Name: במבחנה פלמור של F-אקטין-Endosomes מוקדם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: חקור פולימריזציה של F-actin מ-Endosomes מוקדם במבחנה באמצעות תאי HeLa. השיטה מאפשרת שחזור גרעיניות ופולימריזציה על ממברנות אנדוזומליות לחקר דינמיקת אקטין ומסחר ממברנות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

תמיכה נתקבל שוויצרי הקרן הלאומית למדע; התוכנית Sinergia שוויצרי; הפולנית-השוויצרי מחקר תוכנית (PSPB-094/2010); NCCR בביולוגיה כימיים; LipidX מן היוזמה SystemsX.ch שוויצרי, מוערכים על ידי קרן המדע הלאומית השוויצרית (כדי ג'יי ג'י). O. מ נתמכה על ידי התחברות לטווח ארוך EMBO (ALTF-516-2012).

<ol><li>Huotari, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosome+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Endosome maturation.</a> EMBO J. 30 (17), 3481-3500 (2011).</li>
<li>Scott, C. C., Vacca, F., Gruenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosome+Maturation%2C+Transport+and+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Endosome Maturation, Transport and Functions.</a> Semin. Cell Dev Biol. 31, 2-10 (2014).</li>
<li>Puthenveedu, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-dependent+sorting+of+recycling+proteins+by+actin-stabilized+endosomal+microdomains%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sequence-dependent sorting of recycling proteins by actin-stabilized endosomal microdomains.</a> Cell. 143 (5), 761-773 (2010).</li>
<li>Seaman, M. N., Gautreau, A., Billadeau, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retromer-mediated+endosomal+protein+sorting%3A+all+WASHed+up%21%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Retromer-mediated endosomal protein sorting: all WASHed up!</a> Trends Cell Biol. 23 (11), 522-528 (2013).</li>
<li>Burd, C., Cullen, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retromer%3A+a+master+conductor+of+endosome+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Retromer: a master conductor of endosome sorting.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (2), a016774(2014).</li>
<li>Woodman, P. G., Futter, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivesicular+bodies%3A+co-ordinated+progression+to+maturity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multivesicular bodies: co-ordinated progression to maturity.</a> Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 408-414 (2008).</li>
<li>Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ESCRT+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The ESCRT pathway.</a> Dev Cell. 21 (1), 77-91 (2011).</li>
<li>Morel, E., Gruenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annexin+A2+binding+to+endosomes+and+functions+in+endosomal+transport+are+regulated+by+tyrosine+23+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Annexin A2 binding to endosomes and functions in endosomal transport are regulated by tyrosine 23 phosphorylation.</a> J Biol Chem. 284 (3), 1604-1611 (2009).</li>
<li>Muriel, O., Tomas, A., Scott, C. C., Gruenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moesin+and+cortactin+control+actin-dependent+multivesicular+endosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Moesin and cortactin control actin-dependent multivesicular endosome biogenesis.</a> Mol Biol Cell. 27 (21), 3305-3316 (2016).</li>
<li>Sonnichsen, B., De Renzis, S., Nielsen, E., Rietdorf, J., Zerial, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+membrane+domains+on+endosomes+in+the+recycling+pathway+visualized+by+multicolor+imaging+of+Rab4%2C+Rab5%2C+and+Rab11%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinct membrane domains on endosomes in the recycling pathway visualized by multicolor imaging of Rab4, Rab5, and Rab11.</a> J Cell Biol. 149 (4), 901-914 (2000).</li>
<li>Morel, E., Parton, R. G., Gruenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annexin+A2-dependent+polymerization+of+actin+mediates+endosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Annexin A2-dependent polymerization of actin mediates endosome biogenesis.</a> Dev Cell. 16 (3), 445-457 (2009).</li>
<li>Kamentsky, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+structure%2C+function+and+compatibility+for+CellProfiler%3A+modular+high-throughput+image+analysis+software%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software.</a> Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).</li>
<li>Meijering, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+validation+of+a+tool+for+neurite+tracing+and+analysis+in+fluorescence+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.</a> Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).</li>
<li>Granger, E., McNee, G., Allan, V., Woodman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+cytoskeleton+and+molecular+motors+in+endosomal+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of the cytoskeleton and molecular motors in endosomal dynamics.</a> Semin Cell Dev Biol. 31, 20-29 (2014).</li>
<li>Mayran, N., Parton, R. G., Gruenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annexin+II+regulates+multivesicular+endosome+biogenesis+in+the+degradation+pathway+of+animal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Annexin II regulates multivesicular endosome biogenesis in the degradation pathway of animal cells.</a> EMBO J. 22 (13), 3242-3253 (2003).</li>
<li>Gorvel, J. P., Chavrier, P., Zerial, M., Gruenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rab5+controls+early+endosome+fusion+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">rab5 controls early endosome fusion in vitro.</a> Cell. 64 (5), 915-925 (1991).</li>
<li>Wandinger-Ness, A., Zerial, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab+proteins+and+the+compartmentalization+of+the+endosomal+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Rab proteins and the compartmentalization of the endosomal system.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (11), a022616(2014).</li>
<li>Balch, W. E., Glick, B. S., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+intermediates+in+the+pathway+of+intercompartmental+transport+in+a+cell-free+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sequential intermediates in the pathway of intercompartmental transport in a cell-free system.</a> Cell. 39 (3 Pt 2), 525-536 (1984).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

אקטין ממלא תפקיד מכריע אנדוזום ממברנה dynamics4,14. בעבר דיווחנו כי אקטין התגרענות הפילמור מתרחשים על endosomes מוקדם, ויוצרים F-אקטין תיקונים קטנים או רשתות. רשתות אלה F-אקטין נדרשים לחלוטין להעברה ממברנה מעבר endosomes מוקדמת לאורך השביל השפלה. הפרעה בשלב כלשהו של תהליך הפילמור התגרענות הזה מונע אנדוזום ההבשלה ובכך תחבורה במורד לעבר המנוח endosomes andlysosomes9,11,15....

התאים האיקריוטים גבוה יותר, חלבונים ושומנים הם הפנימו לתוך מוקדם endosomes איפה המיון מתבצע. כמה חלבונים ושומנים, שנועד להיות reutilized, שולבו צינורי מחוזות endosomes מוקדמת, ואז מועברים קרום פלזמה או טרנס-גולג'י רשת (TGN)1,2. לעומת זאת, חלבונים ושומנים אחרים ארוזים באופן סלקטיבי לתוך מחוזות endosomes מוקדמת כי התערוכה מראה multivesicular. אזורים אלה הרחב, על ניתוק ממברנות endosomal מוקדם, בסופו של דבר בוגרת לתוך שלפוחית המוביל endosomal חינם או גופים multivesicular (ECV/MVBs), אשר אחראים על תובלת המטענים לעבר המנוח endosomes1, 2.
אקטין ממלא תפקיד מכריע בתהליך שיפוץ ממברנה המשויכים להן אנדוזום והיכולת מיון endosomal. חלבון מיון לאורך המסלולים מיחזור קרום פלזמה או את TGN תלוי את retromer קומפלקס החלבונים הקשורים. מכונות מיון זה נראה להיות מצמידים את היווצרות של מיחזור בקוריאנית באמצעות האינטראקציות של retromer מתחם עם צרעה והצלקת homologue (שטיפה) מורכב, מסועף אקטין3,4,5 . לעומת זאת, מולקולות המיועדים השפלה, במיוחד הפעלת קולטנים איתות, מסודרים לתוך שלפוחית intraluminal (ILVs) על ידי endosomal מיון מתחמי הדרושים עבור תחבורה (ESCRT)2,6, 7. בעוד תפקיד אפשרי של אקטין בתהליך מיון תלוי-ESCRT אינו ידוע, F-אקטין ממלא תפקיד חשוב להן של ECV/MVBs, תחבורה מעבר endosomes המוקדמות. בפרט, מצאנו כי annexin A2 נקשר מועשרת כולסטרול אזורים של אנדוזום מוקדם, ויחד עם spire1, nucleates פלמור אקטין-F. היווצרות של הרשת אקטין מסועף מובחנים endosomes דורשת את הפעילות הסתעפות של החלבון אקטין הקשורות (ARP) 2/3 מורכבים, כמו גם את moesin חלבון ERM ו-8,9cortactin חלבון מחייב אקטין.
כאן, אנו מתארים מבוסס מיקרוסקופיה במבחנה assay זה reconstitutes את התגרענות ואת פלמור של F-אקטין על ממברנות endosomal מוקדם במבחנות. Assay הזה שימש בעבר כדי לחקור את התפקיד של annexin A2 ב- F-אקטין התגרענות ואת moesin ואת cortactin על היווצרות endosomal אקטין רשתות8,9. עם זה פרוטוקול במבחנה , הסדרה מורכבת של התגובות המתרחשות על endosomes במהלך פלמור אקטין הופכים לבצע ניתוח הביוכימי והמולקולרי של השלבים רציפים של התהליך, לרבות התגרענות אקטין, ליניארי פלמור, מסעף ו crosslinking.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71380</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Acros Organics</td><td>196770010</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>AppliChem</td><td>A1042</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Acros Organics</td><td>424370025</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>AppliChem</td><td>A3724</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiun acetate tetrahydrate</td><td>Fluka</td><td>63047</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>AppliChem</td><td>A2948</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10125</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fluka</td><td>71690</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>Merck Millipore</td><td>107687</td><td></td></tr><tr><td>לופפטין</td><td>רוש</td><td>11017101001</td><td></td></tr><tr><td>פפסטאטין</td><td>Roche</td><td>10253286001</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Roche</td><td>10236624001</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehide</td><td>Polysciences. Inc</td><td>380</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 phalloidin</td><td>בדיקות מולקולריות</td><td>A34055</td><td></td></tr><tr><td>שלד ציטו אקטין רודאמין</td><td>. Inc</td><td>APHR-A</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>81381</td><td>פולי (אלכוהול ויניל), Mw ~ 31 000</td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-2522</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>AppliChem</td><td>A1086</td><td></td></tr> <tr><td>&beta;-קזאין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6905</td><td></td></tr><tr><td>מסנן 0.22 &mu; m</td><td>Millex</td><td>SL6V033RS</td><td></td></tr><tr><td>עגול 10 ס"מ כלים לתרבית תאים</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>150350</td><td></td></tr><tr><td>פלסטיק פסטור פיפטה</td><td>מסייע</td><td>569/3 40569003</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל צינור פוליפרופילן</td><td>TPP</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>מחט היפודרמית 22 גרם שחור 30 מ"מ</td><td>BD Microlance</td><td>300900</td><td></td></tr><tr><td>סטרילי Luer-Slip 1 מזרקים ללא מחט</td><td>BD Plastipak</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו זכוכית שקופיות</td><td>Assistent</td><td>2406</td><td></td></tr><tr><td>18 x 18 מ"מ זכוכית כיסוי</td><td>מסייע</td><td>1000/1818</td><td></td></tr><tr><td>SW60 צינור צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td>344062</td><td></td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה TLS-55 בקמן</td><td>קולטר</td><td>343778</td><td></td></tr><tr><td>200-&mu; L קצה צהוב</td><td>Starlab</td><td>S1111-0706</td><td></td></tr><tr><td>1,000-&mu; L כחול קצה בוגר</td><td>Starlab</td><td>S1111-6801</td><td></td></tr><tr><td>מבחנה 1.5 מ"ל</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C 311-04-051</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי עגול בקוטר 18 מ"מ</td><td>Assistent</td><td>1001/18</td><td></td></tr><tr><td>צלחת עגולה בקוטר 35 מ"מ עם תחתית זכוכית 20 מ"מ (0.16 - 0.19 מ"מ)</td> <td>במבחנה מדעית</td><td>D35-20-1.5-N</td><td></td></tr><tr><td>רפרקטומטר</td><td>Carl Zeiss</td><td>79729</td><td></td></tr><tr><td>מנקה פלזמה</td><td>האריק פלזמה</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall WX80 אולטרה-צנטריפוגה</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>46900</td><td></td></tr><tr><td>אולטרה-צנטריפוגה שולחנית</td><td>בקמן קולטר</td><td>TL-100</td><td></td></tr><tr><td>SW60 רוטור</td><td>בקמן קולטר</td><td>335649</td><td></td></tr><tr><td>רוטור TLS-55</td><td>בקמן קולטר</td><td>346936</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופיה קונפוקלית</td><td>קארל Zeiss</td><td>LSM-780</td><td></td></tr><tr><td>Fugene HD מגיב טרנספקציה</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>מגיב לבדיקת חלבון A</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0113</td><td></td></tr><tr><td>מגיב לבדיקת חלבון B</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0114</td><td></td></tr><tr><td>מגיב לבדיקת חלבון S</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0115</td><td></td></tr><tr><td>מגרד תאים</td><td>תוצרת בית</td><td></td><td>חתיכת גומי סיליקון של כ -2 ס"מ, חתוכה בזווית חדה מאוד ומחוברת למוט מתכת או מוחזקת בעזרת מלקחיים</td></tr><tr><td>רפרקטומטר</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium Eagle (MEM)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>M0643</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>MEM חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>מד pH 691</td><td>מטרום</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ תוכנה</td><td></td><td></td><td>NIH, בת'סדה MD</td></tr></tbody></table>

במבחנה פלמור של f-אקטין-endosomes מוקדם

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

פונקציות רבות אנדוזום מוקדם, במיוחד מטען החלבון ומיון ממברנה דפורמציה, תלויים כתמים של חוטים F-אקטין קצרים nucleated על גבי קרום endosomal. הקמנו מבוסס מיקרוסקופיה במבחנה assay זה reconstitutes את התגרענות ואת פלמור של F-אקטין על ממברנות endosomal מוקדם במבחנות, ובכך הפך את סדרת תגובות מורכבת זו נוטה גנטי וביוכימי מניפולציות. שברים Endosomal מוכנות על ידי ציפה במעברי צבע סוכרוז מתאי לבטא את החלבון endosomal מוקדם GFP-RAB5. שברים cytosolic מוכנות של קבוצות נפרדות של תאים. הן endosomal והן cytosolic שברים ניתן לאחסן קפוא חנקן נוזלי, במידת הצורך. ב וזמינותו, endosomal ואת cytosolic שברים מעורבים, התערובת מודגרת ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים המתאימים (למשל, יונית כוח, להפחית את הסביבה). בזמן הנסיעה, תערובת התגובה הוא קבוע, F-אקטין מתגלה עם phalloidin. התגרענות אקטין, הפילמור מכן נותחו על ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. כאן, אנחנו מדווחים כי assay זה יכול לשמש כדי לחקור את התפקיד של הגורמים המעורבים או אקטין התגרענות על הקרום, או התארכות עוקבות, מ., או crosslinking של F-אקטין חוטים.

כדי לקבל תובנות לגבי היווצרות של F-אקטין תיקונים הקרומים אנדוזום מוקדם, עקבנו פרוטוקול המתוארים באיור2. בקצרה, התאים היו transfected עם GFP-RAB5, ואז endosomes מוקדם הוכנו על ידי subcellular fractionation. אלה endosomes מוקדם מטוהרים היו מודגרות עם ציטוזול על מנת לספק אקטין עצמה, כמו גם גורמים אחרים שייתכן ומעורבים התגובה. בסוף תקופת הדגירה, התגובה נעצר על ידי קיבוע של התערובת. לאחר מכן, מדגם היה אסף, שהופקדו על שקופית מיקרוסקופיים. לבסוף, F-אקטין נחשף עם pha...

פונקציות אנדוזום מוקדם תלויים פלמור אקטין-F. כאן, אנו מתארים מבוסס מיקרוסקופיה במבחנה assay זה reconstitutes את התגרענות ואת פלמור של F-אקטין על ממברנות endosomal מוקדם במבחנות, ובכך הפך את סדרת תגובות מורכבת זו נוטה הביוכימי ותעשיה מניפולציות.

במבחנה פלמור של F-אקטין-Endosomes מוקדם

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto ...

המטרה הכללית של בדיקה זו, המתבססת על מיקרוסקופיה in vitro, היא לחקור פולימריזציה של אקטין מאנדוזומים in vitro. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחומי תעבורת הממברנה והאקטין, כגון תפקידו של האקטין במסלול החומצי. והיתרון העיקרי של טכניקה זו הוא השחזור של פולימריזציית הגרעין של F-actin על ממברנות של אנדוזומים מוקדמים בתוך מבחנה.דבר זה הופך את סדרה מורכבת זו של תגובות לנשמעת למניפולציות הכימיות שלי. את הפרוצדורה ידגימו חורחה לריוס ואוליביה מוריאל מהמעבדה. התחילו בהנחת צלחונות של תאי hela על פלטת מתכת רטובה בתוך דלי קרח שטוח.שטפו את התאים פעמיים עם 5 mL של PBS קר. לאחר הסרת ה-PBS מהשטיפה האחרונה, הוסיפו 3 mL של PBS קר לכל צלחת. לאחר מכן, השתמשו במגרדת תאים (policeman) גמישה כדי לגרד את התאים מהצלחות בתנועה סיבובית מהירה מסביב לשולי הצלחת.לאחר מכן בצעו תנועה כלפי מטה במרכז הצלחת. גרדו בעדינות כדי לקבל דפים של תאים צמודים. לאחר מכן, השתמשו בפיפט פסטור פלסטי עם פתח רחב כדי להעביר בעדינות את התאים למבחנות פוליפרופילן קוניות בנפח 15 milliliter על קרח.סבבו בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-175×g ובטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. הסירו בעדינות את הנוזל העליון (supernatant) והוסיפו 1 עד 3 מיליליטר של בופר הומוגניזציה למשקעים. באמצעות פיפט פסטור מפלסטיק עם פתח רחב, העבירו את הנוזל בעדינות למעל

in-vitro-polymerization-of-f-actin-on-early-endosomes

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

נתאר כמה מיקרו - photomanipulation טכניקות כגון FRAP photoactivation לאפשר קביעת פרמטרים תנועתיות ואת הדינמיקות ייתכן של חלבונים בתוך מעביר תאים. ניסיוני הקריאות הבאות כוללות דינמיקה subcellular מחזור של הרגולטורים תנועתיות או של שלד התא המשמש כבסיס של אקטין.

בטכניקות המיקרומניפולציה המאפשר ניתוח של דינמיקה Morphogenetic מחזור של הרגולטורים Cytoskeletal

אנו מדווחים על בדיקה פשוטה, יעילה בזמן וספקטרוסקופיה מבוססת תפוקה גבוהה לכימות סיבי אקטין בדגימות ביולוגיות אקס ויוו מרקמות המוח של מכרסמים ונבדקים אנושיים.

בדיקה מבוססת ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית חסכונית בזמן להערכת מצב פולמור Actin במכרסמים ורקמות מוח אנושיות

אנו מציגים פרוטוקולים לבדיקות מיקרופלואידיות פשוטות של נימת אקטין, בשילוב עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, המאפשרות לנטר במדויק חוטי אקטין בודדים בזמן אמת תוך חשיפתם ברצף לתמיסות חלבון שונות.

שימוש במיקרופלואידיקה ובמיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לחקור את דינמיקת ההרכבה של חוטי אקטין בודדים וחבילות

פרוטוקול זה מתאר את היווצרותם של דו-שכבתיות שומנים נתמכות ואת התוספת של חוטים ציטוסקטליים וחלבונים מוטוריים כדי לחקור את הדינמיקה של רשתות ציטוסקטליות משוחזרות, הקשורות לממברנה, באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

שחזור של קליפות אקטין מינימליות הקשורות לממברנה על דו-שכבתיות שומנים נתמכות

בכתב יד זה, אנו מדגימים את הטכניקות הניסיוניות לתמצת את השלד הציטוסקולרי F-actin לשלפוחיות ליפידים חד-עיניות ענקיות (הנקראות גם ליפוזומים), ואת השיטה ליצירת שכבת F-actin הביולוגית של קליפת המוח בעלון הפנימי של קרום הליפוזום.

במבחנה שחזור של שלד אקטין ציטוסקלטון בתוך שלפוחית אונילמלרית ענקית

פרוטוקול זה הוא מדריך להדמיה של אקטין דינמי ומיקרוטובולים באמצעות בדיקת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית פנימית במבחנה (TIRF).

הדמיה של אקטין ודינמיקת צימוד מיקרוטובול במבחנה על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת (TIRF)

מאמר זה מציג פרוטוקולים להנדסה ולאפיון רשתות תלת-ממדיות מרוכבות הניתנות לכוונון של חוטי אקטין ומיקרו-טובולים המסתבכים. חומרים מרוכבים עוברים ארגון מחדש אקטיבי ותנועה בליסטית, מונעים על ידי מנועי מיוזין II וקינסין, ומכוונים על ידי הריכוזים היחסיים של אקטין, מיקרוטובולים, חלבונים מוטוריים וקרוסלינקרים פסיביים.

שחזור ואפיון מרוכבים של אקטין-מיקרוטובול עם דינמיקה ומכניקה מונעות מנוע ניתנות לכוונון

פרוטוקול זה מתאר כיצד לייצר כוכבי שביט אקטין על פני השטח של חרוזים תוך שימוש ברכיבי חלבון זמינים מסחרית. מערכות כאלה מחקות את המבנים הבולטים הנמצאים בתאים, וניתן להשתמש בהן כדי לבחון מנגנונים פיזיולוגיים של ייצור כוח בצורה פשוטה.

שחזור של תנועתיות מבוססת אקטין עם חלבונים זמינים מסחרית

כאן, אנו מציגים שיטות להכנת מכלולי אקטין מעין דו-ממדיים (2D) שזורים, צולבים וגבישים נוזליים מחלבונים מטוהרים.

כוונון מצבי ההתכווצות והעיוות של מכלולים מבוססי אקטין פעילים במבחנה: מרשתות פעילות דו-ממדיות לטיפות גביש נוזלי

מחקר זה מתאר טכניקות biophysical, ביוכימיים ומולקולריים לאפיין את הפעילות המלווה של Escherichia coli HdeB בתנאי pH חומצי. שיטות אלו יושמו בהצלחה עבור מלוות חומצה-מגן אחרות כגון HdeA והוא יכול להיות שונה כדי לעבוד עבור מלווים אחרים בתנאי עקה.

איתור של הפעילות תלויה pH של<em&gt; Coli Escherichia</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em

חקור פולימריזציה של F-actin מ-Endosomes מוקדם במבחנה באמצעות תאי HeLa. השיטה מאפשרת שחזור גרעיניות ופולימריזציה על ממברנות אנדוזומליות לחקר דינמיקת אקטין ומסחר ממברנות.

במבחנה פלמור של F-אקטין-Endosomes מוקדם

גלה סרטונים נוספים