Name: לחיות תאים מדידה של Odorant קולטן הפעלה באמצעות Assay המחנה בזמן אמת (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: למדו שיטה למדידת הפעלה של קולטני ריח בזמן אמת באמצעות מבחן cAMP בתפוקה גבוהה. השיטה מאפשרת סינון יעיל של ריחנים מול קולטנים בתאי Hana3A חיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה נתמכה על ידי הסינית הלאומית למדע (31070972), מדע טכנולוגיה הנציבות של שנגחאי העירייה (16ZR1418300), תוכנית חדשנית מחקר צוות של שנגחאי העירוני ועדת החינוך, שנגחאי המזרחי המלומד התוכנית (J50201), התוכנית הלאומית למחקר בסיסי של סין (2012CB910401).

1. Culturing ותאים תחזוקה של Hana3A <ol><li>שמור על התאים ב- 10 מ"ל של אמצעי חיוני מינימלי (מאמ) עם 10% עוברית שור סרום (FBS), 100 µg/mL פניצילין-סטרפטומיצין, האמפוריטיצין µg/mL 1.25 B ב- 100-מ"מ תא תרבות מנה בחממה התרבות התא 37 ° C עם 5% CO 2. עם כל קטע אחר, להוסיף 1 puromycin µg/mL כדי לשמור על יציבה תרביות תאים של פלסמידים (ראה מבוא). 
	הערה: בצע את כל השלבים הכרוכים תרבית תאים בכיתה II בטיחות ביולוגית בארון כדי להבטיח סביבה סטרילית.</li>
	<li>תת-תרבות ביחס של 10-20% במנות 100-מ מ כל 2-3 ימים.</li>
</ol> 2. ציפוי תאים עבור תרביות תאים <ol><li>לבחון את התאים Hana3A במיקרוסקופ ניגוד שלב כדי להבטיח תא הכדאיות וכדי להעריך את הנהרות.</li>
	<li>תשאף בינוני כל מתוך קערה התרבות התא.</li>
	<li>לרחוץ תאים על-ידי הוספת 10 מ ל תמיסת באגירה פוספט (PBS) על צלחת, מתערבל המנה וכ רפה בעברית מגניב.</li>
	<li>להוסיף 3 מ"ל של 0.05% טריפסין אתילן diamine ב tetraacetic חומצה (EDTA) על צלחת. לערבב 1 דקות או עד כל התאים הם צפים. 
	הערה: לבחון את ההתקדמות של תאים מתנתקת מהחלק התחתון של הלוח תחת המיקרוסקופ כנדרש.</li>
	<li>טריפסין Inactivate על-ידי הוספת 5 מ של הגברת עם 10% FBS, פיפטה למעלה ולמטה כדי לשבור את נתחי תא מסצ'וסטס 
	הערה: עבור ציפוי לפני תרביות תאים, אופן השימוש לא לכלול אנטיביוטיקה. תוספת של אנטיביוטיקה עשויה להקטין תרביות תאים יעילות.</li>
	<li>להעביר כמות מספקת של תאים צינור 15-mLl בהתאם למספר הצלחות כדי להיות transfected. על כל צלחת 96-ובכן, הצלחת 2 x 10 6 תאים, או כ 1/5 של תבשיל confluent 100 מ מ 100%, נותן ספירת תאים 2 x 10 4 תאים לכל טוב או צפיפות של-15-30% הנהרות לכל טוב. צנטריפוגה צינורות-200 g x עבור 5 דקות, וארוקן את תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר תא. 
	הערה: לחשב את הסכום הנכון של תאים כדי להיות מצופה על גבי לוחות 96-ובכן כדי להימנע overgrowing או undergrowing תאים לפני גירוי.</li>
	<li>להוסיף כמות מספקת של הגברת עם 10% FBS לתוך 15-mL צינור, פיפטה למעלה ולמטה כדי לשבור את החתיכות של התא המוני. על כל צלחת 96-ובכן, resuspend את התאים עם 6 מ של הגברת עם 10% FBS. 
	הערה: הקפד לא ליצור בועות אוויר בצינור.</li>
	<li>להוסיף את התאים מושעה לשמורה. באמצעות פיפטה רב-ערוצי, פיפטה 50 µL של תאים על גבי כל טוב של צלחת 96-ובכן. דגירה בין לילה ב 37 ° C עם 5% CO 2.</li>
</ol> 3. תרביות תאים של פלסמידים <ol><li>לפני תרביות תאים, לבחון את התאים מצופים להבטיח זרימה נאותה של-30-50% לכל טוב במיקרוסקופ ניגוד שלב ולחזור החממה.</li>
	<li>הכן מראש מתויג רו או לבנות 11 , 21 , 22 , 28, הגורם אביזר בונה (RTP1S 22 , 36 ו M3R 23), ולבנות הווריאציה ביוסנסור 29 , 30 מאת miniprep. לכמת את ריכוז הדנ א על ידי ספקטרופוטומטרים ולהתאים פלסמיד ריכוזים דנ א (למשל, כדי 100 ng/µL) עם מים מזוקקים במידת הצורך.</li>
	<li>הכנת תערובות תרביות תאים <ol><li>להכין תערובת תרביות תאים פלסמיד ב 500 µL של הגברת כל צלחת 96-ובכן לפי טבלה 1- 
		הערה: כאשר ORs שונים נבדקים באותה צלחת 96-ובכן, נפח התערובת תרביות תאים ואת מידת פלסמיד דנ א הוסיף חייב להתאים בפונקציה של מספר בארות transfected עם או נתון.</li>
		<li>הכן תערובת תרביות תאים בשפופרת עם 18 µL של ריאגנט בתיווך השומנים תרביות תאים ב- 500 µL של לזכור:</li>
	</ol></li> <li>לערבב את התערובת פלסמיד עם התערובת תרביות תאים על ידי pipetting למעלה ולמטה. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות</li>
	<li>לעצור את התגובה על-ידי הוספת 5 מ של הגברת עם 10% FBS.</li>
	<li>מתפרסת בשכבה עבה של מגבות נייר סטרילי בשכונה התרבות תאים. קח צלחת 96-ובכן עם תאים מן החממה. בעדינות, שוב ושוב הקש את הצלחת הפוך על ערימת נייר מגבת כך המדיום נספג לחלוטין על ידי מגבת הנייר. 
	הערה: לא בכוח או בפתאומיות הקש על הצלחת כמו אחד יכול לאבד תאי.</li>
	<li>להעביר 50 µL של תערובת תרביות תאים המשולב מכל קידוח של צלחת 96-ובכן, תקופת דגירה בלילה של 18-24 h ב 37 ° C עם 5% CO 2. 
	הערה: ניהול זמן תרביות תאים וגירוי זמנים צריך להקדים את המדידה כאשר צלחת 96-ובכן אחד או יותר נבדקים בניסוי אחד על מנת לקבל את כל הצלחות נמדד לאחר באותו זמן תרביות תאים, זמן החשיפה לגירוי.</li>
</ol> 4. גירוי, מדידה או פעילות באמצעות וזמינותו מחנה בזמן אמת <ol><li>לבחון את התאים transfected במיקרוסקופ ניגוד שלב כדי להבטיח זרימה נאותה של 50-80% לכל טוב ולחזור החממה.</li>
	<li>להכין המדיום גירוי על-ידי הוספת חומצה piperazineethanesulfonic hydroxyethyl 10 מ מ (HEPES) ו- 5 מ מ גלוקוז להאנק &#39; s מאוזנת פתרון מלח (HBSS).</li>
	<li>להפשיר את המצע assay המחנה בזמן אמת ריאגנט aliquots על הקרח. לאחסן המצע ריאגנט ב- 80 ° C-55 µL למחזור המבחנות. השתמש צינור 1 לכל צלחת-</li>
	<li>להכין 2% equilibration פתרון על ידי ערבוב µL 55 מהתרכובת המצע ופתרון HBSS/HEPES/גלוקוז 2750 µL.</li>
	<li>מתפרסת בשכבה עבה של מגבות נייר על הספסל. בעדינות, שוב ושוב הקש את הצלחת הפוך על מגבת הנייר כך המדיום תרביות תאים נספג לחלוטין על ידי מגבת הנייר.</li>
	<li>לרחוץ את התאים על ידי pipetting 50 µL HBSS/HEPES/גלוקוז לפתרון כל טוב.</li>
	<li>בעדינות, שוב ושוב הקש את הפתרון HBSS/HEPES/גלוקוז מהצלחת 96-ובכן.</li>
	<li>פיפטה 25 µL של 2% equilibration פתרון לכל טוב ואני דגירה בטמפרטורת החדר חשוך בשביל ה' 2</li>
	<li>להכין מראש 1 מ' odorant פתרונות מניות דימתיל סולפוקסיד וחנות ב-20 ° C עד להשתמש.</li>
	<li>לפני סוף זמן הדגירה, לדלל את הפתרונות odorant מניות ריכוזי עובד במדיום גירוי HBSS/HEPES/גלוקוז. 
	הערה: ריכוזי דילולים odorant מוכן בשלב זה צריך להיות מוכפל להניב הריכוזים הסופית הנכונה היטב לכל.</li>
	<li>באמצעות chemiluminescence לוחית רישוי הקורא, לפני חיבור odorant, למדוד את רמת הארה הבזליים של הצלחת עבור 2 פעמים ברציפות בקצב של ms 1000 לכל טוב 34.</li>
	<li>להסיר במהירות את הצלחת מהקורא צלחת, להוסיף 25 µL odorant דילולים מכל קידוח, מיד מתחילים מדידה רציפה הפריה חוץ גופית של בארות כל 20 מחזורים בתוך 30 דקות 
	הערה: פיפטה בקפידה כדי להימנע מזיהום השכנה בארות כאשר משתמשים odorants שונים ו/או ריכוזים שונים של odorants אותו באותה הצלחת-</li>
</ol> 5. ניתוח נתונים <ol><li>לייצא את הנתונים בתוכנת reader צלחת chemiluminescence.</li>
	<li>חישוב מנורמל או תגובה עבור כל נקודת זמן באמצעות הנוסחה 
	(הפריה חוץ גופית N &#8211; הפריה חוץ גופית הבזליים) / (הפריה חוץ גופית הגבוהה ביותר &#8211; הפריה חוץ גופית הבזליים) שבו N = ערך הפריה חוץ גופית מסויים טוב; הבזליים = ערך הפריה חוץ גופית הממוצע של השניים הבזליים הפריה חוץ גופית ערכים; הגבוה ביותר = הערך הגבוה ביותר הפריה חוץ גופית של צלחת או סט צלחות. 
	הערה: בהתאם למטרת הניסוי, ייצוגים גרפיים חלופי יכול להיות מאומץ. לדוגמה, עבור הקרנה מבחני (ראה איור 1), ליצירת עקומות הריכוז-תגובה, הפריה חוץ גופית ערך מסויים טוב בנקודת הזמן הרצויים במהלך המדידה קינטי, כגון הערך המרבי או הערך הסופי, יכול לשמש.</li>
</ol>

<ol><li>Malakoff, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Following+the+scent+of+avian+olfaction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Following the scent of avian olfaction.</a> Science. 286 (5440), 704-705 (1999).</li>
<li>Zippel, H. P. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/037663578290033X">The ecology of vertebrate olfaction: D.M. Stoddart. Chapman and Hall, Andover, Great Britain, 1980. £15.00, 234 pp. ISBN 0-412-21820-8.</a> Behav Processes. 7 (2), 198-199 (1982).</li>
<li>Dryer, L., Berghard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+receptors%3A+a+plethora+of+G-protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Odorant receptors: a plethora of G-protein-coupled receptors.</a> Trends Pharmacol Sci. 20 (10), 413-417 (1999).</li>
<li>Zhang, X., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+olfactory+receptor+gene+superfamily+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The olfactory receptor gene superfamily of the mouse.</a> Nat Neurosci. 5 (2), 124-133 (2002).</li>
<li>Glusman, G., Yanai, I., Rubin, I., Lancet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+human+olfactory+subgenome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The complete human olfactory subgenome.</a> Genome Res. 11 (5), 685-702 (2001).</li>
<li>Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+and+ligands+for+odorant%2C+vomeronasal+and+taste+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors.</a> Nat Rev Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).</li>
<li>Reed, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((After+the+holy+grail%3A+establishing+a+molecular+basis+for+Mammalian+olfaction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">After the holy grail: establishing a molecular basis for Mammalian olfaction.</a> Cell. 116 (2), 329-336 (2004).</li>
<li>Buck, L., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+multigene+family+may+encode+odorant+receptors%3A+a+molecular+basis+for+odor+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition.</a> Cell. 65 (1), 175-187 (1991).</li>
<li>McClintock, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+identification+of+eugenol-responsive+and+muscone-responsive+mouse+odorant+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo identification of eugenol-responsive and muscone-responsive mouse odorant receptors.</a> J Neurosci. 34 (47), 15669-15678 (2014).</li>
<li>Trimmer, C., Snyder, L. L., Mainland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+mammalian+olfactory+receptors%3A+measurement+of+receptor+activation+via+luciferase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of mammalian olfactory receptors: measurement of receptor activation via luciferase activity.</a> J. Vis. Exp. (88), e51640(2014).</li>
<li>Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odor+coding+by+a+Mammalian+receptor+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Odor coding by a Mammalian receptor repertoire.</a> Sci Signal. 2 (60), ra9(2009).</li>
<li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profiling+of+activated+olfactory+neurons+identifies+odorant+receptors+for+odors+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular profiling of activated olfactory neurons identifies odorant receptors for odors in vivo.</a> Nat Neurosci. 18 (10), 1446-1454 (2015).</li>
<li>Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+receptor+codes+for+odors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Combinatorial receptor codes for odors.</a> Cell. 96 (5), 713-723 (1999).</li>
<li>Touhara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+identification+and+reconstitution+of+an+odorant+receptor+in+single+olfactory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (7), 4040-4045 (1999).</li>
<li>Kajiya, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+bases+of+odor+discrimination%3A+Reconstitution+of+olfactory+receptors+that+recognize+overlapping+sets+of+odorants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular bases of odor discrimination: Reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants.</a> J Neurosci. 21 (16), 6018-6025 (2001).</li>
<li>von der Weid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+transcriptional+profiling+of+chemosensory+neurons+identifies+receptor-ligand+pairs+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Large-scale transcriptional profiling of chemosensory neurons identifies receptor-ligand pairs in vivo.</a> Nat Neurosci. 18 (10), 1455-1463 (2015).</li>
<li>D'Hulst, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MouSensor%3A+A+Versatile+Genetic+Platform+to+Create+Super+Sniffer+Mice+for+Studying+Human+Odor+Coding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">MouSensor: A Versatile Genetic Platform to Create Super Sniffer Mice for Studying Human Odor Coding.</a> Cell Rep. 16 (4), 1115-1125 (2016).</li>
<li>Lu, M., Echeverri, F., Moyer, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+retention%2C+degradation%2C+and+aggregation+of+olfactory+G-protein+coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum retention, degradation, and aggregation of olfactory G-protein coupled receptors.</a> Traffic. 4 (6), 416-433 (2003).</li>
<li>McClintock, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+of+olfactory-adrenergic+receptor+chimeras+and+intracellular+retention+of+heterologously+expressed+olfactory+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Mol+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Functional expression of olfactory-adrenergic receptor chimeras and intracellular retention of heterologously expressed olfactory receptors.</a> Brain Res Mol Brain Res. 48 (2), 270-278 (1997).</li>
<li>Krautwurst, D., Yau, K. W., Reed, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+ligands+for+olfactory+receptors+by+functional+expression+of+a+receptor+library%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of ligands for olfactory receptors by functional expression of a receptor library.</a> Cell. 95 (7), 917-926 (1998).</li>
<li>Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RTP+family+members+induce+functional+expression+of+mammalian+odorant+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors.</a> Cell. 119 (5), 679-691 (2004).</li>
<li>Zhuang, H., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergism+of+accessory+factors+in+functional+expression+of+mammalian+odorant+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Synergism of accessory factors in functional expression of mammalian odorant receptors.</a> J Biol Chem. 282 (20), 15284-15293 (2007).</li>
<li>Li, Y. R., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+state+of+the+M3+muscarinic+acetylcholine+receptor+modulates+mammalian+odorant+receptor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Activation state of the M3 muscarinic acetylcholine receptor modulates mammalian odorant receptor signaling.</a> Sci Signal. 4 (155), ra1(2011).</li>
<li>Durocher, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reporter+gene+assay+for+high-throughput+screening+of+G-protein-coupled+receptors+stably+or+transiently+expressed+in+HEK293+EBNA+cells+grown+in+suspension+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A reporter gene assay for high-throughput screening of G-protein-coupled receptors stably or transiently expressed in HEK293 EBNA cells grown in suspension culture.</a> Anal Biochem. 284 (2), 316-326 (2000).</li>
<li>Liberles, S. D., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+second+class+of+chemosensory+receptors+in+the+olfactory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A second class of chemosensory receptors in the olfactory epithelium.</a> Nature. 442 (7103), 645-650 (2006).</li>
<li>Saraiva, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+effects+of+odorants+on+mouse+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Combinatorial effects of odorants on mouse behavior.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (23), E3300-E3306 (2016).</li>
<li>Nara, K., Saraiva, L. R., Ye, X., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+analysis+of+odor+coding+in+the+olfactory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A large-scale analysis of odor coding in the olfactory epithelium.</a> J Neurosci. 31 (25), 9179-9191 (2011).</li>
<li>Zhuang, H., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+cell-surface+expression+and+measuring+activation+of+mammalian+odorant+receptors+in+heterologous+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells.</a> Nat Protoc. 3 (9), 1402-1413 (2008).</li>
<li>Fan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+genetically+encoded+biosensors+using+firefly+luciferase%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase.</a> ACS Chem Biol. 3 (6), 346-351 (2008).</li>
<li>Fan, B. F., Wood, K. V. <a target="_blank" href="https://www.promega.com/~/media/files/resources/reprints/glosensor_gen_2009_gr001.ashx?la=en">Live-Cell Luminescent Assays for GPCR Studies: Combination of Sensitive Detection and Real-Time Analysis Expands Applications.</a> Genetic Engineering & Biotechnology News. 29, 30-31 (2009).</li>
<li>Geithe, C., Andersen, G., Malki, A., Krautwurst, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Butter+Aroma+Recombinate+Activates+Human+Class-I+Odorant+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Agric+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">A Butter Aroma Recombinate Activates Human Class-I Odorant Receptors.</a> J Agric Food Chem. 63 (43), 9410-9420 (2015).</li>
<li>Noe, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OR2M3%3A+A+Highly+Specific+and+Narrowly+Tuned+Human+Odorant+Receptor+for+the+Sensitive+Detection+of+Onion+Key+Food+Odorant+3-Mercapto-2-methylpentan-1-ol%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Senses%22%5BJournal%5D)">OR2M3: A Highly Specific and Narrowly Tuned Human Odorant Receptor for the Sensitive Detection of Onion Key Food Odorant 3-Mercapto-2-methylpentan-1-ol.</a> Chem Senses. 42 (3), 195-210 (2016).</li>
<li>Geithe, C., Noe, F., Kreissl, J., Krautwurst, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+broadly+tuned+odorant+receptor+OR1A1+is+highly+selective+for+3-methyl-2%2C4-nonanedione%2C+a+key+food+odorant+in+aged+wines%2C+tea%2C+and+other+foods%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Senses%22%5BJournal%5D)">The broadly tuned odorant receptor OR1A1 is highly selective for 3-methyl-2,4-nonanedione, a key food odorant in aged wines, tea, and other foods.</a> Chem Senses. 42 (3), 181-193 (2016).</li>
<li>Duan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+role+of+copper+in+detection+of+metal-coordinating+odorants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Crucial role of copper in detection of metal-coordinating odorants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (9), 3492-3497 (2012).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smelling+Sulfur%3A+Copper+and+Silver+Regulate+the+Response+of+Human+Odorant+Receptor+OR2T11+to+Low-Molecular-Weight+Thiols%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Smelling Sulfur: Copper and Silver Regulate the Response of Human Odorant Receptor OR2T11 to Low-Molecular-Weight Thiols.</a> J Am Chem Soc. , (2016).</li>
<li>Wu, L., Pan, Y., Chen, G. Q., Matsunami, H., Zhuang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-transporting+protein+1+short+%28RTP1S%29+mediates+translocation+and+activation+of+odorant+receptors+by+acting+through+multiple+steps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Receptor-transporting protein 1 short (RTP1S) mediates translocation and activation of odorant receptors by acting through multiple steps.</a> J Biol Chem. 287 (26), 22287-22294 (2012).</li>
<li>Shirasu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+receptor+and+neural+pathway+responsible+for+highly+selective+sensing+of+musk+odors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Olfactory receptor and neural pathway responsible for highly selective sensing of musk odors.</a> Neuron. 81 (1), 165-178 (2014).</li>
<li>Block, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implausibility+of+the+vibrational+theory+of+olfaction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Implausibility of the vibrational theory of olfaction.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (21), E2766-E2774 (2015).</li>
<li>Sato-Akuhara, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand+Specificity+and+Evolution+of+Mammalian+Musk+Odor+Receptors%3A+Effect+of+Single+Receptor+Deletion+on+Odor+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ligand Specificity and Evolution of Mammalian Musk Odor Receptors: Effect of Single Receptor Deletion on Odor Detection.</a> J Neurosci. 36 (16), 4482-4491 (2016).</li>
<li>Gane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+vibration-sensing+component+in+human+olfaction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Molecular vibration-sensing component in human olfaction.</a> PLoS One. 8 (1), e55780(2013).</li>
<li>Young, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+evolutionary+processes+shaped+the+mouse+and+human+olfactory+receptor+gene+families%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Different evolutionary processes shaped the mouse and human olfactory receptor gene families.</a> Hum Mol Genet. 11 (5), 535-546 (2002).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

דיוק מדידה ההפעלה של ניתוח בתגובה לחשיפה odorant מסוימים היא הצעד הראשון לפענח את הקוד של מידע חוש הריח. הניסויים המוצגים מייצגים המחקר הזה שדוגמה של איך אחת יכולה לזהות, באמצעות יישום במבחנה או ביטוי במערכת, ORs מגיב בין הרפרטואר או אנושי עבור החומר הכימי מדיף של עניין לאחר מכן אפיון הקולטן פרמקולוגיה באמצעות ריכוזים שונים של החומר הכימי. התוצאות שלנו אשר OR5AN1 בתור קולטן פיד ה בונה עבור muscone. זה עולה בקנה אחד עם הדו ח הקודם39 ומספקת הוכחה נוספת עבור החששות כי רק מספר קטן של...

חוש הריח ממלא תפקיד חשוב בהישרדות של בעלי החיים כפי שהם מסתמכים על יכולותיהם חוש הריח כדי להשיג מזון, להימנע טורפים של סכנה, להבחין בין המינים ובחר חבר1,2. מימוש פונקציות אלה תלויה קולטני odorant (ORs), אשר באים לידי ביטוי באופן אינדיבידואלי על פני השטח ciliary של חוש הריח החישה הניריונים (OSNs) ממוקם האפיתל חוש הריח (OE). ORs מהווים משפחה של superfamily קולטן (GPCR) G-חלבון בשילוב עם 400 ל 1200 מגוונות או גנים-אנוש בין הגדולות העכבר, בהתאמה3,4,5. ORs מופעל על ידי odorants מוביל ונאמנותם המחנה תאיים באמצעות הפעלת רציפים של חוש הריח, חלבון G (Golf) והקלד cyclase adenylyl השלישי (ACIII). הרמה מוגברת וכתוצאה מכך של מחנה תאיים שיכלה לשמש כשליח השני, אשר פותח את הערוץ ממותגת נוקלאוטיד על פני התא, מפעילה זרם של קטיונים כולל2 + Ca, פוטנציאל פעולה, ויזמות בסופו של דבר נוירו-פוטנציאל שידור ותפיסה חוש הריח. התהליך של איתור של האפליה מספר רב של odorants על ידי חברת ORs נחשב הצעד הראשון של התפיסה חוש הריח6,7.
כיוון באק, אקסל8 ראשון בהצלחה לשכפל odorant רצפטורים מבואר המנגנון של חוש הריח תפיסה שיזם ORs, deorphanization של המשפחה או הפך לאחד נקודות חמות בתחום זה. שיטות שונות בתוך, לשעבר vivo ו- in vitro לקשרי כדי למדוד או הפעלה כבר דווח על9,10,11,12. שיטה מסורתית בשימוש Ca2 + הדמיה ואחריו תא בודד RT-PCR-OSNs זמין הזיהוי של ORs שונים אליפטיות odorants13,14,15. לאחרונה, כניסתו של ניתוחים transcriptome בקנה מידה גדול קודם בפיתוח שיטות יותר תפוקה גבוהה ויוו . וזמינותו קנטאקי מזוהה ORs העכבר eugenol, muscone-מגיב עם השימוש של S100a5-tauGFP כתב בעכבר microarray והתאמצות ניתוח9. בהתבסס על הירידה ברמות mRNA או לאחר חשיפה odorant, הטכנולוגיה החלום מועסקים בגישה transcriptomic כדי לקבוע או פרופילים הפעלת שני מינים שאינם בעלי חוליות חוליות16. באופן דומה, בהתחשב זירחון של S6 בהפעלות עצביים, Matsunami הקבוצה mRNAs ברצף של הריבוזום phosphorylated immunoprecipitations כדי לזהות ORs מגיב12. בסופו של דבר, הקבוצה פיינשטיין דיווח עכברים סופר סניפר העשויה לשמש כפלטפורמה ללמוד ריח קידוד ויוו, המכונה ה-טכנולוגיית MouSensor17.
בממלכת במבחנה , האתגר של culturing OSNs הופך את מערכת heterologous ביטוי המחקה או ביטוי פונקציונאלי ויוו הפתרון האידיאלי לערוך סינון בקנה מידה גדול של כימיקלים מדיף עבור ORs. עם זאת, מאז שורות תאים בתרבית של מקורות-חוש הריח נבדלים OSNs מקורי, או חלבונים נשמרים באת רשתית תוך-פלזמית ללא אפשרות תנועה כדי קרום פלזמה, וכתוצאה מכך או השפלה ואובדן של קולטן פונקציה18 , 19. כדי לפתור בעיה זו, נעשו עבודות נרחב כדי לשכפל או ביטוי פונקציונלי על קרום התא של שורות תאים heterologous. . Krautwurst et al. מצורף קודם את הראשון 20 חומצות אמינו אופסין # רודופסין (Rho-תג) N-הטרמינל או חלבון, זה קידום הביטוי תא-השטח של כמה ORs תאי כליה אנושית עובריים (HEK)20. על-ידי עריכת ניתוח טורי של הביטוי (מרווה) ספריית מפענוח הגנום מ OSNs יחיד, סאיטו ואח. תחילה משובטים הובלת הקולטן חלבון (RTP) בני המשפחה, RTP1, RTP2, קולטן ביטוי משפר החלבון 1 (REEP1) הקלו או סחר על קרום התא ו משופרת odorant בתיווך התגובות של ORs בתאים HEK293T 21. על סמך ממצאים אלה, הקבוצה Matsunami בהצלחה הקים קו תא Hana3A, stably transfected עם RTP1, RTP2, REEP1 ו- Gαolf ב HEK293T ו transiently transfected עם ORs מתויג רו, יעיל או פונקציונלי ביטוי. לאחר מכן שמחקרים גילו 1) טופס קצר יותר של RTP1, RTP1S, יותר robustly לקדם או לתפקד מאשר החלבון RTP1 המקורי ו- 2) סוג 3 קולטן מוסקריני (M3R) זה יכול לשפר את הפעילות או באמצעות עיכוב של β-arrestin-2 גיוס, אשר שניהם הוכנסו למערכת ביטוי heterologous כדי למטב את ניסיוני פלט22,23.
מספר זיהוי שיטות השתמשו כדי לכמת את הפעלת קולטן במערכות heterologous. וזמינותו המופרש היפרדות אלקליין פוספטאז (SEAP) פועלת עם אנזים כתב transcriptionally מוסדר על ידי תגובת מחנה אלמנטים (קרס), שהופך אותו אופציה אטרקטיבית להערכת או הפעלה. ידי קרינה פלואורסצנטית מזוהה בקלות במדגם של המדיום תרבות לאחר הדגירה עם ריאגנט לזיהוי SEAP24. באמצעות שיטה זו, הפונקציות של ORs, כמו גם מחלקה משנית של קולטני chemosensory לידי ביטוי המעקב OE-קולטנים הקשורים אמין (TAARs) היה מאופיין26,25,27. שיטה נפוצה אחרת, וזמינותו לוציפראז, משתמשת גחלילית לוציפראז מדווח תחת השליטה של הרכיב תגובת מחנה (CRE). מדידת לומינסנציה שנוצר על ידי ייצור לוציפראז מספק אמצעי יעיל וחזק לכמת או הפעלה10,11,28.
מבחני המחנה בזמן אמת גם היה בשימוש נרחב בפיקוח באופן דינמי את תפקוד GPCRs heterologous או אנדוגני. דוגמה אחת כזו מבחני מתקדם מנצל variant ביוסנסור מקודדים גנטית, אשר ברשותה תחום מחייב מחנה דבוקה צורת לוציפראז מוטציה. כאשר cAMP נקשר, לשינוי הסתגלותי מוביל ההפעלה של לוציפראז, הפריה חוץ גופית שממנו ואז ניתן למדוד עם29,קורא30chemiluminescence. הטכנולוגיה המחנה בזמן אמת דווחה מתאים דה-orphaning של קולטני odorant האנושי בתאים 108CC15 HEK293 ו- NxGהתחת = "xref" > 31,32,33, כמו גם Hana3A HEK293T, נגזר תאים34,35. הקבוצה Krautwurst גם תיאר בפירוט את הטכנולוגיה המחנה בזמן אמת מתאים בגישות בקנה מידה גדול או הקרנת דו כיווני32,33.
כאן נתאר פרוטוקול למדידת הפעלה או שימוש assay המחנה בזמן אמת בתאים Hana3A. ב פרוטוקול זה, הפריה חוץ גופית של תאים חיים מראש equilibrated נמדד kinetically במשך 30 דקות לאחר הטיפול עם תרכובות נדיפות ספציפיים, המייצגים ניתוח מדויק ויעיל יותר של הפעלת או כי הם פחות רגישים חפצים המתרחשים בסביבת סלולר עם ריח-induced תא רעילות וזמן ממושך. מדידה בזמן אמת זו מאפשרת הקרנת ORs והן ליגנדים בקנה מידה גדול, כמו גם אפיון של זוגות OR-ליגנד מסוימים של ריבית. באמצעות שיטה זו, אנו בהצלחה מזוהות OR5AN1 רצפטור muscone תרכובת מושק על ידי ביצוע הקרנה נגד ORs האנושי 379 ולאשר לאחר מכן התוצאה חיובית ההקרנה.

<table><tbody><tr><td>Amphotericin B</td><td>Sigma</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10099-141</td><td></td></tr><tr><td>GloSensor cAMP מגיב</td><td>Promega</td><td>E1290</td><td></td></tr><tr><td>pGloSensor-20F cAMP פלסמיד</td><td>Promega</td><td>E1171</td><td></td></tr><tr>תאי <td></td><td></td><td>Hana3A</td><td>זמינים מהמחברים על פי בקשה</td></tr><tr><td>HBSS, ללא סידן או מגנזיום</td><td>GIBCO</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Hyclone</td><td>SH30237</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>M3R פלסמיד</td><td></td><td></td><td>משובט לווקטור ביטוי של יונקים כגון pCI</td></tr><tr><td>MEM, עם EBSS ו-L-גלוטמין</td><td>Hyclone</td><td>SH30024</td><td></td></tr><tr><td>Muscone</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200528</td><td></td></tr><tr><td>מאסק טיבטי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S359165</td><td></td></tr><tr><td>פלסמידים</td><td></td><td></td><td>OR משובטים עם תג Rho לווקטור ביטוי של יונקים כגון pCI</td></tr><tr><td>PBS, ללא סידן או מגנזיום</td><td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>ערכת מיני-הכנה של פלסמיד</td><td>Tiangen</td><td>DP103-03</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>RTP1S פלסמיד</td><td></td><td></td><td>משובט לווקטור ביטוי של יונקים כגון pCI</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Hyclone</td><td>SH30236</td><td></td></tr><tr><td>צינור PCR 0.2 מ"ל</td><td>Axygen</td><td>PCR-02-C</td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינור אפנדורף</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15-mL 17 מ"מ x 120 מ"מ צינור חרוטי</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>פיפטמן רב-ערוצי עם 8 בארות ו/או 12 בארות</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית תאים לבנים עם תחתית שטוחה 96 בארות</td><td>גריינר</td><td>655098</td><td></td></tr><tr><td>100 מ"מ x 20 מ"מ צלחת תרבית תאים</td><td>BD Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Class II עם זרימה</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>למינריתחממת תרבית תאים, עם 5% CO2</td>צנטריפוגה, עם רוטור דלי מתנדנד לצינורות חרוטיים של 15 מ"ל קורא צלחות F200 אינסופי מיקרוסקופ ניגודיות פאזה Tecan עם מטרות x10 ו-x20 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מאגרי ריאגנטים סטריליים להפצה</td><td></td><td></td><td></td>רב ערוצית</tr><tr><td>מגבת</td><td></td><td></td><td></td> נייר סטרילית</tr></tbody></table>

לחיות תאים מדידה של odorant קולטן הפעלה באמצעות assay המחנה בזמן אמת

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

הגודל העצום של odorant בתרבית של קולטן (או אר) משפחות נוכח הקשיים למצוא שלהם ליגנדים cognate בקרב רבים כימיקלים נדיפים. כדי ביעילות ובדייקנות deorphanize ORs, אנו משלבים את השימוש קו תא heterologous לבטא ORs בתרבית של פלסמיד ביוסנסור ששונה גנטית כדי למדוד את הייצור המחנה במורד הזרם של הפעלה או בזמן אמת. Assay הזה יכול לשמש odorants מסך נגד ORs, ולהיפך. אינטראקציות חיוביות קולטן odorant מן המסכים יכולים לאשר לאחר מכן על-ידי בדיקת נגד ריכוזי ריח שונים, יצירת עקומות הריכוז-תגובה. כאן השתמשנו בשיטה זו כדי לבצע הקרנה תפוקה גבוהה של תרכובת מדיף נגד ספריה או האדם הביע בתאים Hana3A, אישר כי הקולטן מגיב באופן חיובי הוא רצפטור המתחם עניין cognate. מצאנו שיטה זו זיהוי תפוקה גבוהה כדי להיות יעיל ואמין בהערכת או הפעלה, הנתונים שלנו מספקים דוגמה של השימוש פוטנציאל במחקרים תפקודית או.

Muscone הוא המרכיב העיקרי ארומטי מ טבעי מושק. אחרונים שהיו בשימוש מחקרים OR5AN1 מזוהה בתור קולטן אנושי עבור muscone ותרכובות מושק אחרות macrocyclic מבוסס על הומולוגיה או העכבר, MOR215-1, שוכפלה מ glomeruli muscone מגיב ב מתנהג עכברים37,38. על ידי הקרנת הרפרטואר או האדם, הקבוצה שלנו, הקבוצה Touhara גם מזוהה OR5AN1 קולטן העיקריים עבור תרכובות מושק בשני macrocyclic, cyclopentadecanone ו- muscone, בהתאמה, באמצעות את לוציפראז assay מער...

אפיון הפונקציה של קולטני odorant מגישה חלק חיוני בתהליך deorphanization. אנו מתארים שיטה למדוד את ההפעלה של רצפטורים odorant בזמן אמת באמצעות וזמינותו של המחנה.

לחיות תאים מדידה של Odorant קולטן הפעלה באמצעות Assay המחנה בזמן אמת

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

המטרה הכללית של בדיקת cyclic AMP בתפוקה גבוהה ובזמן אמת זו היא לסרוק ריחות מול קולטני ריח ולהפך. מכיוון שעכברים מועילים לחקירת תפקוד קולטני ריח בכך שהם מאפשרים סריקות בקנה מידה גדול יותר הן של קולטני ריח והן של הליגנדים, כמו גם אפיונים פרמקולוגיים של זוגות קולטן-ליגנד רלוונטיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להעריך ביעילות ובאמינות את ההפעלה של קולטן על ידי ריח.מערכת ביטוי הטרוגנית של ריח-לקולטן המשתמשת בתאים חיים. התחל בבחינת תאי Hana3A תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה (phase-contrast) כדי לוודא את חיוניות התאים ולהעריך את רמת ההצפיפות (confluence). לאחר מכן, שאב את כל המצע מצלחת תרבית התאים.שטפו את התאים על ידי הוספת 10 milliliters של phosphate buffered saline לפלטה, סובבו את הצלחת ושאבו את ה-PBS. לאחר מכן, הוסיפו לפלטה שלושה milliliters של 0.5%trypsin-EDTA. השאירו את ה-trypsin על התאים למשך דקה אחת או עד שכל התאים יצופו.בטלו את פעילות ה-trypsin על ידי הוספה של 5 milliliters של MEM עם 10%FBS וביצוע פיפוט מעלה ומטה כדי לפרק גושי מסת תאים. לאחר ביצוע ספירת תאים, העבירו 2x10 to the 6th תאים לכל לוחית 96-well המיועדת לטרנספקציה למבחנה של 15 milliliter. חשוב לחשב את מספר התאים המדויק להכנה על לוחית ה-96-well כדי למנוע צמיחת יתר או תת-צמיחה של תאים לפני הגירוי.סובב את המבחנות בצנטריפוגה ב-200 ×g למשך חמש דקות. לאחר מכן, שאב את הנוזל העליון (supernatant) מבלי להפריע למשקע התאים. הוסף שישה מיליליטר של מצע גידול ללא אנטיביוטיקה עבור כל פלטת 96 בארות, ובצע פיפוט מעלה ומטה, ללא יצירת בועות אוויר, כדי לפרק גושי תאים.העבירו את התאים התלויים למכל מאגירה (reservoir). באמצעות פיפט רב-ערוצי, העבירו 50 µL של תאים לכל באר בלוחיות 96-בארים. הדגרירו למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide.לפני התעתוק (טרנספקציה), בחנו את התאים שהונחו בצלחות תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה כדי לוודא רמת התמזגות (confluence) נאותה של כ-30 עד 50% לכל באר, ולאחר מכן החזירו אותם למדגרה. פעלו לפי השורה המסומנת כ-odorant-to-receptor construct, ה-accessory factor constructs, וה-cyclic AMP biosensor variant construct. לאחר מכן, הכינו תערובת טרנספקציית פלסמיד ב-500 microliters של MEM עבור כל פלטה בעלת 96 בארות.בשלב הבא, הכין תערובת טרנספקציה המכילה 18 µl של ריאגנט לטרנספקציה מתווכת ליפידים ב-500 µl של MEM. ערבב את תערובת הטרנספקציה עם תערובת הפלזמה באמצעות פיפוט למעלה ולמטה. לאחר מכן, דגור בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.לאחר הדגירה, עצרו את התגובה על ידי הוספה של 5 milliliters של MEM עם 10%FBS לתערובת הטרנספקציה. לאחר מכן, פרסו שכבה עבה של נייר סופג סטרילי במ"]; מabilis תא cell culture hood. הוציאו מהאינקובטור פלטה בעלת 96 בארות עם תאים.הקישו בעדינות ובחוזר על הפיתה כשהיא הפוכה על ערמת נייר סופג, כך שהמצע ייספג לחלוטין בנייר הסופג. העבירו 50 µL מתערובת הטרנספקציה המשולבת לכל באר בלוח 96-בארים והדגירו למשך לילה, בין 18 ל-24 שעות, בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide. ניתן לנהל את לוחות הזמנים של הטרנספקציה והסטימולציה כך שיישמרו במכשיר במקרה שבו נבדקים יותר מלוח 96-בארים אחד בניסוי אחד, כדי שכל הלוחות יהיו תואמים לאחר אותו פרק זמן של טרנספקציה וחשיפה למעוררים.לפני הגירוי, יש לבחון את התאים שעברו טרנספקציה תחת מיקרוסקופ בניגוד מופע (phase-contrast) כדי לוודא שהושגה התמסכות (confluence) נאותה של 50 עד 80% לכל באר לפני ההחזרה לאינקובטור. לאחר מכן, יש להכין מצע גירוי על ידי הוספת 10 millimolar heaps ו-5 millimolar glucose לתוך תמיסת Hanks' balanced salt solution. יש להפשיר על קרח אליקוואטות של 55 microliters של reagent substrate למדידת cyclic AMP בזמן אמת.הכינו תמיסת equal abration בריכוז 2% על ידי ערבוב של 55 µl של ריאגנט הסובסטרט ו-2,750 µl של מצע גירוי. לאחר פריסת שכבה עבה של נייר סופג על המשטח, הקישו בעדינות ובחוזר ונשנות על הפלטה כשהיא הפוכה על גבי נייר הספיגה, כך שמצע התעתוק ייספג בנייר. שטפו את התאים על ידי הוספת 50 µl של מצע גירוי לכל באר באמצעות פיפטה.הקישו בעדינות ובחזרתיות על פלטת 96 הבארים כדי להוציא את מצע הגירוי. העבירו בפיפטה 25 µL של תמיסת שיווי משקל 2% לכל באר והדגירו בטמפרטורת החדר, בחושך, למשך שעתיים. לקראת סוף זמן ההדגרה, דללו את תמיסות המלאי המופשרות של חומרי הריח לריכוז העבודה בתוך מצע הגירוי.לפני הוספת חומרי הריח, השתמשו בקורא לוחיות כימילומניסנציה כדי למדוד את רמת הלומניסנציה הבסיסית של הלוחית. הוציאו במהירות את הלוחית מקורא הלוחיות והוסיפו 25 µL של מהדלי חומרי הריח לכל באר. לאחר מכן, התחילו מיד במדידה רציפה של לומניסנציה בכל הבארים למשך 20 מחזורים בתוך 30 דקות.379 קולטנים ייחודיים לריח אנושי נסרקו כנגד muscone בריכוז 30 µM באמצעות בדיקת cAMP בזמן אמת. קוביות צבעוניות לאורך ציר ה-X מציינות משפחות שונות של קולטני ריח אנושיים. ציר ה-Y מייצג לומינסנסיה מנורמלת 30 דקות לאחר הוספת חומר הריח, כאשר התגובה הגיעה למקסימום עבור הביקורת החיובית.התגובה של OR5AN1 מוצגת כאן. איור זה מציג מדידות בזמן אמת של הפעלת OR5AN1 על ידי ריכוזים שונים של muscone, וכן את התוצאה מבקרת שלילה ללא ריח. החץ מצביע על נקודת הזמן שבה נוסף הריח.כאן מוצגת עקומה של תגובת ריכוז של OR5AN1 כנגד muscone, 30 דקות לאחר הוספת חומר הריח. הטכניקה המתוארת כאן אורכת בסך הכל שלושה ימים, החל מלוח מאגרי תרביות בשכבות ביום הראשון. לאחר רכישת מיומנות, ניתן להשלים את התהליך ביום האחרון בתוך שלוש שעות עבור כל לוח בעל 96 בארות, במידה ובוצע כראוי.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לך הבנה טובה של האופן שבו ניתן לנהל את הפעלת קולטני ריח באמצעות בדיקת cyclic AMP לצורך ניצול התוצאות.

live-cell-measurement-odorant-receptor-activation-using-real-time

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

כאן אנו להדגים פרוטוקול לבצע מכתים תא חי, שניתן להשתמש בהם כדי לזהות קולטנים odorant על פני השטח של תאים HEK293T בנוחות. בנוסף, הוא עשוי לשמש גם כדי assay לביטוי פני השטח של קולטנים chemosensory אחרים או GPCRs.

Assaying הביטוי Surface של קולטנים Chemosensory בתוך תאים Heterologous

סרטון זה מדגים את הפרוטוקול למדידת הפעלת קולטן ריח בתאים נגועים באמצעות ביוסנסור מחזורי אדנוזין מונופוספט (cAMP) וזיהוי לומינסנציה. השיטה מיושמת לחקר אינטראקציות קולטן-ליגנד ומסלולי איתות בנוירוני ריח.

מדידת הפעלת קולטן ריח באמצעות בדיקת אדנוזין מונופוספט מחזורית בזמן אמת

מקור: de March, C. A. et. al., ניטור בזמן אמת במבחנה של הפעלת קולטני ריח על ידי ריח בשלב האדים. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים את השיטה לניטור הפעלה בזמן אמת של קולטני ריח בתאי יונקים רקומביננטיים באמצעות מדידת לומינסנציה. קשירת ריח מפעילה הפעלת חלבון G וייצור cAMP, ומפעילה חלבוני גלו-סנסור הפולטים זוהר בעת קשירת המצע, ומספקים מדד כמותי לתגובת הקולטן.

ניטור בזמן אמת של הפעלת קולטני ריח בתאים רקומביננטיים

הפעלה מתמדת של תוצאות מעכבות G-חלבון בשילוב קולטנים ברגישות של איתות cyclase adenylyl. כדי לזהות את המסלולים מולקולריים החיוניים, גישות nonbiased נחוצות, עם זאת, אסטרטגיה זו מחייבת הפיתוח של assay רגישות cAMP מבוסס תאים ניתן להרחבה. בזאת, אנו מתארים assay רגישות למולקולה קטנה והקרנת siRNA.

רגישות סמים של adenylyl cyclase: התייעלות Assay ומזעור למולקולה קטנה ויישומים הקרנת siRNA

דפוסי הפעלה קולטני ריח לקודד זהות ריח, אך המחסור בנתונים שפורסמו זיהוי ligands odorant לקולטני ריח של יונקים מעכב את ההתפתחות של מודל מקיף של קידוד ריח. פרוטוקול זה מתאר שיטה לזיהוי לתפוקה גבוהה של ligands קולטני ריח וכימות של הפעלת קולט.

ניתוח תפוקה גבוהה של קולטני ריח יונקים: מדידה של קולטן הפעלה באמצעות בלוציפראז פעילות

ניתוח התכונות הפיזיולוגיות של נוירונים חושי ריח עדיין מתמודד עם מגבלות טכניות. כאן אנו מתעדים אותם באמצעות מהדק טלאי מחורר בהכנה שלמה של אפיתל הריח בעכברים ממוקדי גנים. טכניקה זו מאפשרת לאפיין את תכונות הממברנה ותגובות לליגנדים ספציפיים של נוירונים המבטאים קולטני ריח מוגדרים.

הקלטה מחוררת תיקון מהדק של עכבר עצב סנסורי חוש הריח בneuroepithelium שלמים: ניתוח פונקציונלי של נוירונים הבעת קולטן odorant מזוהה

פרוטוקול זה מנתח התנהגות ניווט של זחל דרוזופילה בתגובה optogenetic בו זמנית גירוי של נוירונים חוש הריח שלו. אור של 630 ננומטר אורך גל משמש כדי להפעיל את חוש הריח נוירונים בודדים לבטא של אופסין # רודופסין אדום-העביר ערוץ. תנועת הזחל מתבצע בו זמנית, רשמה דיגיטלית, נותחה באמצעות תוכנה מותאמת אישית-נכתב.

מעקב אחר התנהגות זחל דרוזופילה בתגובה Optogenetic גירוי של חוש הריח נוירונים

מבחינה פיזיולוגית, odorant רצפטורים מופעלים על ידי מולקולות odorant בשאיפה בשלב אדי. עם זאת, ביותר מערכות in vitro לנצל שלב נוזלי odorant גירוי. כאן, אנו מציגים שיטה המאפשרת ניטור בזמן אמת במבחנה של הפעלת קולטן odorant על odorant גירוי בשלב אדי.

בזמן אמת בחוץ גופית ניטור של הפעלת קולטן Odorant מאת Odorant בהשלב אדי

הפרוטוקול המוצג במחקר זה ממחיש את יעילותו של cAMP Difference Detector In Situ  במדידת cAMP בשתי שיטות. שיטה אחת משתמשת בספקטרופוטומטר קריאת לוחות 96 בארות עם תאי HEK-293. השיטה השנייה מדגימה תאי HASM בודדים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

דינמיקת cAMP בזמן אמת בתאים חיים באמצעות גלאי ההבדל cAMP פלואורסצנטי באתרו

נוירונים קולטניים ריח (ORNs) להמיר אותות ריח ראשון לתוך קולט נוכחיים מעורר בתור פוטנציאל פעולה שמועברים לנוירונים מסדר השנייה בנורת חוש הריח. כאן אנו מתארים את טכניקת יניקת פיפטה כדי להקליט את הקולטן odorant מושרה פוטנציאלי פעולה הנוכחי ומORNs העכבר בו זמנית.

תגובות odorant מושרה הקלטות מתא העצב קולטני ריח באמצעות טכניקת יניקת פיפטה

למדו שיטה למדידת הפעלה של קולטני ריח בזמן אמת באמצעות מבחן cAMP בתפוקה גבוהה. השיטה מאפשרת סינון יעיל של ריחנים מול קולטנים בתאי Hana3A חיים.

לחיות תאים מדידה של Odorant קולטן הפעלה באמצעות Assay המחנה בזמן אמת

גלה סרטונים נוספים