אור בתיווך אפנון הפוך של מיטוגן המופעל חלבון קינאז נתיב במהלך הבחנה Cell ו קסנופוס התפתחות עובריים

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא להשתמש באור כדי לשלוט במסלול האיתות של חלבון קינאז המופעל על ידי מיטוגן בתאים שלמים ובעוברי קסנופוס. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביולוגיה תאית והתפתחותית, כגון כיצד מודולציות זמניות של פעילות קינאז מווסתות הגדרה עצמית במהלך התמיינות תאים, והתפתחות עוברית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לשלוט בפעילות החלבון קינאז המופעל על ידי מיטוגן באופן הפיך בתאים שלמים ובאורגניזמים רב-תאיים, כגון עוברים מתפתחים.

שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי קינטיקה של איתות במהלך התפתחויות עובריות של קסנופוס. ניתן ליישם אותו גם על מערכות מודלים אחרות כגון סוקוטרה, דג זברה או עכבר. היום, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי, וישנו קרישנמורטי, ידגים את ההליך.

ואורורה טורג'ון, פוסט-סטאר במעבדה שלי, תדגים את כל ההליכים הכרוכים בעוברי קסנופוס. ראשית, הרכיבו את מכשיר תרבית התאים על ידי הנחת תא PDMS סטרילי אחד עם חיטוי על החלקת כיסוי סטרילית מצופה PLL בצלחת פטרי 60 מ"מ. לאחר מכן, השתמש ב-0.5 מ"ל של 0.25% טריפסין כדי לנתק תאי pHK21 מבאר אחת של צלחת תרבית רקמה בת 6 בארות.

לאחר ספירת צפיפות התאים עם ההמוציטומטר, זרע את התא עם 20,000 תאים ב-200 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאים. 24 שעות לאחר ציפוי התא, העבירו את התאים עם 50 עד 100 ננוגרם של CRY2-mCherry-Raf1 2A2CIBMG של פלסמיד PCaA X לפי פרוטוקול היצרן. שלוש שעות לאחר הטרנספקציה, שנה את המדיום ל -200 מיקרוליטר של מדיום תרבית טרי ואפשר לתאים להתאושש בן לילה על ידי דגירה של התרבית בחממת 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוז פחמן דו חמצני.

למחרת, התחל באינדוקציה והדמיה אופטוגנטית על ידי החלפת מדיום תרבית התאים ב-200 מיקרוליטר של מדיום בלתי תלוי בפחמן דו חמצני. לאחר מכן הגדר את פרוטוקול רכישת הנתונים. בחר ערוץ FITC עירור נוןנומטר 488 לגירוי אופטוגנטי, ואת ערוץ CRITC עירור 561 ננומטר כדי לעקוב אחר הלוקליזציה התאית של חלבון מסומן mCherry .

מדוד את עוצמת האור הכחול על ידי הצבת מד כוח קרוב לחלון המטרה. הספק כולל של שני מיקרו-וואט מספיק כדי לגרום לאסוציאציה של CIBN CRY2-PHR. הגדר רכישת חותמת זמן עם מרווח של חמש שניות.

וזמן הרכישה הכולל של שתי דקות. החל חומר מתאים להתאמה לאינדקס על חלון המטרה. הנח את תא התא על במת המיקרוסקופ והשתמש במצב השדה הבהיר כדי להתמקד בתאים על משטח הכיסוי באמצעות חלקי העיניים.

לאחר מכן, הזיזו את שלב המיקרוסקופ כדי לאתר תא שעבר טרנספטציה תחת אור ירוק. הקלט סדרה של תמונות עם חותמת זמן הן בערוץ FITC והן בערוץ CITC. תמונת הדגימה הבסיסית מציגה CIBNGPCAAX הממוקם על קרום הפלזמה.

זוהי תמונת מצב של CRY2 mCherry raf1 לפני הדמיית אור כחול, בעוד שתמונה זו מציגה תמונת מצב של CRY2 mCherry raf אחד לאחר עשרה פולסים של גירוי אור כחול. צור את מערך ה-LED על ידי הכנסת נוריות LED כחולות טונאליות לשני לוחות אב-טיפוס וחיבור עם נגדים מגבילים זרם. מניחים את לוחות הלחם בקופסת אלומיניום.

הכנס שני חוטי מתכת כדי לחבר את הלוחות לאספקת החשמל. ודא שאורך החוט מספיק כאשר קופסת האור ממוקמת בתוך חממת פחמן דו חמצני. לאחר מכן הניחו מפזר אור שקוף שישמש ככיסוי של קופסת התאורה.

לבסוף, כייל את תפוקת הכוח של כל LED במגוון כניסות מתח. השתמש בהספק של נקודת אפס שני מילי-וואט לסנטימטר רבוע עבור בדיקת התמיינות תאי PC12 24 שעות. הנח את מערך ה-LED בחממה של 37 מעלות צלזיוס בתוספת חמישה אחוז פחמן דו חמצני.

חבר אותו לאספקת החשמל באמצעות חוטי המתכת והגדר את עוצמת ה-LED לנקודת אפס של שני מילי-וואט לסנטימטר מרובע. הנח את לוחית 12 הבארות המכילה תאי PC12 שעברו טרנספטציה על החלון של מערך ה-LED. יישר את הצלחת כך שכל באר תהיה מוארת במלואה.

החל תאורת אור רציפה למשך 24 שעות. כדי לדמות את התאים המובחנים, הגדר רכישת נתוני תמונה בודדת. השתמש ב-200 אלפיות השנייה עבור ערוצי GFP ו-TexasRed.

צלם תמונות של התאים שהועברו הן בערוץ GFP והן בערוץ TexasRed, ושמור את הקבצים לניתוח נתונים. התחל הליך זה על ידי ייצור מחטים להזרקת מיקרו RNA על ידי משיכת נימי זכוכית עם מושך נימי. הסר את מעיל הג'לי מהעוברים על ידי טיפול בהם בשלושה אחוז ציסטאין מדולל ב-0.2 XMMR למשך 15 דקות.

העבירו את העוברים לשלושה אחוז פוליסוכרוז ותמיסת XMMR אפס נקודה חמש להזרקת מיקרו. הזרקו במדויק 500 פיקוגרם לננוגרם אחד של RNA CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX לכל עובר. לאחר מכן תרבית את העוברים המוזרקים בתמיסת המיקרו-הזרקה בטמפרטורת החדר.

כאשר העוברים מגיעים לשלב הגסטרולה הרפואית, מעבירים אותם לתמיסת MMR 0.2x, וממשיכים בתרבית עד לשלב ההתפתחות הרצוי. לאחר מכן הנח את צלחת 12 הבארות על מערך ה-LED שנבנה בבית לטיפול באור כחול. הנח מראה על גבי צלחת 12 הבארות כדי להבטיח תאורה מלאה של אור כחול של העוברים.

קצור את העוברים לניתוח היסטולוגי, כתם מערבי או ביטוי גנים לאחר חשיפה לאור כחול למשך הזמן הרצוי. תמונה זו מציגה תמונות רב-ערוציות של תאי PC12 שהועברו עם CRY2-2A-2CIBN לאחר 24 שעות של גירוי אור כחול בנקודת האפס שני מילי-וואט לסנטימטר מרובע. גם כתבי GFP וגם mCherry נראים.

עיגולים מסמנים תאים מובחנים וריבועים מסמנים תאים לא מובחנים. כאן התאים טופלו באותו אופן כמו אלה שבתמונה הקודמת, אלא שלא נעשה שימוש בגירוי אור כחול. לא נראה הבחנה.

תאים אלה מראים תוצאות מייצגות לאחר טרנספקציה עם raf1 GFPCaaX, raf1 פעיל מבחינה מכוננת. העיגולים והמלבנים מסמנים תאים מובחנים ולא ממוינים בהתאמה. היסטוגרמה זו מציגה יחסי התמיינות של תאי PC12 שהועברו עם CA-Raf1, שהועברו במשותף עם CRY2 mCherry raf1 ו-CIBN GFP Caax ועברו טרנספטציה בודדת עם CRY2A 2CIBN.

רק תאים שנחשפו לאור כחול הראו התמיינות משמעותית. תמונה זו מציגה את המורפולוגיה של עוברי קסנופוס נורמליים ללא הזרקת MRNA, וללא טיפולי אור. תמונה זו מציגה עוברים שהוזרקו עם CRY2 2A2CIBN MRNA ונתונים לגירוי אור כחול.

הפעלת raf1 על ידי טיפול בעוברים מוזרקים CRY2 2A2CIBN באור כחול גורמת למבנים דמויי זנב חוץ רחמיים באזור הראש. בעקבות הליך זה, ניתן לענות על שאלות נוספות, כגון כיצד הפעלה ספציפית לשלב של מסלול החלבון קינאז המופעל על ידי מיטוגן מווסתת את ביטוי הגנים. ניתן להכליל שיטה אופטוגנטית זו כדי לשלוט במסלולי איתות אחרים עם מנגנוני הפעלה דומים.