והקאה הפתוגן הקרנה באמצעות מגנטו-פלורסנט ננו-חיישן: איתור מהיר של e. Coli O157:H7

המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא לתכנן ולסנתז ננו-חיישנים דו-מודאליים המסוגלים לזהות מזהמים חיידקיים כגון E.coli O157:H7. ננו-חיישנים מגנטו-פלואורסצנטיים מסונתזים על ידי תפקוד ננו-חלקיקי תחמוצת ברזל באמצעות הליך דו-שלבי. ראשית, נוגדנים מכוונים מצומדים לפני השטח של הננו-חלקיק.

ואז נטען צבע פלואורסצנטי בקידוד שלו. השילוב של שיטות אלה מאפשר זיהוי מהיר ורגיש של מזהמים חיידקיים בתמיסות נמוכות ומרוכזות מאוד. בנוכחות כמות קטנה של חיידקים, הננו-חיישנים יתגודדו סביב החיידקים עקב מיקוד הנוגדנים המצומדים.

נחיל זה משנה את האינטראקציות של הליבה המגנטית של הננו-חיישנים עם פרוטוני המים שמסביב, ומאפשר זיהוי רגיש של שינויים בערכי הרפיה מגנטית. ככל שריכוז המזהמים החיידקיים בתמיסות עולה, הנחילים פוחתים ויכולתה של השיטה המגנטית לכמת זיהום מצטמצמת. עם זאת, ככל שריכוז החיידקים עולה, כך גם ההגשה הפלואורסצנטית של הננו-חיישנים הביולוגיים.

מסיבה זו חשוב השילוב של שיטות מגנטיות ופלואורסצנטיות. השילוב איפשר לזהות רק יחידה אחת של יצירת מושבה של E.coli O157:H7 תוך דקות. השלב הראשון במערכת של ננו-חיישנים מגנטו-פלואורסצנטיים הוא הכנת תמיסת מלח ברזל המורכבת מכלוריד ברזל וברזל כאחד.

המגהץ יספק לננו-חיישנים ליבה מגנטית המאפשרת את התאמתו לפלטפורמות הרפיה מגנטית. פתרונות נוספים הדרושים הם חומצה פוליאקרילית ואמוניום הידרוקסיד. חומצה הידרוכלורית מוחדרת לתמיסת מלח הברזל, אשר מתווספת לאחר מכן לתמיסת האמוניום הידרוקסיד תוך כדי מערבולת.

לבסוף מוסיפים את תמיסת החומצה הפוליאקרילית, והתערובת המתקבלת מערבולת למשך שעה נוספת בזמן שהתגובה נמשכת. התמיסה המתקבלת היא צנטריפוגה על מנת לזרז את המולקולות הגדולות יותר ולבודד ננו-חלקיקים שגודלם קטן מ-100 ננומטר. לאחר מכן התמיסה עוברת דיאליזה למשך הלילה לטיהור.

השלב הבא הוא צימוד של נוגדנים ממוקדים לקידוד החומצה הפוליאקרילית של ננו-חלקיקי חומצת הברזל המסונתזים החדשים. החומרים הדרושים כוללים מאגר MES, EDC, NHS והנוגדנים שנבחרו. EDC מתווסף תחילה לתמיסת הננו-חלקיקים, לאחר מכן NHS ולבסוף הנוגדן.

לאחר מכן מניחים את התערובת על מערבל שולחני למשך שלוש שעות בזמן שהתגובה נמשכת. התמיסה מטוהרת באמצעות עמוד מגנטי. העמודה הממוגנטת לוכדת את הננו-חלקיקים, ומאפשרת רק לנוגדנים צפים חופשיים לצאת.

לאחר מכן העמוד נשטף עם מאגר PBS, ונאספים הננו-חיישנים המצומדים. לאחר מכן הננו-חלקיקים מוכנים לתוספת של צבע פלואורסצנטי, ומספקים את שיטת המפתח השנייה המשמשת לזיהוי. אחד המאפיינים המרכזיים ביותר של הננו-חיישן שלנו הוא השילוב של השיטות המגנטיות והפלואורסצנטיות, וזה חשוב ממספר סיבות.

ראשית, השילוב של השיטות מאפשר לכל אחת מהן להצליב את השנייה, מה שמפחית מאוד את הסיכון לתוצאות חיוביות כוזבות ושליליות כוזבות, שהוא אחד המכשולים הגדולים ביותר העומדים בפני פלטפורמות אבחון שונות המשמשות כיום. ושנית, השילוב של השיטות מרחיב מאוד את הטווח שבתוכו אנו יכולים לא רק לזהות אלא גם לכמת זיהום חיידקי. השלב האחרון בהכנת הננו-חיישנים הוא אנקפסולציה של צבע פלואורסצנטי בקידוד הננו-חלקיק.

זה מושג פשוט על ידי הוספת צבע לתמיסה תוך כדי מערבולת, ולאחר מכן מתן זמן נוסף לצבע להתפזר לתוך הקידוד של הננו-חיישן. לאחר מכן, הננו-חיישנים המתפקדים במלואם עוברים דיאליזה אחרונה לטיהור. על מנת לאפיין את הננו-חיישנים, הגודל וההגשה הפלואורסצנטית נרשמים באמצעות zetasizer וקורא לוחות פלואורסצנטיים.

דגימה קטנה של הננו-חיישן מתווספת לתמיסת מים קובטה ומונחת ב-zetasizer לרישום הגודל. לצורך ניתוח הקרינה, דגימה של הננו-חיישן מונחת על צלחת של 96 בארות ומוכנסת לקורא לוחות הקרינה. באופן אידיאלי, הננו-חיישנים יהיו בקוטר של כ-70 ננומטר, ובעלי הגשה פלואורסצנטית של 575 ננומטר.

בנוסף לסינתזה של הננו-חיישנים, תרבית חיידקים נחוצה כדי לספק את מטרות החיידקים במעבדה. מלאי גליצרול של חיידקים משמש להכנת תרבית במרק תזונתי. לאחר מכן מותר לתמיסה זו לדגור.

לאחר תקופת הדגירה הראשונית, מבוצעים דילולים סדרתיים על מנת להשיג מגוון רחב של ריכוזי חיידקים. מאה מיקרוליטר מכל ריכוז מצופים לצלחת מקדחה מזינה ולאחר מכן מודגרים למשך 24 שעות. לאחר הדגירה הזו המושבות על כל צלחת נספרות על מנת לקבוע את היחידה היוצרת של המושבה, או ספירת CFU למיליל של כל מלאי מדולל.

כעת, לאחר שהוכנו תמיסות מלאי החיידקים, ניתן להשתמש בהן בשילוב עם הננו-חיישנים המוכנים. והיבט חשוב אחד של הסרוטיפ המסוים הזה של החיידק שמבדיל אותו מסרוטיפים אחרים הוא כמו נניח שאם אתה נדבק בסרוטיפים האחרים, אתה צריך שיהיו לך יחידות רבות ליצירת מושבה כדי לקבל זיהום. אבל ב-E.coli הספציפי הזה 10 עד 100 יחידות CFU או יחידות יוצרות מושבה מספיק טובות כדי לגרום לך לזיהום.

הטכנולוגיה שלנו מבוססת בצורה כזו שלא מפספסים אפילו מושבה אחת, זיהום חיידקי נמצא שם. על מנת להכין פתרונות לקריאה במד הרלקסומטרי המגנטי, 300 מיקרוליטר של PBS מוזרמים תחילה לתוך שפופרת אפנדורף. לאחר מכן מתווספת דגימה של מלאי חיידקים, ואחריה תוספת של ננו-חיישנים.

לאחר מכן מעבירים את התמיסה לצינור זכוכית, ומעליו מניחים חתיכת פרפילם על מנת למנוע אידוי. לאחר מכן מניחים את צינור הזכוכית בתוך צינור NMR גדול יותר ומוחדרים לתוך מד הרלקסומטרי המגנטי. תמיסה בסיסית שאינה מכילה חיידקים ורק ננו-חיישן ו-PBS משמשת לקבלת קריאת T2 בסיסית כפי שמוצג.

לאחר מכן מוכנסות תמיסות המכילות ריכוזים שונים של חיידקים לתוך הרלקסומטרי המגנטי לצורך ניתוח, והשינויים בערכי T2 נגרמים על ידי הקישור בין הננו-חיישנים לחיידקים. כפי שהוצג, ניתן לזהות נוכחות של CFU חיידקי אחד תוך דקות באמצעות שיטה זו. עם זאת, ככל שריכוז החיידקים עולה, קריאת ה-MR פחות ניתנת לכימות, וזו הסיבה שהשימוש בנתוני פליטה פלואורסצנטית שווה גם לכימות חיידקי מדויק.

לפני שניתן יהיה לאסוף נתוני פלואורסצנטיות, תחילה יש לצנטריפוגה את הדגימה. התמיסה מועברת מצינור הזכוכית לצינור אפנדורף ואז עוברת צנטריפוגה. זה מפריד את החיידקים והננו-חיישנים הקשורים אליו מננו-חיישנים צפים חופשיים בתמיסה.

הסופרנטנט נזרק, וגלולת החיידק מושעה מחדש ב-PBS. לבסוף ניתן לנתח את הדגימה באמצעות הגשה פלואורסצנטית. עוצמת הפליטה תהיה יחסית לכמות הננו-חיישנים שנותרו בתמיסה, ולכן גם לכמות החיידקים הקיימת.

כפי שניתן לראות, כניעה פלואורסצנטית מתחזקת ככל שריכוז החיידקים עולה, והוא הופך גם לרגיש יותר. זו הסיבה שהזיווג של שיטות מגנטיות ופלואורסצנטיות מאפשר זיהוי וכימות של זיהום חיידקי בשלבי התפתחות מוקדמים ומאוחרים כאחד. בנוסף לזיהוי חיידקים בתמיסות פשוטות כגון PBS, לננו-חיישנים אלה יש גם את היכולת לתפקד במדיות מורכבות יותר, כגון מי אגם או חלב.

יתר על כן, ננו-חיישנים אלה נבדקו לספציפיות בנוכחות חיידקים שאינם מטרה וחיידקי מטרה מושבתים בחום. כפי שהוצג לננו-חיישנים מגנטו-פלואורסצנטיים יש תגובה מועטה עד ללא תגובה עם חיידקים לא ממוקדים או לא חיים בשל הספציפיות של הנוגדנים המצומדים. זה מדגים את יעילותם לזיהוי חיידקים ספציפיים בנוכחות מינים אחרים.

לבסוף, חשוב גם לציין כי ננו-חיישנים אלה עשויים להיות מותאמים בקלות גם לזיהוי פתוגנים אחרים. אתה יכול לסנתז או שאתה יכול לנסח את הננו-חיישנים האלה שעשינו במעבדה שלנו תוך חודש אחד. אתה יכול לעשות את זה תוך חודש אחד, וחודש אחד של מוצר יכול לתת לך בערך 10 שנים של יישום.