים, ממלאים חצי צלחת פטרי של שישה סנטימטרים ב-50% אקונומיקה. לאחר מכן הכינו שתי צלחות פטרי גדולות יותר עם מים. טבלו את מיכל הרשת עם עוברים, ב 50% אקונומיקה למשך 90 שניות.

הקש בעדינות על הרשת במהלך הדגירה כמה פעמים, כדי להשעות את העוברים בתמיסת האקונומיקה. בתום הדגירה השתמשו במים כדי לשטוף את מיכל הרשת בכל אחת משתי הכלים, למשך כ -10 שניות. לאחר מכן השתמש במים של 18.2 מגה-הם סנטימטר בבקבוק שפריץ, כדי לשטוף היטב את מיכל הרשת, כולל הדפנות והחלק החיצוני.

אין לזהות ריח של אקונומיקה לאחר שטיפה יסודית. כתם את מיכל הרשת על מגבות נייר. לאחר מכן שקלו את מיכל הרשת, עם העוברים והפחיתו את משקל המיכל הריק.

רשום את המשקל המתקבל של העוברים. להכנת תמצית עוברים, הוסף מיליליטר אחד של Lysis Buffer עם מעכבי פרוטאז, להומוגניזטור זכוכית Dounce ושמור אותו על קרח. לאחר מכן העבירו את העוברים ממיכל הרשת להומוגניזטור.

השתמש במיליליטר אחד של Lysis Buffer כדי לשטוף את העוברים הנותרים על הרשת. ולהוסיף את העוברים והחיץ לחומר שבהומוגנייזר. לאחר מכן הניחו לעוברים להתיישב לתחתית ההומוגנייזר ושאבו בזהירות את הסופרנטנט.

לאחר מכן, הוסף Lysis Buffer עם מעכבי פרוטאז להומוגנייזר, במטרה להגיע לחמישה עד שישה מיליליטר של Lysis Buffer לכל גרם עוברים. לאחר מכן הכנס עלי רופף כדי להומוגניזציה של העוברים בארבע עד שש משיכות. במהלך השבץ הראשון תהיה יותר התנגדות.

נסו להזיז את העלי בתנועה מתמשכת, כדי להימנע מהתזת התמיסה. ואז עברו לעלי הדוק. והומוגניזציה של העוברים בשמונה עד 10 פעימות.

דגרו את ההומוגני על קרח למשך 20 דקות. לאחר מכן העבירו את ההומוגניד לצינורות מיקרו צנטריפוגה. וצנטריפוגה ב 13, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.

תוך הימנעות מהכדורים בשכבת השומנים העליונה, העבירו את הסופרנטנטים לצינורות מיקרו צנטריפוגות טריים על קרח. לאחר חזרה על הצנטריפיקציה, השתמש בקצה של מיליליטר אחד כדי לאסוף בזהירות את הסופרנטנטים. והעבירו אותם למזרקים צוננים של 10 מיליליטר, עם מסננים של 045 מיקרומטר מחוברים.

דחף את כל התמיסה לתוך שני צינורות מיקרו צנטריפוגה מסומנים של מיליליטר על קרח. הצמד להקפיא את הדגימות בחנקן נוזלי ולאחסן אותן בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס. או להשתמש מיד לניסויים לטיהור חלבונים.

באמצעות הפרוטוקול המתואר בסרטון זה, הוכנו ליזאטים מעוברי דרוזופילה המבטאים בכל מקום את חלבון EGFP-ERK, תחת שליטת מקדם הזרוע-אודילו. ביטוי החלבון אושר על ידי Western Blotting עבור חלבון ERK כולל כדי לזהות בו זמנית את רמות ה-EGFP-ERK האנדוגני והטרנסגני, הנודדות ב-42 קילודלטון ו-69 קילודלטון בהתאמה. פס יחיד, המתאים ל-ERK אנדוגני לא מתויג זוהה בקו הבקרה הצהוב הלבן, מה שאישר מיצוי מוצלח של ERK ו-EGFP-ERK מעוברים.

כדי לבדוק אם פרוטוקול המיצוי מתאים לטיהור עוקב של חלבון מתויג, תמציות מזבובי הלבן הצהוב וזבובי arm-EGFP-ERK עברו טיהור זיקה, באמצעות חרוזי אגרוז GFP. צביעת כסף של דגימות הפועלות על SDS-PAGE שיפוע, מראה טיהור מוצלח של חלבון הפיתיון EGFP-ERK. מלבד EGFP-ERK, נתיב הניסוי הכיל רצועות נוספות, שלא נצפו בדגימת הבקרה, מה שמרמז על כך שהטיהור שחזר חלבונים פוטנציאליים הפועלים באינטראקציה עם ERK.

לאחר השליטה, איסוף העוברים ושלבי החילוץ יכולים להיעשות תוך כשעתיים. בזמן ניסיון הליך זה חשוב לזכור לבצע את שלבי החילוץ על קרח. ולהשתמש במעכבי פרוטאז כדי למזער את פירוק החלבון.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להגדיר כלובי אוכלוסייה של דרוזופילה בקנה מידה בינוני. ולהכין תמציות חלבון תאים מלאים מעוברים.