טיפול קל של ארכיטקטורות ב Hydrogels חלבון מבוססת ליישומים תרבות תא
August 4th, 2017
שיטות שונות כדי לתפעל אדריכלות תלת מימדי המבוסס על חלבון hydrogels מוערכים פה לגבי תכונות החומר. הרשתות macroporous הן functionalized עם פפטיד תא-דבק, הכדאיות שלהם בתרבות תא מוערך באמצעות שתי שורות תאים מודל שונה.
המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא ליצור הידרוג'לים מקרו-נקבוביים עם גדלי נקבוביות משתנים ליישומי תרבית תאים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום תרבית תאים תלת מימדית כגון ההיתכנות העקרונית של חומר הידרוג'ל חדש ליישומי תרבית תאים תלת מימדית. היתרון העיקרי של מתודולוגיה זו הוא שהיא מציעה מגוון טכניקות לייעול והתאמת חומר חדש לדרישות של סוגים שונים של תאים.
כדי להתחיל, יש לדלל מיליגרם אחד של פפטיד RGD או פפטיד דבק תאים שווה ערך ב-100 מיקרוליטר מים סטריליים כדי לקבל את התמיסה של 10 מיליגרם למיליליטר. לאחר מכן, הסר את החלק התחתון של צלחת 96 באר והחלף אותה בניילון נצמד להסרה. מערבבים 100 מיקרוליטר של תמיסת מלאי BSA ו-100 מיקרוליטר של תמיסת מלאי THPC בצלחת 96 בארות כדי לקבל 200 מיקרוליטר של ההידרוג'ל.
מערבבים את הרכיבים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה לפחות חמש פעמים כדי להבטיח הידרוג'ל אחיד לאחר פילמור. מניחים את צלחת 96 הבאר בטמפרטורת החדר למשך כ -10 דקות עד שכל ההידרוג'לים מפולימרים כראוי. לאחר פילמור, הסר בזהירות ובאטיות את הניילון מתחתית הצלחת.
לחץ את ההידרוג'לים מצלחת 96 הבאר באמצעות דקירה קטנה והעביר אותם לצינורות של 1.5 מיליליטר עם PBS pH 7.4 סטרילי. אחסן את ההידרוג'לים בתמיסת מלח חוצצת פוספט בארבע מעלות צלזיוס עד מספר חודשים. כדי לייבש בהקפאה את ההידרוג'לים, מלאו תחילה צינורות של 1.5 מיליליטר ב -500 מיקרוליטר מים סטריליים דה-יונים והסירו את המכסים.
העבירו את ההידרוג'לים לצינורות התגובה של 1.5 מיליליטר באמצעות מלקחיים. עטפו היטב את צינורות ה-1.5 מיליליטר בסרט פרפין בעזרת שלוש שכבות לפחות לכל בקבוקון. השתמש במחט כדי לנקב חורים קטנים בסרט כדי לאפשר שחרור גז מהצינורות.
כדי להבטיח שהמים וההידרוג'ל יקפאו לחלוטין, העבירו את הבקבוקון לתמיסת חנקן נוזלי למשך חמש דקות. מיד לאחר הוצאתם מהחנקן הנוזלי, העבירו את הבקבוקונים למייבש ההקפאה כדי למנוע את הפשרת החומר. כשלב הקפאה חלופי, שמור את הבקבוקונים במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי להקפיא לאט את ההידרוג'לים.
מיד לאחר הוצאתם ממינוס 20 מעלות צלזיוס, העבירו את הבקבוקונים למייבש ההקפאה כדי למנוע את הפשרת החומר. לאחר 24 שעות ואידוי מוחלט של המים בתוך ההידרוג'ל וסביבו, יש להפשיר את החומר על ידי הוצאתו ממייבש ההקפאה. לשטיפת חלקיקים, מערבבים את מרכיבי ההידרוג'ל כמו קודם.
לאחר הערבוב, יש להוסיף מיד נתרן כלורי עד לרוויה. מוסיפים מלח עד שניתן לראות גבישי מלח בתמיסה כמשקעים לבנים. ניתן לשנות את גודל הנקבוביות על ידי טחינת גבישי המלח לפני השימוש.
מעבירים את צלחת 96 הבאר לשייקר ומנערים עד לפילמור. לאחר כעשר דקות מוציאים את ההידרוג'לים מהצלחת כמו קודם. דגרו את ההידרוג'לים למשך 24 שעות לפחות בטמפרטורת החדר במים סטריליים על מסובב כדי לסלק את כל המלח מתבנית ההידרוג'ל.
אחסן את ההידרוג'לים בארבע מעלות צלזיוס ב-PBS עד מספר חודשים. להיווצרות עדינה, הכינו הידרוג'לים כמתואר. לאחר מכן הסר הידרוג'ל מהתמיסה בעזרת מלקחיים.
הסר את עודפי המים בעזרת נייר סופג מאוד והניח אותם על גבי גוש קרח יבש. הקפיאו את ההידרוג'ל למשך 30 שניות והוציאו אותו בזהירות מהבלוק. אל תפגע בהידרוג'ל.
השתמש בזהירות במרית כדי לגרד אותה מהבלוק. מעבירים את ההידרוג'ל לצינור של 1.5 מיליליטר ומייבשים אותו למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס. הכן תמיסת מלאי רודמין B וכן דילולים סדרתיים כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
הסר את ההידרוג'ל מהתמיסה המאוחסנת והעביר אותו לצינור של 1.5 מיליליטר עם מיליליטר אחד של 0.01 מיליגרם לתמיסת רודמין B למיליליטר. מכתימים את ההידרוג'ל למשך הלילה בתמיסת רודמין B בטמפרטורת החדר. למחרת, העבירו את ההידרוג'ל שיש לדמיין ל -10 מיליליטר PBS ושטפו לפחות שלוש שעות.
חותכים פרוסות קטנות מההידרוג'ל בעזרת להב. לאחר מכן העבירו את ההידרוג'ל לשקופית מיקרוסקופית של שמונה בארות וכסו אותה ב-PBS. באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי, דמיין את ההידרוג'ל באורך גל של 514 ננומטר.
מסנן סטרילי כל פתרונות המלאי עם פילטר 0.45 מיקרון. התחל בהכנת ההידרוג'ל וכלול את פפטיד דבק התא לפני פילמור הידרוג'ל. לאחר ערבוב הרכיבים, פיפטה מיד את התערובת לשקופית מיקרוסקופית של שמונה בארות עד לכיסוי מלא של התחתית.
העבירו את התאים למדיום תרבית תאי DMEM סטרילי שחומם מראש בתוספת סרום בקר עוברי, סטרפטומיצין פניצילין ותמיסת חומצות אמינו לא חיוניות. לאחר ספירת התאים עם תא ספירה של נויבאואר, פיפטה בזהירות 200 מיקרוליטר ממספר התאים הרצוי על משטח ההידרוג'ל. מכסים את השקופית המיקרוסקופית שמונה היטב במכסה ומעבירים אותה לחממה.
לאחר לפחות ארבע שעות של חיבור תאי, שטפו את התאים פעמיים עם 200 מיקרוליטר של תרבית תאים סטרילית PBS. לאחר מכן, תקן את התאים עם 200 מיקרוליטר של 3.7% פורמלדהיד למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ושטוף פעמיים עם PBS. לחדור לתאים עם 200 מיקרוליטר של 0.1% טריטון X למשך חמש דקות לפני שטיפה פעמיים נוספות עם PBS.
צבעו את התאים בטולואידין רודמין על ידי ערבוב חמישה מיקרוליטרים של מלאי מתנולי עם 195 מיקרוליטר PBS והוספתו לתאים בטמפרטורת החדר. מכתים את התאים למשך 20 דקות בחושך לפני הכביסה פעמיים עם PBS. חקור את תכונות ההידבקות של התאים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי ב-514 ננומטר.
נתח את תכונות ההידרוג'ל כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כפי שמוצג כאן, להידרוג'לים הפולימריים והמוכתמים אין ארכיטקטורות ייחודיות. לאחר ייבוש בהקפאה של ההידרוג'ל בטמפרטורות שונות, ניתן להאריך את הגודל הממוצע של הנקבוביות בתוך ההידרוג'ל עד 60 מיקרון.
שטיפת מלח מביאה לרשתות אחידות עם גדלי נקבוביות של כ-10 מיקרון. ניתן לכוונן את הגודל עוד יותר על ידי טחינת גבישי מלח לפני השימוש. השימוש בגישת הקפאת שיפוע על גוש קרח יבש מוביל להיווצרות תעלות בקוטר של כ -20 מיקרון ואורך של כמה מאות מיקרון.
לפני הפונקציונליזציה עם חלק דבק התא, תאים אינם יכולים להיצמד לפני השטח של ההידרוג'ל ולהראות מורפולוגיה עגולה. רק לאחר שסיפקו לחומר את פפטיד הדבק של התא, התאים מוצאים נקודות הידבקות מוקדיות המאפשרות הידבקות נכונה של התא לחומר. זה חיוני לשימוש בחומרים חדשים ביישומי תרבית תאים תלת מימדית.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתפעל את הארכיטקטורה של הידרוג'ל בשיטות פשוטות. ניתן ליישם שיטה זו עבור רוב מערכות ההידרוג'ל החדשניות כדי ללמוד על השימוש בתרבית תאים ולייעל את ארכיטקטורת ההידרוג'ל בהתאם לשימוש המיועד.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
מחקר זה מעריך שיטות שונות למניפולציה של הארכיטקטורה התלת-ממדית של הידרוג'לים מבוססי חלבון, תוך התמקדות במאפייני החומר ובהתאמתם לתרבית תאים. ההידרוג'לים מותאמים עם פפטיד דביק לתאים ונבדקים עם קווי תאים שונים.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- חומרים ביולוגיים
- תרבית תאים
- הנדסת הידרוג'לים
רקע
- תרבית תאים תלת-ממדית היא חיונית להדמיה של סביבות in vivo.
- הידרוג'לים יכולים לספק מטריצה תומכת לגידול תאים.
- פפטידים דביקים לתאים משפרים את הצמדת התאים והתפשטותם.
- מבנים מקרופוריים יכולים להשפיע על חילוף חומרים ותזונה פסולת.
מטרת המחקר
- ליצור הידרוג'לים מקרופוריים עם גדלי נקבוביות משתנים לתרבית תאים.
- להעריך את היתכנותם של חומרים חדשניים של הידרוג'לים ליישומים של תרבית תאים תלת-ממדית.
- לייעל את תכונות ההידרוג'לים עבור סוגי תאים שונים.
שיטות בשימוש
- דילול פפטיד RGD במים סטריליים ליצירת פתרון דביק לתאים.
- שינוי צלחת 96 באר להכנת הידרוג'ל.
- ערבוב תמיסות BSA ו-THPC כדי ליצור את ההידרוג'ל.
- הערכת ביצועי ההידרוג'ל עם קווי תאים מודל.
תוצאות עיקריות
- יצירה מוצלחת של הידרוג'לים מקרופוריים עם תכונות מתכווננות.
- ההידרוג'לים הוכיחו תאימות עם תרבית תאים.
- פפטידים דביקים לתאים שיפרו את הצמדת התאים.
- גדלי נקבוביות שונים השפיעו על התנהגות והתפתחות התאים.
מסקנות
- המתודולוגיה מספקת גישה רב-תכליתית לפיתוח הידרוג'לים.
- ניתן לכוונן הידרוג'לים מותאמים עבור סוגי תאים ספציפיים.
- מחקר זה תורם להתפתחויות בטכנולוגיות תרבית תאים תלת-ממדית.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Protein-based hydrogels with tunable macroporous architectures enable systematic evaluation of 3D cell culture conditions, supporting target validation through physiologically relevant microenvironments. Adjustable pore sizes and channel formation allow de-risking of lead candidates by modeling nutrient diffusion and cellular response variability. This approach enhances predictive confidence in preclinical models by bridging reductionist assays with tissue-like complexity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in 3D contexts that better reflect in vivo tissue architecture and cell-ECM interactions.
- Operational Value: Provides a tunable platform to assess target engagement across varying microenvironmental conditions, reducing false positives from 2D systems.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by linking hydrogel architecture to cellular phenotypes, improving target confidence before lead optimization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates reproducible, quantifiable hydrogel substrates with defined pore sizes (10–70 µm radius) for standardized compound screening.
- Operational Value: Enables assay scalability through simple salt-leaching and gradient-freezing methods compatible with 96-well formats.
- Assay Readiness: Produces stable, cell-adhesive (RGD-functionalized) hydrogels suitable for long-term culture and imaging via confocal microscopy.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports progression from discovery to preclinical testing by maintaining consistent hydrogel properties across workflow stages.
- Disease-Relevant Modeling: Allows evaluation of cell lines (e.g., A549, MCF7) in engineered microenvironments that mimic stromal barriers and interstitial flow.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables porosity-dependent screening to identify compounds effective under diffusion-limited conditions, improving clinical translatability.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to preclinical evaluation, offering a tunable extracellular matrix mimic for iterative design-test cycles.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on how matrix porosity influences signaling, proliferation, and drug response in cancer models.
- Screening: Delivers pore-size-graded hydrogels enabling dose-response analysis under varied mass transport conditions.
- Analytics: Provides confocal-readable, Rhodamine B-stained architectures for quantitative pore characterization and correlation with functional outcomes.
- Translational Research: Supports biomarker-aligned studies by maintaining hydrogel integrity during prolonged culture and fixation steps.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular hydrogel platform adaptable to multiple cell types and pore specifications without reformulation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in 3D cell responses to pharmacological perturbations.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized hydrogel fabrication, storage (4°C in PBS), and visualization protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying compounds effective in diffusion-limited, tissue-like microenvironments.
- Portfolio Impact: Enables risk-stratified prioritization of leads based on performance across hydrogel architectures with varying pore sizes and channels.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hydrogel formulation, peptide functionalization, and confocal microscopy for structural analysis.
- Depends on access to freeze-dryers, liquid nitrogen or -20°C storage, and shakers for salt leaching and hydrogel maturation.
- Necessitates cross-team standardization of hydrogel preparation steps to ensure batch-to-batch consistency in pore size and swelling behavior.
- Involves adaptation considerations when transferring the method to other protein-based systems beyond BSA, particularly regarding gelation kinetics and peptide compatibility.
- Practical limitations include mechanical fragility of macroporous hydrogels, necessitating careful handling during transfer and imaging steps.
