Assay עיכוב (איץ ' אי) Hemagglutination אופטימיזציה לכמת נוגדן ספציפי שפעת Titers

המטרה הכללית של בדיקת עיכוב המגלוטינציה של כדוריות דם (hemagglutination inhibition assay) זו היא למדוד את תרכיזי הנוגדנים (antibody titers) נגד וירוסים ספציפיים רלוונטיים. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הווקסינולוגיה בנוגע לחסינות ולמיגון המתווכים על ידי החסון בקרב אוכלוסיות שונות ובקבוצות גיל וחולים מגוונות. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם דיוקה והיכולת לקבוע במהירות את התרכיז של נוגדנים מנטרלים.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי רמות נוגדנים (titers) בבני אדם, ניתן להחיל אותה גם על מערכות אחרות, כגון רמות נוגדנים בסרום של עכברים או בתעלילי תרבית. התחילו בסימון של פלטות מיקרוטיטר בעלות 96 בארות עם המידע הניסויי המתאים. לאחר מכן, העמידו את הפלטה במצב אנכי והשתמשו בפיפט רב-ערוצי כדי להוסיף 25 µL של PBS לכל באר, למעט הבאר הראשונה בשורת הדילול (titration row) האחורית התחתונה.

הוסף 50 µL של תמיסת האנטיגן הרלוונטית שהוכנה טרי לבאר הראשונה של שורת התיתראציה ההפוכה (back titration), ולאחר מכן הוסף 25 µL של דגימות סרום שעובדו ב-RDE לבארות הראשונות של עשר השורות העליונות. הוסף 25 µL של האנטי-סרום המתאים לבאר הראשונה של השורה ה-11 כביקורת חיובית. העבר 25 µL מהבאר הראשונה של כל שורה לבארות העוקבות כדי לבצע דילול סדרתי פי שניים.

בצעו פיפטור מעלה ומטה 10 עד 15 פעמים עבור כל שלב בדילול, והשליכו את 25 המיקרוליטרים האחרונים מהבארות האחרונות. לאחר מכן, הוסיפו 25 µL של תמיסת האנטיגן לכל באר בשורות 1 עד 11, ו-25 µL של PBS בלבד לכל באר בשורת הטיטראציה ההפוכה. הקישו בעדינות על הפלטה 10 פעמים מכל ארבעת צדדיה כדי לערבב.

לאחר מכן, כסו את הפלטה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. בתום הדגירה, הוסיפו 50 microliters של תמיסת תאי דם אדומים לכל באר וערבבו את הפלטה באמצעות טפיחות נוספות. לאחר מכן, כסו שוב את הפלטה והדגירו את תאי הדם האדומים בהתאם למין שבו נעשה שימוש, כפי שמתואר בטבלה.

לאחר הוספת תאי הדם האדומים לפלטה, היצמדו לזמן האינקובציה המתאים לסוג הדם ששימש בבדיקה. אינקובציה קצרה מדי או ארוכה מדי תוביל לפרשנות שגויה של התוצאות. בסיום האינקובציה, העריכו את ההמגלוטינציה על ידי הטיית הפלטה ב-90 מעלות למשך 25 שניות, וסמנו את התוצאות עבור כל באר, בעוד הפלטה עדיין מוטה, על גבי תרשים מודפס של פלטת 96 בארות.

בניסוי זה, נבחנה התגובה הנוגדנית המושרה על ידי החיסון ב-26 מתנדבים בריאים שקיבלו חיסון שפעת טריוולנטי מומת המכיל influenza A/H1N1/California/2009, A/H3N2/Texas/2012 ו-B/Massachusetts/O2/2012 לפני עונת השפעת של 2015-2014. נצפתה תגובה חיסונית של תגובתיות צולבת עבור זני הנגיף A/H3N2/Switzerland/2013 ו-A/H3N2/Texas/2012, עם תרי של ממוצע גיאומטרי של עיכוב המגלוטנין (hemagglutination inhibition titers) נמוך משמעותית והגנה סרומית מושרית נגד influenza A/H3N2/Switzerland/2013 בהשוואה ל-influenza A/H3N2/Texas/2012. לאחר החיסון, רמות הנוגדנים נגד שני הזנים עלו, למרות שזן ה-A/H3N2/Switzerland/2013 לא נכלל בחיסון.

המוגלוטינין הנגיפי מפגין פוטנציאל להמגלוטינציה של אריתרוציטים התלוי במין. ראוי לציין כי דם של חזיר גינאה אינו עובר המגלוטינציה תקינה עם שפעת B, ודם של הודו בעל פוטנציאל להמגלוטינציה עם טיטרים גבוהים ותגובת צולבת נמוכה. לאחר רכישת המיומנות, ניתן להשלים טכניקה זו תוך שלוש שעות אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לטפל בסרום באמצעות RDE כדי לבטל עיכובים לא ספציפיים וקישור לא ספציפי במהלך ההמגלוטינציה של הווירוס. לאחר ביצוע הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון ELISA, כדי לענות על שאלות נוספות לגבי תפקידן של אימונוגלובולינים ספציפיים לפתוגן בודד. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום האימונולוגיה הווירוסית להעמיק את הבנתנו לגבי חסינות הקשורה לחיסונים במטופלים בריאים ובמטופלים עם דיכוי חיסוני מקבוצות גיל שונות.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן ביצוע בדיקת עיכוב המגלוטינציה של כדוריות דם (hemagglutination inhibition assay) לצורך כימות טיטרי של נוגדנים ספציפיים לזן שפעת בקנה מידה רחב. זכרו כי עבודה עם אנטיגנים ויראליים, דם של בעלי חיים ודגימות סרום אנושיות עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון עבודה במעבדה ברמת בטיחות BSL2, בעת ביצוע נוהל זה.