Name: טיפול קל של ארכיטקטורות ב Hydrogels חלבון מבוססת ליישומים תרבות תא (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-04T11:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: למדו כיצד ליצור הידרוגלים מקרופורוזיים מבוססי חלבון עם גדלי נקבוביות משתנים ליישומי תרבית תא תלת-ממדית. השיטה מאפשרת אופטימיזציה של תכונות החומר עבור סוגי תאים שונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצה להודות באדן-וירטמברג Stiftung לתמיכה הפיננסית שלהם במסגרת "סינתזה חומר Bioinspired" (BioMatS-14).

1. הידרוג הכנה
<ol>
	<li>מערבבים 200 מ ג של BSA עם 1 מ"ל של יונים H2O ליצירת מלאי BSA 20% (w/v) (מניות פתרון A).</li>
	<li>µL 165 תערובת של THPC פתרון (134 mg/mL) עם 4.835 מ ל מים יונים כדי ליצור THPC במניה פתרון (פתרון מניות B).</li>
	<li>שוקל 1 מ ג של KCSSGKSRGDS (1,111.1 g/mol) פפטיד (או של פפטיד תא-דבק המקביל), למהול אותו ב- µL 100 סטרילי H2O להשגת פתרון 10 מ"ג/מ"ל (מניות פתרון C). הערה: שלב זה הוא אופציונלי והוא רק צריך להיכלל אם הידרוג נועדה ליישום התרבות תאים.</li>
	<li>להסיר את החלק התחתון של צלחת 96-ובכן ולהחליף אותו עם ניילון נשלף. הערה: עבור לוחות המשמש כאן, התחתון אפשר להסיר בקלות על ידי הפעלת לחץ בתחתית כל טוב; בתחתית פלסטיק דק פשוט יפול החוצה.</li>
	<li>מיקס 100 µL של פתרון מניות BSA (א) ו- µL 100 של THPC במניה פתרון (B) (אופציונלי: 4 µL של מניות פתרון C hydrogels functionalized, תא-דבק) בצלחת 96-ובכן כדי לקבל 200 µL של הידרוג. לערבב את המרכיבים על ידי pipetting למעלה ולמטה לפחות 5 פעמים כדי להבטיח הידרוג אחיד לאחר הפילמור.</li>
	<li>מקם את הצלחת 96-ובכן בטמפרטורת החדר (RT) למשך כ- 10 דקות עד כל hydrogels הם polymerized כראוי.</li>
	<li>לאט ובזהירות להסיר את ניילון נצמד מהחלק התחתון של הלוח.</li>
	<li>הקש את hydrogels מהצלחת 96-ובכן באמצעות חותמת קטנה, להעביר אותם ל 1.5 mL צינורות עם PBS סטרילי, pH 7.4. הערה: hydrogels יש בצורת גליל, עם קוטר של 4 מ מ, גובה של 8 מ מ.</li>
	<li>אחסן את hydrogels באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) ב 4 ° C עד מספר חודשים.</li>
</ol>
2. ליופיליזציה את Hydrogels
<ol>
	<li>למלא 1.5 mL צינורות µL 500 סטרילי יונים H2O, הסירי את הפקק. להעביר את hydrogels 1.5 mL התגובה הצינורות בעזרת מרית.</li>
	<li>לעטוף את הצינורות 1.5 mL בחוזקה עם פרפין הסרט--לפחות שלוש שכבות עבור כל מבחנה. שימוש במחט לנקב חורים קטנים בסרט כדי לאפשר שחרור הגז באמצעות הרכבת התחתית.</li>
	<li>המשך לאחד השלבים הבאים:
	<ol>
		<li>להעביר את המבחנה חנקן נוזלי פתרון עבור 5 דקות כדי להבטיח כי המים של הידרוג לחלוטין להקפיא. מיד לאחר הסרת של החנקן הנוזלי, להעביר את הבקבוקונים ההקפאה מייבש כדי למנוע את החומר מפשיר. הערה: הליך זה תוצאות הנקבוביות על 10-15 מיקרומטר ברדיוס.</li>
		<li>שמור את הבקבוקונים ב-20 ° C בלילה לאט להקפיא את hydrogels. מיד לאחר הסרת מ-20 ° C, להעביר את הבקבוקונים ההקפאה מייבש כדי למנוע את החומר מפשיר. הערה: הליך זה תוצאות הנקבוביות על 50-60 מיקרומטר ברדיוס.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>לאחר 24 שעות (אידוי מוחלט של המים סביב את הידרוג), להפשיר את החומר על-ידי הסרתו מכוננים ההקפאה מייבש. הערה: ניתן לנתח את גודל הנקבוביות עם לייזר קונפוקלי סורק מיקרוסקופ (שלב 5, "הידרוג ויזואליזציה").</li>
</ol>
3. חלקיקים שטיפת
<ol>
	<li>הכינו את הידרוג כמתואר בצעדים 1.1-1.5.</li>
	<li>לאחר ערבוב המרכיבים, להוסיף ישירות NaCl עד רוויה מתרחשת (36 מ"ג/מ"ל). מוסיפים מלח עד גביש מלח ניתן לראות בפתרון התמיסה לבן.</li>
	<li>להעביר את הצלחת 96-ובכן מטרף ומנערים עד הפילמור מתרחש (כ- 10 דקות). הסר את hydrogels הצלחת, כמתואר בצעדים 1.7-1.8.</li>
	<li>דגירה של hydrogels לפחות 24 שעות ביממה במלון RT במים סטריליים על מטרף (20 סל ד) כדי elute כל מלח מן התבנית הידרוג. לאחסן את hydrogels ב 4 ° C ב- PBS עבור אפילו מספר חודשים.</li>
</ol>
4. ערוץ היווצרות
<ol>
	<li>להכין hydrogels כפי שמתואר בשלב 1. להסיר את הידרוג הפתרון באמצעות מלקחיים ומרוקנים את המים העודפים עם נייר סופג מאוד, מניחים אותה על גוש קרח יבש.</li>
	<li>להקפיא את הידרוג ב-30 s בזהירות להסיר אותו מהגוש. לא לעשות נזק של הידרוג; בזהירות להשתמש מרית לגרד אותו הבלוק. להעביר את הידרוג צינור 1.5 מ"ל וזה יבש לילה ב 37 º C.</li>
</ol>
5. הידרוג ויזואליזציה
<ol>
	<li>הכן פתרון מניות rhodamine B על ידי דילול 1 מ ג של rhodamine B ב- 10 מ"ל ל- PBS. להכין לדילול טורי על-ידי דילול הפתרון rhodamine מניות ב- PBS עד ריכוז של 0.001 מ"ג/מ"ל (דילול פקטור: 100)</li>
	<li>הסר את הידרוג הפתרון אחסון (למשל, משלב 2.4.), להעביר אותו צינור 1.5 מ עם 1 מ"ל של 0.01 מ"ג/מ"ל rhodamine B פתרון. מכתים את הידרוג לילה ב- rhodamine B פתרון RT.</li>
	<li>למחרת, להעביר את הידרוג אשר ניתן לאבחן עד 10 מ"ל של PBS (pH 7.4) ושטוף במשך לפחות 3 שעות.</li>
	<li>להעביר את הידרוג לשקופית ממוצע-8 היטב, לכסות אותו. עם PBS.</li>
	<li>לחתוך פרוסות קטנות הידרוג (בערך גובה 0.5 מ מ בתוך) באמצעות סכין.</li>
	<li>באמצעות לייזר קונפוקלי סורק מיקרוסקופ, להמחיש את הידרוג באורך-גל של 514 nm (המטרה: EC תוכנית-Neofluar 40 x / 1.30 שמן DIC M27, המטוס במצב סריקה: 514 ננומטר, and זום: 1 X).</li>
</ol>
6. תא תרבות היתכנות
<ol>
	<li>מסנן סטרילי כל מלאי פתרונות (A, B ו- C) עם מסנן 0.45 מיקרומטר.</li>
	<li>הכינו את הידרוג כמתואר בצעדים 1.1-1.4, כולל את פפטיד תא-דבק לפני הידרוג הפילמור.</li>
	<li>לאחר ערבוב המרכיבים, מיד pipette את התערובת לתוך ממוצע-שקופית 8 טוב עד החלק התחתון מכוסה לגמרי. הערה: שלב זה חייב להתבצע ישירות ובמהירות לאחר ערבוב את הרכיבים, כמו הפילמור מתרחש בתוך דקות בשקופית.</li>
	<li>התרבות התאים אדהזיה, מעבר כדי לקבל השעיה תא בודד באמצעות טכניקות תרבות תא סטנדרטי. להעביר את התאים מראש ומחוממת, אמצעי סטרילי של תרבות תא DMEM בתוספת סרום שור עוברית (FBS, 10% (w/v)), פניצילין-סטרפטומיצין (1% (w/v)), והפתרון חומצת אמינו שאינן חיוניות (גברתי, 1% (w/v)).</li>
	<li>הרוזן את התאים עם נויבאואר ספירת קאמרית, בזהירות פיפטה µL 200 של מספר תאים (2 x 105 תאים/cm2) על גבי משטח הידרוג הרצוי.</li>
	<li>מכסה את ממוצע שקופית 8 עם המכסה, להעביר אותו אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2). תקופת דגירה של פחות 4 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לאחר לפחות 4 שעות של קובץ מצורף הסלולר, לשטוף את התאים פעמיים עם 200 µL של תרבית תאים סטרילי PBS.</li>
	<li>לתקן את התאים µL 200 פורמלין 3.7 אחוזים (v/v) למשך 10 דקות ב RT. ולשטוף פעמיים עם PBS (~ 200 µL). הערה: ללבוש ציוד מגן אישי המתאים בעת טיפול פורמלדהיד.</li>
	<li>Permeabilize התאים עם 200 µL של 0.1% X טריטון עבור 5 דק לשטוף פעמיים עם PBS.</li>
	<li>כתם התאים עם phalloidin-rhodamine על-ידי ערבוב µL 5 מניות methanolic עם µL 195 ל- PBS והוספת זה לתאים-כתם RT. את התאים עבור 20 דקות בחושך. לשטוף פעמיים עם PBS.</li>
	<li>לחקור את מאפייני אדהזיה תא בעזרת מיקרוסקופ קונפוקלי 514 nm (המטרה: EC תוכנית-Neofluar 40 x / 1.30 שמן DIC M27, המטוס במצב סריקה: 514 ננומטר, and זום: 1 X). לנתח את התמונות באמצעות תוכנה מתאימה (ראה את הטבלה של חומרים).</li>
</ol>
7. הידרוג מאפיינים
<ol>
	<li>נפיחות יחס.
	<ol>
		<li>יבש לחלוטין את hydrogels ב 37 מעלות צלזיוס לפחות ליום אחד.</li>
		<li>שוקל כל הידרוג ורשום את המשקל המדויק.</li>
		<li>למלא צינור תגובה 2 מ ל mL 1.5 ל- PBS.</li>
		<li>להעביר את הידרוג לתוך הצינורית התגובה הזאת 2 מ"ל, לגמרי לטבול אותו ב- PBS.</li>
		<li>להשאיר את הידרוג לפחות יומיים ב- PBS ב RT להגיע שיווי משקל עם טוב, מגניב.</li>
		<li>לאחר שלושה ימים, להסיר את הידרוג הפתרון, לייבש אותו עם ממחטת נייר כדי להסיר עודפי מים מפני השטח הידרוג.</li>
		<li>שוקלים את הידרוג.</li>
		<li>לחשב את יחס נפיחות באמצעות הנוסחה הבאה: 
		<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/55813/55813eq1.jpg"> כאשר Wd הוא משקל של הג'ל מיובשים (שלב 7.1.2.) ו- Ws הוא המשקל של הג'ל רטוב (שלב 7.1.7). הכפל עם 100 כדי לקבל את אחוז יחס נפיחות.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>יציבות pH וטמפרטורה.
	<ol>
		<li>להעביר 5 מ של PBS צינור תגובה 15-mL.</li>
		<li>התאם את פתרון ה-pH המתאים (למשל, pH 2, 7 או 10) עם NaOH, HCl. הביאו הפתרון הטמפרטורה המתאימה (למשל, RT, 37 ° C או 80 ° C).</li>
		<li>להעביר את הידרוג זה להיחקר על יציבותו לתוך הפתרון המתאים. להתאים מחדש את ה-pH במידת הצורך. הערה: כל hydrogels צריך להיות לגמרי נפוחות בשלב זה (ראה את היחס נפיחות) כדי למנוע פרשנות שגויה של המשקל עקב הנפיחות של החומר.</li>
		<li>לאחר במרווחי זמן מסוימים, להסיר את הידרוג מהפתרון (למשל, כל שעה עד 2 ימים), לייבש אותו עם ממחטת נייר סופג מאוד להסיר את המים העודפים, שוקל אותה.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>השפלה אנזימטיות.
	<ol>
		<li>להכין פתרון אנזים מניות של 300 U טריפסין, פפסין, לפי הוראות היצרן.</li>
		<li>להעביר את הידרוג (למשל, משלב 1.8) הפתרון המתאים. הערה: כל hydrogels צריך להיות לגמרי נפוחה בשלב זה כדי למנוע פרשנות שגויה של המשקל.</li>
		<li>לאחר במרווחי זמן מסוימים, להסיר את הידרוג מהפתרון (למשל, כל שעה), לייבש אותו עם ממחטת נייר סופג מאוד להסיר את המים העודפים, שוקל אותה.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Geckil, H., Xu, F., Zhang, X., Moon, S., Demirki, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Engineering hydrogels as extracellular matrix mimics.</a> Nanomedicine. 5 (3), 469-484 (2011).</li>
<li>Liu, Y., Chan-Park, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biomimetic+hydrogel+based+on+methacrylated+dextran-graft-lysine+and+gelatin+for+3D+smooth+muscle+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A biomimetic hydrogel based on methacrylated dextran-graft-lysine and gelatin for 3D smooth muscle cell culture.</a> Biomaterials. 31 (6), 1158-1170 (2010).</li>
<li>Raic, A., Rödling, L., Kalbacher, H., Lee-Thedieck, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+macroporous+PEG+hydrogels+as+3D+scaffolds+for+the+multiplication+of+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biomimetic macroporous PEG hydrogels as 3D scaffolds for the multiplication of human hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Biomaterials. 35 (3), 929-940 (2014).</li>
<li>Wong Po Foo, C. T. S., Lee, J. S., Mulyasasmita, W., Parisi-Amon, A., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-component+protein-engineered+physical+hydrogels+for+cell+encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Two-component protein-engineered physical hydrogels for cell encapsulation.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 106 (52), 22067-22072 (2009).</li>
<li>Zhu, J., Marchant, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+properties+of+hydrogel+tissue-engineering+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Med+Devic%22%5BJournal%5D)">Design properties of hydrogel tissue-engineering scaffolds.</a> Expert Rev Med Devic. 8 (5), 607-626 (2011).</li>
<li>Samaryk, V., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/app.30426/abstract">Versatile Approach to Develop Porous Hydrogels with a Regular Pore Distribution and Investigation of their Physicomechanical Properties.</a> J Appl Polym Sci. 114 (4), 2204-2212 (2009).</li>
<li>Li, X. J., Valadez, A. V., Zuo, P., Nie, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+3D+cell+culture%3A+potential+application+for+tissue-based+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">Microfluidic 3D cell culture: potential application for tissue-based bioassays.</a> Bioanalysis. 4 (12), 1509-1525 (2012).</li>
<li>Park, H., Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Swelling+Ratio+of+Injectable+Hydrogel+Composites+on+Chondrogenic+Differentiation+of+Encapsulated+Rabbit+Marrow+Mesenchymal+Stem+Cells+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Effect of Swelling Ratio of Injectable Hydrogel Composites on Chondrogenic Differentiation of Encapsulated Rabbit Marrow Mesenchymal Stem Cells In Vitro.</a> Biomacromolecules. 10 (3), 541-546 (2010).</li>
<li>Stokols, S., Tuszynski, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fabrication+and+characterization+of+linearly+oriented+nerve+guidance+scaffolds+for+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The fabrication and characterization of linearly oriented nerve guidance scaffolds for spinal cord injury.</a> Biomaterials. 25 (27), 5839-5846 (2004).</li>
<li>Sung, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+Impact+of+2D+and+3D+Fibroblast+Cultures+on+In+Vitro+Breast+Cancer+Models%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Understanding the Impact of 2D and 3D Fibroblast Cultures on In Vitro Breast Cancer Models.</a> PLoS One. 8 (10), 1-13 (2013).</li>
<li>Tsai, E. C., Dalton, P. D., Shoichet, M. S., Tator, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+hydrogel+guidance+channels+facilitate+regeneration+of+adult+rat+brainstem+motor+axons+after+complete+spinal+cord+transection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Synthetic hydrogel guidance channels facilitate regeneration of adult rat brainstem motor axons after complete spinal cord transection.</a> J Neurotrauma. 21 (6), 789-804 (2004).</li>
<li>Shoichet, M. S., Li, R. H., White, M. L., Winn, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+hydrogels+used+in+cell+encapsulation%3A+An+in+vitro+comparison+of+alginate+and+agarose%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Stability of hydrogels used in cell encapsulation: An in vitro comparison of alginate and agarose.</a> Biotechnol Bioeng. 50 (4), 374-381 (1996).</li>
<li>Chiu, Y. -C., Kocagöz, S., Larson, J. C., Brey, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+physical+and+mechanical+properties+of+porous+poly+%28ethylene+glycol%29-co-%28L-lactic+acid%29+hydrogels+during+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Evaluation of physical and mechanical properties of porous poly (ethylene glycol)-co-(L-lactic acid) hydrogels during degradation.</a> PloS One. 8 (4), e60728(2013).</li>
<li>Jonker, A. M., Löwik, D. W. P. M., van Hest, J. C. M. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/cm202640w">Peptide- and Protein-Based Hydrogels.</a> Chem Mater. 24 (5), 759-766 (2012).</li>
<li>Bodenberger, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+bread+and+beer%3A+whole+cell+protein+extracts+from+baker%27s+yeast+as+a+bulk+source+for+3D+cell+culture+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biot%22%5BJournal%5D)">Beyond bread and beer: whole cell protein extracts from baker's yeast as a bulk source for 3D cell culture matrices.</a> Appl Microbiol Biot. 101 (5), 1-11 (2016).</li>
<li>Bodenberger, N., Paul, P., Kubiczek, D., Walther, P., Gottschalk, K. E., Rosenau, F. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/slct.201600206/abstract">A novel cheap and easy to handle protein hydrogel for 3D cell culture applications a high stability matrix with tunable elasticity and cell adhesion properties.</a> Chem Sel. 1 (7), 1353-1360 (2016).</li>
<li>Agarwal, S., Wendorff, J. H., Greiner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+electrospinning+technique+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer%22%5BJournal%5D)">Use of electrospinning technique for biomedical applications.</a> Polymer. 49 (26), 5603-5621 (2008).</li>
<li>Hong, J., deMello, A. J., Jayasinghe, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-electrospraying+and+droplet-based+microfluidics%3A+control+of+cell+numbers+within+living+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Biome+Mater%22%5BJournal%5D)">Bio-electrospraying and droplet-based microfluidics: control of cell numbers within living residues.</a> Biome Mater. 5 (2), 21001(2010).</li>
<li>Jayasinghe, S. N., Irvine, S., McEwan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+electrospinning+highly+concentrated+cellular+suspensions+containing+primary+living+organisms+into+cell-bearing+threads+and+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Cell electrospinning highly concentrated cellular suspensions containing primary living organisms into cell-bearing threads and scaffolds.</a> Nanomedicine. 2 (4), 555-567 (2007).</li>
<li>Selimović, Š, Oh, J., Bae, H., Dokmeci, M., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+strategies+for+generating+cell-encapsulating+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers%22%5BJournal%5D)">Microscale strategies for generating cell-encapsulating hydrogels.</a> Polymers. 4 (3), 1554-1579 (2012).</li>
<li>Annabi, N., Nichol, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+porosity+and+microarchitecture+of+hydrogels+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Controlling the porosity and microarchitecture of hydrogels for tissue engineering.</a> Tissue Eng Part B Rev. 16 (4), 371-383 (2010).</li>
<li>Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture+matrices%3A+state+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture matrices: state of the art.</a> Tissue Eng Part B Rev. 14 (1), 61-86 (2008).</li>
<li>Bodenberger, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+methods+for+pore+generation+and+their+influence+on+physio-chemical+properties+of+a+protein+based+hydroge%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech+Rep%22%5BJournal%5D)">Evaluation of methods for pore generation and their influence on physio-chemical properties of a protein based hydroge.</a> Biotech Rep. 12, 6-12 (2016).</li>
<li>Raja, S. T. K., Thiruselvi, T., Mandal, A. B., Gnanamani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH+and+redox+sensitive+albumin+hydrogel%3A+A+self-derived+biomaterial%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">pH and redox sensitive albumin hydrogel: A self-derived biomaterial.</a> Sci Rep. 5, 15977(2015).</li>
<li>Hennink, W. E., van Nostrum, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+crosslinking+methods+to+design+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliver+Rev%22%5BJournal%5D)">Novel crosslinking methods to design hydrogels.</a> Adv Drug Deliver Rev. 64, 223-236 (2012).</li>
<li>Chung, C., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrakis%28hydroxymethyl%29+phosphonium+chloride+as+a+covalent+cross-linking+agent+for+cell+encapsulation+within+protein-based+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Tetrakis(hydroxymethyl) phosphonium chloride as a covalent cross-linking agent for cell encapsulation within protein-based hydrogels.</a> Biomacromolecules. 13 (12), 3912-3916 (2008).</li>
<li>Caló, E., Khutoryanskiy, V. V. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0014305714004091">Biomedical applications of hydrogels: A review of patents and commercial products.</a> Eur Polym J. 65, 252-267 (2015).</li>
<li>Huang, H., Herrera, A. I., Luo, Z., Prakash, O., Sun, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+transformation+and+physical+properties+of+a+hydrogel-forming+peptide+studied+by+NMR%2C+transmission+electron+microscopy%2C+and+dynamic+rheometer%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Structural transformation and physical properties of a hydrogel-forming peptide studied by NMR, transmission electron microscopy, and dynamic rheometer.</a> Biophys J. 103 (5), 979-988 (2012).</li>
<li>Draghi, L., Resta, S., Pirozzolo, M. G., Tanzi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microspheres+leaching+for+scaffold+porosity+control%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mater+Sci%22%5BJournal%5D)">Microspheres leaching for scaffold porosity control.</a> J Mater Sci. 16 (12), 1093-1097 (2005).</li>
<li>Whang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Bone+Regeneration+with+Bioabsorbable+Scaffolds+with+Novel+Microarchitecture%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Engineering Bone Regeneration with Bioabsorbable Scaffolds with Novel Microarchitecture.</a> Tissue Eng. 5 (1), 35-51 (1999).</li>
<li>Ziv, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tunable+silk-alginate+hydrogel+scaffold+for+stem+cell+culture+and+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A tunable silk-alginate hydrogel scaffold for stem cell culture and transplantation.</a> Biomaterials. 35 (12), 3736-3743 (2014).</li>
<li>Butruk-Raszeja, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Athrombogenic+hydrogel+coatings+for+medical+devices--Examination+of+biological+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Colloid+Surface+B%22%5BJournal%5D)">Athrombogenic hydrogel coatings for medical devices--Examination of biological properties.</a> Colloid Surface B. 130, 192-198 (2015).</li>
<li>Lü, S., Li, B., Ni, B., Sun, Z., Liu, M., Wang, Q. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2011/sm/c1sm06053h">Thermoresponsive injectable hydrogel for three-dimensional cell culture: chondroitin sulfate bioconjugated with poly(N-isopropylacrylamide) synthesized by RAFT polymerization.</a> Soft Matter. 7 (22), 10763(2011).</li>
<li>Ruoslahti, E., Pierschbacher, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+perspectives+in+cell+adhesion%3A+RGD+and+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">New perspectives in cell adhesion: RGD and integrins.</a> Science. 238 (4826), 491-497 (1987).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

ייצור מטריצות מקרו-נקבוביות יכול להועיל לתחומים רבים ושונים. יש לו פוטנציאל טכני וכלכלי גבוה בשל המבנה המוגדר של ההידרוג'ל והיכולת לשלוט ולכוונן תכונות חומר ספציפיות. עם זאת, הכנסת אלמנטים מבניים סופרמולקולריים, כגון נקבוביות או תעלות, לתבנית תלת מימדית עשויה להשפיע על התכונות הכוללות של חומר, כגון יחס הנפיחות או הנוקשות. זה יכול לגרום לפירוק, השפלה או התמוטטות לא רצויים של הרשת, ובכך להפוך את החומר לחסר תועלת או פשוט לא ישים עבור היישום הרצוי12. לחלבונים יש פוטנציאל ידוע ליישום בהידרוג'לים בשל המ...

Hydrogels הם חומרים היוצרים לא מסיסים רשתות 3D מסוגל מחייב כמויות גדולות של מים. חומרים כאלה יכולים לספק תנאים סביבתיים מעולים עבור תאים חיים. כיום, שם הוא הגדלת עניין דור של מבנים תלת מימדיים הידרוג בהתפתחות תהליכים כדי להתאים שלהם מאפיינים כימיים ופיזיים. ברגע זו מושגת, תבנית עבור הצמיחה של תאים, המניפולציה של התנהגות הסלולר יכול להיות שנוצר1,2,3,4. אלה מבנים תלת-ממד לא רק ליצור סביבה יותר טבעי ומציאותי יותר גישות קונבנציונליות דו מימדי, אבל הם גם לחשוף בפניך אפשרויות חדשות לצמיחה של תאי גזע או גידול מודלים5. חומרים שונים בעלי טווח של מאפיינים התלויים בעיקר גודל הנקבוביות של ג'ל6. הנקבוביות לשחק תפקיד מכריע תא תרבות יישומים, הנדסת רקמות, וגידול מכוונת של תאי גזע. לדוגמה, חמצן וחומרים מזינים מפוזרת באמצעות המטריקס, ועל כמות מספקת להיות מסוגל להגיע את התאים7. מצד שני, מטבוליטים מזיקות להסירו מהר ככל האפשר, ועל די שטח עבור גדילת התאים להיות זמין7. כתוצאה מכך, המאפיינים של החומר, ובכך גודל הנקבוביות, להשפיע באופן חמור על יישומים אפשריים של האפשר והתועלת של המטריקס. תהליכי צמיחת תאים שונים בהתאם המאפיינים של החומר, יכול להתרחש תרבית תאים תלת-ממד, כולל הקמת מבנים עצביים; הצמיחה ואת התמיינות של תאים בעור או עצם; וגידול בבימויו של שורות תאי גזע מיוחד, כמו hepatocytes או fibroblasts2,3,8,9,10,11. עוד נקודה מכרעת המשפיעים על יישום אפשרי של חומר היא יציבותו כלפי גירויים חיצוניים12. לדוגמה, הידרוג חייב לשמור על שלמותה מכני תא תרבות בתקשורת או על גוף האדם.
בשנים האחרונות, מחקר על hydrogels תרבות תלת התא התעצמה, מחקרים רבים בוצעו כדי לפתור את ארכיטקטורות תלת-ממד של מערכות13. Hydrogels מורכב מרכיבים מסונתז כימית נחקרות הנפוץ ביותר כי הם יכולים להיות בקלות מסונתז והוא כימי ששינה שהם מייצגים את יציבות גבוהה (ראה ז'ו. et al., 2011 לסקירה)5. עם זאת, חלבונים יש תכונות מועילות רבות: כמו מה שנקרא "דיוק פולימרים," הם מסתיימים; יש להם באורך מוגדר; הם קלים יחסית לשינוי; . ויש להם מספר רב של היעד אתרים14,15. בהקשר זה, ניתן להפיק ספציפי מאוד, חדשני מבנים עבור יישום בתחומים רבים. במחקר זה, המבוסס על חלבון הידרוג16 שימש להפגין את היכולת של שיטות ומבוססת להשפיע על הארכיטקטורה תלת-ממד של החומר. יתר על כן, היכולת של ותחולה לדור נקבובית גם נחקר.
טכניקות רבות זמינות לשנות מבנים תלת-ממד, כולל שיטות פשוטות והן בטכניקות מתוחכם, מאוד מיוחדים מתחומים שונים של חומר מדעי. טכניקה נפוצה היא השימוש electrospinning כדי ליצור מבנים מוגדרים היטב17. סיבי טעונה נשלפות מקבוצת פתרון על ידי שדה חשמלי, ואז לחזק עם חשיפה לחמצן. בדרך זו, יכול להיות מיוצר סיבי בטווח של ננומטרים עד מספר מיקרונים. שיטות נוספות לכוון את גודל המבנה, הפצה של הנקבוביות בתוך המטריצה הם הדפס אבן רכה, פוטוליתוגרפיה, מיקוד hydrodynamic, אלקטרו ריסוס, ביו-הדפסה18,19,20. חיסרון משמעותי של טכניקות אלה הוא התלות שלהם על ציוד ספציפי, יקר ולא בחומרים כימיים מיוחדים או חומרים. יתר על כן, ניסיון עם טכניקות אלה הוא לעתים קרובות לא להעברה ישירות חומרים מבוססי חלבונים, רבים של כימיקלים והשיטות אינם תא תואם.
מצד שני, טכניקות רבות אין לסמוך על ציוד מיוחד, שהופך אותם קל וזול כדי להחיל ולאחר להתרבות. שיטה נפוצה עבור מבנה מניפולציה הוא הליהוק הממס21,22,23. חלקיקים נוספים לפני התגובה הפילמור ומופצים למשל כדי להרוות את הפתרון. לאחר הפילמור, שינוי של תנאי לדילול או שינוי pH, מוביל יוצרות של החלקיקים, בעוד הנקבוביות להישאר בתוך החומר. הכימיקלים שמשתמשים בהם בטכניקות אלו, כגון מלח, סוכר, פרפין, ג'לטין, גיר, הם זול וזמין. ב ליופיליזציה, hydrogels נפוחות מוקפאים. סובלימציה עוקבות של השלבים נוזלי תחת ואקום הוא ואז לבצע24,23,25. סובלימציה מים מן הרשת הוא עדין מספיק כדי לשמור על המבנים תלת-ממד מסוים של החומר. גז קצף, פתרון זרמו עם גז, ואילו הפילמור מתרחש, עוזב את הנקבוביות בתוך ג'ל21. ניתן להתאים את גודל ואת ההפצה של הנקבוביות בהתאם זרם הגז.
כדי ליצור את הידרוג חלבון, BSA היא הגיבה כלוריד phosphonium tetrakis (hydroxymethyl) (THPC) בתגובה Mannich-סוג כדי לאפשר היווצרות קשרים הדדיים בין אמינים ראשי הקבוצות הידרוקסי של מולקולה ארבע חמוש מקשר26. אפשרי intermediates מזיקים יוסרו על ידי שטיפה מוגזמת של החומר לאחר התגובה מתרחשת.
מחקר זה מדגים את האפשרות לטיפול חומר מבוסס-BSA עם טכניקות שונות כדי לשנות, להתאים את גודל הנקבוביות. כל אחת מהטכניקות יכול לשמש במעבדה כל ברחבי העולם, אין ציוד מיוחד הכרחי. בנוסף, פרמטרים שונים, כגון יחס נפיחות degradability אנזימטיות, pH ויציבות הטמפרטורה רגישות, היו בחן, לעומת אחד את השני, במיוחד מכבדים להשפעתם של הטכניקות השונות על הדור של ארכיטקטורות תלת-ממד. לבסוף, החומרים היו functionalized עם תא-דבק פפטידים לחקור אפשרי ליישום חומרי תרבית תאים. שתי שורות תאים מודל שונה שימשו: A549 ו- MCF7.

<table><tbody><tr><td>מי מלח חוצץ פוספט (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s שונה Eagle' s בינוני (גלוקוז גבוה)</td><td>Life Technologies / תרמו פישר&nbsp;</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Life Technologies / תרמו פישר&nbsp;</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>טכנולוגיות חיים / תרמו פישר&nbsp;</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>M7145-100 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין EDTA 0.05% פנול</td><td>אדום תרמו פישר 25300062</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אתנול 99.8%, verg&auml; llt</td><td>&Ouml; lfabrik Schmidt</td><td>2133</td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>קארל רות'&nbsp;</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין שבר V</td><td>קארל רות'&nbsp;</td><td>3854.2</td><td></td></tr><tr><td>THPC</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>404861-100 מ"ל</td><td>רעיל</td></tr><tr><td>0.1% טריטון X-100</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>X100-100 מ"ל</td><td>מעט רעיל</td></tr><tr><td>פלואידין-רודמין&nbsp;</td><td>לייף טכנולוג'יז / תרמו פישר&nbsp;</td><td>₪100</td><td></td></tr><tr><td>3.7% פורמלדהיד&nbsp;</td><td>לייף טכנולוג'יז / תרמו פישר&nbsp;</td><td>F8775-25ML</td> רודמין <td>רעיל</td></tr><tr><td>B</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>81-88-9</td><td></td></tr><tr><td>פילטרופור S 0.2&nbsp;</td><td>Sarsted Ag und Co.</td><td>2 83.1826.001&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&מיקרו; שקופית 8 באר</td><td>Ibidi GmbH</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>KCSSGKSRGDS פפטיד</td><td>UPEP Ulm</td> מערכת <td></td><td>מותאמת אישית</td></tr><tr><td>אתנול 99.8%, verg&auml; </td><td>llt קארל רות'&nbsp;</td><td>K928.5</td><td></td></tr><tr><td>פלקון 5 מ"ל שפופרת פוליסטרן עגולה תחתונה&nbsp;</td><td>Sarsted Ag und Co.</td><td>62.547.254&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>שפופרות 50 מ"ל&nbsp;</td><td>Sarsted Ag und Co.</td><td>62.547.254&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>שפופרות 1.5 מ"ל&nbsp; &nbsp;</td><td>Sarsted Ag und Co.</td><td>72,690,001</td><td></td></tr><tr><td>שפופרות 2 מ"ל&nbsp; &nbsp;</td><td>Sarsted Ag und Co.</td><td>72,691</td><td></td></tr><tr><td>מיקרופלייט תרבית תאים, 96 בארות, נ.ב. F-תחתון</td><td>גריינר</td><td>655073</td><td></td></tr><tr><td>מייבש הקפאה אפסילון 1-6D, &nbsp;</td><td>Christ, Osterode am Harz, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי&nbsp;</td><td>Carl Zeiss AG, Oberkochen, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen Software Version 2012 Sp1, מהדורה שחורה, 407 גרסה 8,1,0,484</td><td>Carl Zeiss AG, Oberkochen, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GSA Imaga Analyzer Software, GSA Image Analyzer, GSA, גרסה 419 3.8.7</td><td>GSA GmbH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

טיפול קל של ארכיטקטורות ב hydrogels חלבון מבוססת ליישומים תרבות תא

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Hydrogels מזוהים כחומרי מבטיח ליישומים תרבות תא, בשל היכולת שלהם לספק סביבות תא רטוב מאוד. בתחום תבניות תלת-ממד עולה בשל הדמיון פוטנציאלי של החומרים האלה מטריצה חוץ-תאית טבעיים. Hydrogels חלבון מבוססת מבטיחים במיוחד כי הם יכולים בקלות להיות functionalized ולא ניתן להשיג מבנים המוגדרים עם מאפיינים physicochemical מתכווננת. עם זאת, ייצור תבניות תלת-ממד macroporous ליישומים התרבות תאים, תוך שימוש בחומרים טבעיים לעיתים קרובות מוגבל על ידי שלהם תכונות מכניות חלש יותר בהשוואה לאלו של חומרים סינתטיים. . הנה, הוערכו שיטות שונות כדי לייצר macroporous אלבומין שור (BSA)-מבוסס מערכות הידרוג, עם גדלים נקבובית מתכווננת בטווח של 10-70 מיקרומטר ברדיוס. יתרה מזאת, שיטה להפקת ערוצי בחומר זה חלבון מבוססת כי הם כמה מאות מיקרונים ארוך הוקמה. השיטות השונות כדי לייצר את הנקבוביות, כמו גם את השפעת גודל הנקבוביות על תכונות חומר כגון נפיחות יחס, pH, יציבות טמפרטורה, בהתנהגות השפלה אנזימטיות, נותחו. גודל הנקבוביות נחקרו במדינת מקומיים, נפוחות של hydrogels באמצעות סריקת מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי. הכדאיות ליישומים תרבות תא הוערך באמצעות שינוי פפטיד תא-דבק RGD של המערכת חלבון, שתי שורות תאים דגם: תאי סרטן השד אנושי (A549) ו- adenocarcinomic האנושי מכתשי הבזליים בתאי אפיתל (MCF7).

פיתוח הידרוגלים הפך לאחד התחומים הבולטים ביותר במחקרים ביולוגיים הקשורים למדעי החומרים, עם אלפי ערכים המאונדקסים במאגרי מחקר מדעיים. למרות שההתנהגות של מערכות רבות נחקרה היטב, המניפולציה של רשתות תלת-ממדיות, ובמיוחד של חומרים רגישים המבוססים על חלבונים, מהווה לעיתים קרובות בעיה מרכזית במדעי החומרים. אתגר נפוץ נוסף שנעשה לו הערכת חסר הוא המדידה המדויקת של המבנה הטבעי של חומר באמצעות מיקרוסקופיה אלקטרונית קריוגנית. זאת משום שתהליך הכנת הדגימה (כלומר, ייבוש) משנה לעיתים קרובות את תכ...

שיטות שונות כדי לתפעל אדריכלות תלת מימדי המבוסס על חלבון hydrogels מוערכים פה לגבי תכונות החומר. הרשתות macroporous הן functionalized עם פפטיד תא-דבק, הכדאיות שלהם בתרבות תא מוערך באמצעות שתי שורות תאים מודל שונה.

טיפול קל של ארכיטקטורות ב Hydrogels חלבון מבוססת ליישומים תרבות תא

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

המטרה הכללית של מתודולוגיה זו היא ליצור הידרוג'לים מקרו-נקבוביים עם גדלי נקבים משתנים עבור יישומים של תרביות תאים. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום תרביות התאים בתלת-ממד, כגון ההיתכנות העקרונית של חומר הידרוג'ל חדש עבור יישומים של תרביות תאים בתלת-ממד. היתרון המרכזי של מתודולוגיה זו הוא שהיא מציעה מגוון של טכניקות לאופטימיזציה והתאמה של חומר חדש לדרישותיהם של סוגים שונים של תאים.כדי להתחיל, יש לדלל מיליגרם אחד של הפפטיד RGD או פפטיד דביק לתאים שווה ערך ב-100 microliters של מים סטריליים כדי לקבל תמיסה בריכוז של 10 milligram per milliliter. לאחר מכן, יש להסיר את התחתית של פלטת 96 בארות ולהחליפה בניילון נשירה (removal plastic wrap). ערבבו 100 microliters של תמיסת מלאי BSA ו-100 microliters של תמיסת מלאי THPC בפלטת 96 הבארות כדי לקבל 200 microliters של ההידרוג'ל.ערבבו את הרכיבים באמצעות פיפוט מעלה ומטה לפחות חמש פעמים כדי להבטיח הידרוג'ל אחיד לאחר הפולימריזציה. השאירו את פלטת 96 הבארות בטמפרטורת החדר למשך כ-10 דקות עד שכל ההידרוג'לים יעברו פולימריזציה תקינה. לאחר הפולימריזציה, הסירו בזהירות ובאיטיות את ניילון הנטיפה מתחתית הפלטה.הוצא את ההידרוגלים מלוח 96 הבארות באמצעות דקירה קלה והעבר אותם למבחנות של 1.5 מיליליטר המכילות PBS סטרילי pH 7.4. אחסן את ההידרוגלים בתמיסת סליין עם בופר פוספט בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים. לצורך ליוסיפיקו (freeze-dry) של ההידרוגלים, מלא תחילה מבחנות של 1.5 מיליליטר ב-500 מיקרוליטר של מים סטריליים ד-יוניזים והסר את הפקקים.העבירו את ההידרוג'לים לתוך מבחנות תגובה של 1.5 מיליליטר באמצעות פינצטה. עטפו את המבחנות של 1.5 מיליליטר בחוזקה בסרט פאראפין, תוך שימוש בשלוש שכבות לפחות עבור כל מבחנה. השתמשו במחט כדי לנקוב חורים קטנים בסרט כדי לאפשר שחרור גזים מהמבחנות.כדי להבטיח שהמים וההידרוג'ל יקפאו לחלוטין, העבירו את המבחנה לתמיסת חנקן נוזלי למשך חמש דקות. מיד לאחר ההוצאה מהחנקן הנוזלי, העבירו את המבחנות למקפיא-ליוואר (freeze-dryer) כדי למנוע מהחומר להפשיר. כשלב הקפאה חלופי, שמרו את המבחנות במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי להקפיא את ההידרוג'לים באיטיות.מיד לאחר ההוצאה ממינוס 20 מעלות צלזיוס, העבירו את המבחנות למייבש ההקפאה (freeze-dryer) כדי למנוע מהחומר להפשיר. לאחר 24 שעות ואידוי מלא של המים בתוך ומסביב להידרוג'ל, הפשירו את החומר על ידי הוצאתו ממייבש ההקפאה. לצורך השכיה (leaching) של חלקיקים, ערבבו את רכיבי ההידרוג'ל כפי שנעשה קודם לכן.לאחר הערבוב, יש להוסיף מיד sodium chloride עד להגעה לרוויה. הוסיפו מלח עד שגיבי מלח ייראו בתמיסה כמשקע לבן. ניתן לשנות את גודל הנקבים על ידי גריסת גיבי המלח לפני השימוש.העבירו את פלטת 96 הבארות למנער ונערה עד להתרחשות הפולימריזציה. לאחר כ-10 דקות, הוציאו את ההידרוג'לים מהפלטה כפי שבוצע קודם לכן. דגרו את ההידרוג'לים למשך 24 שעות לפחות בטמפרטורת החדר במים סטריליים על גבי רוטטור כדי להמיס (elute) את כל המלח מתבנית ההידרוג'ל.יש לאחסן את ההידרוג'לים בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס ב-PBS למשך מספר חודשים. ליצירה עדינה, הכינו את ההידרוג'לים כפי שמתואר. לאחר מכן, הוציאו הידרוג'ל מהתמיסה באמצעות פינצטה.הסיר את עודפי המים באמצעות נייר סופג בעל יכולת ספיגה גבוהה והנח את ההידרוג'ל על גבי בלוק של קרח יבש. הקפא את ההידרוג'ל למשך 30 שניות והסרו בזהירות מהבלוק. יש להימנע מגרימה לנזק להידרוג'ל.השתמשו בזהירות בשפכד כדי לגרד את החומר מהבלוק. העבירו את ההידרוג'ל למבחנה בנפח 1.5 milliliter וייבשו אותו למשך הלילה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. הכינו תמיסת מלאי של Rhodamine B וכן דילולים סדרתיים כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.הוציאו את ההידרוג'ל מהתמיסה בה הוא אוחסן והעבירו אותו למבחנה של 1.5 מיליליטר עם מיליליטר אחד של תמיסת Rhodamine B בריכוז 0.01 מיליגרם למיליליטר. צבעו את ההידרוג'ל בן לילה בתמיסת Rhodamine B בטמפרטורת החדר. למחרת, העבירו את ההידרוג'ל המיועד לוויזואליזציה ל-10 מיליליטר של PBS ושטפו למשך שלוש שעות לפחות.חתכו פרוסות קטנות מההידרוג'ל באמצעות להב. לאחר מכן, העבירו את ההידרוג'ל לשקופית מיקרוסקופית בעלת שמונה בארות וכסו אותו ב-PBS. באמצעות מיקרוסקופ סריקה לייזר קונפוקלי, הדמיאו את ההידרוג'ל באורך גל של 514 nanometers.סננו את כל תמיסות המלאי באמצעות מסנן סטרילי של 0.45 מיקרון. התחילו בהכנת ההידרוג'ל והוסיפו את הפפטיד להדבקת תאים לפני פולימריזציית ההידרוג'ל. לאחר ערבוב הרכיבים, העבירו מיד באמצעות פיפט את התערובת לתוך זכוכית כיסוי מיקרוסקופית בעלת שמונה בארות עד שהתחתית תהיה מכוסה לחלוטין.העבירו את התאים למצע תרבית תאי DMEM סטרילי שחומם מראש, המועשר בסרום בקר עוברי (fetal bovine serum), פניצילין סטריפטומייצין ותמיסת חומצות אמינו לא חיוניות. לאחר ספירת התאים באמצעות תא ספירה של Neubauer, העבירו בזהירות באמצעות פיפט 200 µL מהמספר הרצוי של תאים אל פני ההידרוג'ל. כסו את השקופית המיקרוסקופית בעלת שמונה הבארים במכסה והעבירו אותה לאינקובטור.לאחר ארבע שעות לפחות של היצמדות תאית, שטפו את התאים פעמיים עם 200 µL של PBS סטרילי לתרבית תאים. לאחר מכן, קבעו את התאים עם 200 µL של 3.7% formaldehyde למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ושטפו פעמיים עם PBS. בצעו פרמיאביליזציה לתאים עם 200 µL של 0.1% Triton X למשך חמש דקות, לפני שטיפה נוספת של פעמיים עם PBS.צבע את התאים ב-Toluidine Rhodamine על ידי ערבוב של 5 µL מהמלאי המהול במתנול עם 195 µL של PBS והוספתו לתאים בטמפרטורת החדר. צבע את התאים למשך 20 דקות בחושך לפני שטיפה כפולה עם PBS. בחן את תכונות ההיצמדות של התאים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי באורך גל של 514 nm.נתח את תכונות ההידרוג'ל כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. כפי שמוצג כאן, להידרוג'לים שעברו פולימריזציה וצביעה אין מבנים ייחודיים. לאחר ייבוש בהקפאה של ההידרוג'לים בטמפרטורות שונות, ניתן להרחיב את הגודל הממוצע של הנקבים בתוך ההידרוג'ל עד ל-60 microns.השצאת מלח גורמת להיווצרות רשתות אחידות עם גדלי נקבוביות של כ-10 microns. ניתן להתאים את הגודל עוד יותר על ידי טחינת גבישי המלח לפני השימוש. שימוש בגישת הקפאה מדורגת על גוש של קרח יבש מוביל להיווצרות תעלות בעלות קוטר של כ-20 microns ואורך של כמה מאות microns.לפני הפונקציונליזציה באמצעות רכיב הדבקת התאים, תאים אינם יכולים להיצמד לפני השטח של ההידרוג'ל ומראים מורפולוגיה עגולה. רק לאחר אספקת הפפטיד להדבקת תאים לחומר, התאים מוצאים נקודות היצמדות מוקדיות (focal adhesion points) המאפשרות היצמדות תקינה של התא לחומר. דבר זה הוא קריטי לשימוש בחומרים חדשניים ביישומי תרביות תאים בתלת-ממד.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לשנות את ארכיטקטורת ההידרוג'ל באמצעות שיטות פשוטות. ניתן להחיל שיטה זו על רוב מערכות ההידרוג'ל החדשניות כדי ללמוד על השימוש בהן בתרביות תאים ולהבטיח אופטימיזציה של ארכיטקטורת ההידרוג'ל בהתאם לשימוש המיועד.

easy-manipulation-architectures-protein-based-hydrogels-for-cell

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

בפרוטוקול זה, אנו מדגימים את ייצור של מערך microactuator מכלל הודעות העקורים אנכית שבו הטכנולוגיה מבוססת, ואיך הטכנולוגיה הזו בסיס ניתן לשנות לנהל תפוקה גבוהה תרבית תאים דינמי מכנית בתרבות הן דו מימדי ותלת מימדי פרדיגמות.

פלטפורמות microfabricated לתרבות Cell דינמי מכאני

טכניקות פשוטות מתוארים לייצור מהיר של microfabricated מערכות תרבות עצביים באמצעות מכשיר micromirror דיגיטלי ליתוגרפיה הקרנת דינמי מסכה על מצעים תרבות קבוע התא. אלה מערכות תרבות יכול להיות נציג נוסף של ארכיטקטורה ביולוגי טבעי, ואת הטכניקות המתוארות יכול להיות מותאם עבור יישומים רבים.

המצאה של הידרוג micropatterned למערכות התרבות עצבית באמצעות photolithography דינמי הקרנה מסכת

אנו מציגים הידרוג'ל חדש polyacrylamide, נקרא הידרוקסי-PAAm, המאפשר ישיר מחייב של חלבוני ECM עם עלות או מומחיות מינימאלית. שילוב של הידרוקסי-PAAm הידרוג עם הדפסת microcontact מאפשרת שליטה עצמאית של רמזים רבים של microenvironment התא הטבעי ללימוד mechanostransduction הסלולרי.

הכנת הידרוקסי-PAAm הידרוג לצימוד האפקטים של רמזי mechanotransduction

אנו מציגים את הסינתזה של הידרוג'ל-תיווך intein פיצול חלבון. אבני הבניין של הידרוג'ל הזה הוא שני קופולימרים חלבון המכילים כל מקטע של חלבון trimeric המשמש כcrosslinker וחצי אחד של intein מפוצלת. ערבוב של שני קופולימרים החלבון מעורר תגובת טרנס שחבור intein, מניב יחידת פוליפפטיד שעצמי מרכיבה לתוך הידרוג'ל. הידרוג'ל זו משלבת חלבונים כדוריים מאוד פונקציונליים pH והטמפרטורה יציבה, תואם עם ממסים אורגניים, ובקלות.

סינתזה של חלבון מלאכותי בתיווך intein Hydrogel

אנו מתארים ייצור של יריעות הידרוג'ל בתבנית מיקרו בתהליך פשוט, הניתן להרכבה ולתפעל בצורה עצמאית. באמצעות יריעות הידרוג'ל מודולריות אלה, ניתן ליצור מערכת תרבית תאים תלת מימדית פשוטה בקנה מידה מאקרו עם מיקרו-סביבה תאית מבוקרת.

בנייה של גיליונות מודולרי Hydrogel לאדריכלות סלולרית 3D המוקטן מאקרו micropatterned

אנו מתארים תהליך רציף להיווצרות בתיווך אור ודפוס ביוכימי לאחר מכן של מטריצות הידרוג'ל סינתטיות ליישומי תרבית תאים תלת מימדיים. מודגמת בנייה ושינוי של הידרוג'לים עם כימיה של פוטו-קליק תואם ציטו. בנוסף, מוצגות טכניקות קלות לכימות והתבוננות בדפוסים וקביעת כדאיות התאים בתוך הידרוג'לים אלה.

אור בתיווך גיבוש דפוסים של הידרוג עבור יישומי תרבית תאים

בשיטה זו, אנו משתמשים photopolymerization, לחץ על כימיה טכניקות ליצירת דפוסים חלבון או פפטיד על פני השטח של hydrogels פוליאתילן גליקול (PEG), מתן מתאושש אותות ביו לצורך המחקר של תגובות הסלולר במבחנה .

תכנים חלבונים ביו או פפטידים על הידרוג באמצעות פוטוכימיה עבור יישומים ביולוגיים

Hydrogels מהונדסים חלבון רקומביננטי הן ממינוי תרבית תאים 3D הם מאפשרים tunability מלאה של עמוד השדרה פולימר ולכן, microenvironment את התא. כאן, אנו מתארים התהליך של היטהרות חלבון רקומביננטי כמו אלסטין ויישומו בחיי הידרוג 3D תא אנקפסולציה.

הייצור של חלבון כמו אלסטין Hydrogels כימוס, Immunostaining של תאים ב- 3D

. הנה, פרוטוקול מוצג לבצע, culturing בתאי poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized עם fluorogenic מטריקס מטאלו-פרוטאינאז (MMP)-פפטיד מתכלה. MMP הסלולר ופעילות מטבולית נמדדים ישירות מן התרבויות הידרוג שימוש בקורא microplate סטנדרטיים.

מדידת הסלולר העולמי מטריקס מטאלו-פרוטאינאז ופעילות מטבולית Hydrogels תלת-ממד

השיטה המוצגת כוללת מתיחה חד-אקסיאלית של הידרוג'לים רכים תלת-ממדיים המוטמעים בגומי סיליקון תוך מתן אפשרות למיקרוסקופיה קונפוקלית חיה. אפיון של זני הידרוג'ל חיצוניים ופנימיים, כמו גם יישור סיבים מודגמים. המכשיר והפרוטוקול שפותחו יכולים להעריך את התגובה של תאים למשטרי זנים שונים.

זן מבוקר של הידרוג'ל תלת מימדי תחת הדמיה מיקרוסקופית חיה

למדו כיצד ליצור הידרוגלים מקרופורוזיים מבוססי חלבון עם גדלי נקבוביות משתנים ליישומי תרבית תא תלת-ממדית. השיטה מאפשרת אופטימיזציה של תכונות החומר עבור סוגי תאים שונים.

טיפול קל של ארכיטקטורות ב Hydrogels חלבון מבוססת ליישומים תרבות תא

גלה סרטונים נוספים