לחיות תאים מדידה של Odorant קולטן הפעלה באמצעות Assay המחנה בזמן אמת

המטרה הכוללת של בדיקת AMP מחזורית זו בתפוקה גבוהה בזמן אמת היא לסנן ריחות כנגד קולטני ריח ולהיפך. מכיוון שעכברים שימושיים לחקירת תפקוד קולטני הריח בכך שהם מאפשרים הקרנות בקנה מידה גדול יותר הן של קולטני הריח והן של הליגנדים, כמו גם קרטליזציות פרמקולוגיות של זוגות קולטנים-ליגנדים מעניינים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנו יכולים להעריך את הפעלת הריח לקולטן ביעילות ובאמינות.

מערכת ביטוי הטרולוגית של ריח לקולטן באמצעות תאים חיים. התחל בהתבוננות בתאי Hana3A תחת מיקרוסקופ ניגוד פאזה כדי להבטיח את כדאיות התא ולהעריך את המפגש. לאחר מכן שאפו את כל המדיום מצלחת תרבית התאים.

ושטפו את התאים על ידי הוספת 10 מיליליטר של מי מלח עם פוספט על הצלחת, מערבולת המנה ושאיבת ה-PBS. לאחר מכן, הוסף לצלחת את שלושת המיליליטר של 0.5% טריפסין-EDTA. השאירו את הטריפסין על התאים למשך דקה אחת או עד שכל התאים צפים.

השבת את הטריפסין על ידי הוספת 5 מיליליטר של MEM עם 10% FBS ופיפטינג למעלה ולמטה כדי לפרק נתחי מסת תא. לאחר ביצוע ספירת תאים, העבירו 2x10 לתאים השישיים לכל צלחת של 96 בארות כדי לעבור לצינור של 15 מיליליטר. חשוב שתחשב את המספר הנכון של תאים שיש להכין על צלחת של 96 בארות כדי למנוע צמיחת יתר או תת-צמיחה של תאים לפני הגירוי.

צנטריפוגה את הצינורות ב -200 פעמים G למשך חמש דקות. ואז שאפו את הסופרנטנט מבלי להפריע למשטח התא. הוסף שישה מיליליטר של מדיום ללא אנטיביוטיקה לכל צלחת של 96 בארות ופיפטה למעלה ולמטה מבלי ליצור בועות אוויר כדי לפרק נתחים ממסת התא.

העבירו את התאים התלויים למאגר. בעזרת פיפטה רב-ערוצית, פיפטה 50 מיקרוליטר תאים לכל באר מלוחות 96 הבארות. דגירה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.

לפני הטרנספקציה התבונן בתאים המצופים תחת מיקרוסקופ ניגוד פאזה כדי להבטיח מפגש תקין של כ-30 עד 50% לבאר ולאחר מכן חזור לחממה. עקוב אחר מבנה הריח לקולטן המתויג בשורה, מבני גורם האביזר ומבנה גרסת החיישן הביולוגי המחזורי של AMP. לאחר מכן הכינו תערובת טרנספקציה פלזמה ב-500 מיקרוליטר MEM לכל צלחת של 96 בארות.

לאחר מכן, הכינו תערובת טרנספקציה המכילה 18 מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה בתיווך שומנים ב -500 מיקרוליטר MEM. מערבבים את תערובת הטרנספקציה עם תערובת הפלזמה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. ואז לדגור בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.

לאחר הדגירה, עצור את התגובה על ידי הוספת 5 מיליליטר של MEM עם 10% FBS לתערובת הטרנספקציה. לאחר מכן, פרשו שכבה עבה של מגבות נייר סטריליות במכסה המנוע של תרבית התאים. קח צלחת של 96 בארות עם תאים מהחממה.

בעדינות ושוב ושוב, הקש על הצלחת הפוכה על ערימת מגבות הנייר כך שהמדיום ייספג לחלוטין במגבת הנייר. מעבירים 50 מיקרוליטר מתערובת הטרנספקציה המשולבת לכל באר בצלחת 96 הבארות ודוגרים למשך הלילה למשך 18 עד 24 שעות בחום של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. אתה יכול לנהל את הטרנספקציה ולוח הזמנים של הגירוי צריך להימשך במכשיר עבור יותר מלוח אחד של 96 בארות נבדק בניסוי אחד כך שכל הלוחות ישתקפו לאחר אותו מרווח חשיפה למזקקים.

לפני הגירוי, התבונן בתאים שעברו טרנספטציה תחת מיקרוסקופ ניגוד פאזה כדי להבטיח מפגש תקין של 50 עד 80% לבאר לפני החזרה לחממה. לאחר מכן הכינו את מדיום הגירוי על ידי הוספת 10 ערימות מילי-מולריות ו-5 מילי-מולרי גלוקוז לתמיסת המלח המאוזנת של הנקס. להפשיר 55 מיקרוליטר שסק של מגיב מצע מחזורי בזמן אמת של בדיקת AMP על קרח.

הכן תמיסת אברציה שווה של 2% על ידי ערבוב של 55 מיקרוליטר של מגיב המצע ו -2, 750 מיקרוליטר של מדיום גירוי. לאחר פריסת שכבה עבה של מגבות נייר על הספסל, הקש בעדינות ושוב ושוב על הצלחת הפוכה על מגבות הנייר כך שמדיום הטרנספקציה ייספג במגבות הנייר. שטפו את התאים על ידי פיפטינג של 50 מיקרוליטר של מדיום גירוי לכל באר.

הקש בעדינות ושוב ושוב את מדיום הגירוי מצלחת 96 הבארות. פיפטה 25 מיקרוליטר של תמיסת שיווי משקל של 2% לכל באר ודוגרת בטמפרטורת החדר בחושך למשך שעתיים. לפני תום זמן הדגירה, יש לדלל תמיסות מלאי ריח מופשר למדיום ריכוז וגירוי עובדים.

לפני הוספת ריח, השתמש בקורא צלחות כימילומינסנציה כדי למדוד את רמת הזוהר הבסיסי של הצלחת. הסר במהירות את הצלחת מקורא הצלחות והוסף 25 מיקרוליטר של דילול הריח לכל באר. לאחר מכן התחל מיד מדידת זוהר רציפה של כל הבארות למשך 20 מחזורים תוך 30 דקות.

379 קולטני ריח אנושיים ייחודיים נבדקו כנגד 30 מוסקונים מיקרו-מולאריים באמצעות בדיקת AMP מחזורית בזמן אמת. בלוקים צבעוניים לאורך ציר ה-X מצביעים על משפחות שונות של קולטני ריח אנושיים. ציר ה-Y מייצג זוהר מנורמל 30 דקות לאחר הוספת ריח כאשר התגובה הגיעה למקסימום עבור הבקרה החיובית.

התגובה של OR5AN1 מצוינת. איור זה מציג מדידות בזמן אמת של הפעלת OR5AN1 על ידי ריכוזים שונים של מוסקון והתוצאה משליטה שלילית ללא ריח. החץ מציין את נקודת הזמן של הוספת אודרנט.

כאן, מוצגת עקומת תגובת ריכוז של OR5AN1 כנגד מוסקון 30 דקות לאחר הוספת אודרנט. הטכניקה המתוארת כאן אורכת בסך הכל שלושה ימים החל מצלחת מלאי של שכבות תרבית ביום הראשון. לאחר השליטה, ניתן להשלים את התהליך ביום האחרון תוך שלוש שעות עבור כל צלחת של 96 בארות אם הוא מבוצע כראוי.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לנהל את ההפעלה של קולטני אודרנט באמצעות בדיקת AMP מחזורית כדי לרתום את התוצאות.