Name: Assay עיכוב (איץ אי) Hemagglutination אופטימיזציה לכמת נוגדן ספציפי שפעת Titers (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 34 s
Description: למדו את פרוטוקול עיכוב ההמגלוטינציה לכימות נוגדנים ספציפיים לשפעת בדגימות סרום. שיטה זו מאפשרת הערכה מדויקת של חסינות מופקת מחיסון באוכלוסיות שונות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Prevention and control of seasonal influenza with vaccines. Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices--United States, 2013-2014. MMWR Recomm Rep. 62, Centers for Disease, C. & Prevention. RR-07 1-43 (2013).</li>
<li>Dominguez-Cherit, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critically+Ill+patients+with+2009+influenza+A%28H1N1%29+in+Mexico%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Critically Ill patients with 2009 influenza A(H1N1) in Mexico.</a> JAMA. 302 (17), 1880-1887 (2009).</li>
<li>Fox, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pandemic+influenza+%28H1N1%29%3A+impact+on+lung+transplant+recipients+and+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Heart+Lung+Transplant%22%5BJournal%5D)">Pandemic influenza (H1N1): impact on lung transplant recipients and candidates.</a> J Heart Lung Transplant. 29 (9), 1034-1038 (2010).</li>
<li>Piercy, J., Miles, A., Krankheiten, S. B. fG. S. V., Values, M. The Economic Impact of Influenza in Switzerland: Interpandemic Situation. , Swiss Federal Office of Public Health, Division of Epidemiology and Infectious Diseases, Section of Viral Diseases and Sentinel Systems. (2003).</li>
<li>Barclay, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+network+assortativity+of+influenza+vaccination+at+a+high+school%3A+implications+for+outbreak+risk+and+herd+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Positive network assortativity of influenza vaccination at a high school: implications for outbreak risk and herd immunity.</a> PLoS One. 9 (2), 87042(2014).</li>
<li>Baluch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Randomized+controlled+trial+of+high-dose+intradermal+versus+standard-dose+intramuscular+influenza+vaccine+in+organ+transplant+recipients%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Randomized controlled trial of high-dose intradermal versus standard-dose intramuscular influenza vaccine in organ transplant recipients.</a> Am J Transplant. 13 (4), 1026-1033 (2013).</li>
<li>Haralambieva, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Impact+of+Immunosenescence+on+Humoral+Immune+Response+Variation+after+Influenza+A%2FH1N1+Vaccination+in+Older+Subjects%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The Impact of Immunosenescence on Humoral Immune Response Variation after Influenza A/H1N1 Vaccination in Older Subjects.</a> PLoS One. 10 (3), 0122282(2015).</li>
<li>Egli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccine+adjuvants--understanding+molecular+mechanisms+to+improve+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Swiss+Med+Wkly%22%5BJournal%5D)">Vaccine adjuvants--understanding molecular mechanisms to improve vaccines.</a> Swiss Med Wkly. 144, 13940(2014).</li>
<li>O'Shea, D., Widmer, L. A., Stelling, J., Egli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changing+face+of+vaccination+in+immunocompromised+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Infect+Dis+Rep%22%5BJournal%5D)">Changing face of vaccination in immunocompromised hosts.</a> Curr Infect Dis Rep. 16 (9), 420(2014).</li>
<li>Meulemans, G., Carlier, M. C., Gonze, M., Petit, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+hemagglutination-inhibition%2C+agar+gel+precipitin%2C+and+enzyme-linked+immunosorbent+assay+for+measuring+antibodies+against+influenza+viruses+in+chickens%5BTitle%5D)+AND+%22Avian+Dis%22%5BJournal%5D)">Comparison of hemagglutination-inhibition, agar gel precipitin, and enzyme-linked immunosorbent assay for measuring antibodies against influenza viruses in chickens.</a> Avian Dis. 31 (3), 560-563 (1987).</li>
<li>Martins, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+internal+controls+for+the+Luminex+instrument+as+part+of+a+multiplex+seven-analyte+viral+respiratory+antibody+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Development of internal controls for the Luminex instrument as part of a multiplex seven-analyte viral respiratory antibody profile.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 9 (1), 41-45 (2002).</li>
<li>Webster, R., Cox, N., Stöhr, K. WHO Animal Influenza Manual. WHO/CDS/CSR/NCS. 2002.5, 1-99 (2002).</li>
<li>Mittelholzer, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cell+lines+used+in+a+micro+neutralization+test+for+measuring+influenza-neutralizing+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human cell lines used in a micro neutralization test for measuring influenza-neutralizing antibodies.</a> Scand J Immunol. 63 (4), 257-263 (2006).</li>
<li>Hamilton, R. S., Gravell, M., Major, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+antibody+titers+determined+by+hemagglutination+inhibition+and+enzyme+immunoassay+for+JC+virus+and+BK+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of antibody titers determined by hemagglutination inhibition and enzyme immunoassay for JC virus and BK virus.</a> J Clin Microbiol. 38 (1), 105-109 (2000).</li>
<li>Kumakura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+hemagglutination+inhibition+assay+and+enzyme+immunoassay+for+determination+of+mumps+and+rubella+immune+status+in+health+care+personnel%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Lab+Anal%22%5BJournal%5D)">Comparison of hemagglutination inhibition assay and enzyme immunoassay for determination of mumps and rubella immune status in health care personnel.</a> J Clin Lab Anal. 27 (5), 418-421 (2013).</li>
<li>Ogundiji, O. T., Okonko, I. O., Adu, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+measles+hemagglutination+inhibiting+antibody+levels+among+school+children+in+Ibadan%2C+Nigeria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunoassay+Immunochem%22%5BJournal%5D)">Determination of measles hemagglutination inhibiting antibody levels among school children in Ibadan, Nigeria.</a> J Immunoassay Immunochem. 34 (2), 208-217 (2013).</li>
<li>Cwach, K. T., Sandbulte, H. R., Klonoski, J. M., Huber, V. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21883963">Contribution of murine innate serum inhibitors toward interference within influenza virus immune assay.</a> Influenza Other Respir Viruses. 6 (2), 127-135 (2012).</li>
<li>Lee, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+mimicry+by+antibody+F045-092+facilitates+universal+binding+to+the+H3+subtype+of+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Receptor mimicry by antibody F045-092 facilitates universal binding to the H3 subtype of influenza virus.</a> Nat Commun. 5, 3614(2014).</li>
<li>Blumel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+prevalence+of+cross-reactive+antibodies+against+influenza+A%28H3N2%29+variant+virus%2C+Germany%2C+2003+to+2010%5BTitle%5D)+AND+%22Euro+Surveill%22%5BJournal%5D)">Age-related prevalence of cross-reactive antibodies against influenza A(H3N2) variant virus, Germany, 2003 to 2010.</a> Euro Surveill. 20 (32), 16-24 (2015).</li>
<li>Reber, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seasonal+Influenza+Vaccination+of+Children+Induces+Humoral+and+Cell-Mediated+Immunity+Beyond+the+Current+Season%3A+Cross-reactivity+with+Past+and+Future+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Seasonal Influenza Vaccination of Children Induces Humoral and Cell-Mediated Immunity Beyond the Current Season: Cross-reactivity with Past and Future Strains.</a> J Infect Dis. , (2016).</li>
</ol>

Æ נתמכה על ידי מחקר מעניקה מתוך התוכנית "SNSF Ambizione ציון" (PZ00P3_154709), "Forschungsfond, Förderung strategischer Projekte" אוניברסיטת בזל, שוויץ Stiftungsinfektionskrankheiten, Bangeter Rhyner Stiftung. L.K. נתמך על ידי מענק האוניברסיטה של גראץ, אוסטריה טכני. J.L. מאשר תמיכה על ידי אחוות iPhD יוזמת SystemsX.ch תוכנית ביולוגיה של מערכות (קריאתה 9).

כימות של קדם, פוסט-חיסון שפעת וירוס נוגדן ספציפי titers היא כלי חשוב הכרחי ללימודי חיסון. בהתבסס על האמצעים הפונדקאית של הגנה מפני הידבקות בווירוסים, כגון seroprotection (> 1:40) או seroconversion (כייל נוגדנים 4-fold עלייה), חיסון אסטרטגיות יכול להיות מותאם9. באמצעות פרוטוקולים שסופקו ניתן לקבוע: (i) הפוטנציאל hemagglutination של וירוס מסוים, ו (ii) titers נוגדנים לוירוס עניין.
השינוי ופתרון:
פרוטוקול זה מבוסס על מי תקן<sup ...

זיהום בנגיף שפעת מזוהה עם ניכר תחלואה, תמותה גבוהה עלויות הבריאות1,2,3,4. בפרט, קשישים, תינוקות, נשים בהריון, חולים עם מחלה כרונית נמצאים בסיכון לתוצאות קליניות חמורות יותר. לכן, חיסון נגד במחזור זני וירוס שפעת היא המדד העיקרי להפחתת הנטל של המחלה בקרב אוכלוסיות בסיכון גבוה אלה. העלייה של התגובה החיסונית בודדים לאחר החיסון, למשל, נוגדנים ספציפיים שפעת מעל סף מגן, מפחיתה את הסיכון בודדים של זיהום ובאופן כללי את הסבירות של שידור ויראלי בתוך אוכלוסיה 5. הבנה מפורטת של חיסון-induced ההורמונאלית התגובה החיסונית באוכלוסיות שונות ועל -פני בקבוצות גיל שונות הוא רכיב מפתח כדי לענות על שאלות קליניות חשובות-6,-7,-8 , 9, כגון: למה יש חלק מהחולים הקשישים זיהומים למרות החיסון הקודם? מהו "טוב" ו- "מספיק" חיסון-induced להגנה? באיזו תדירות צריך חיסון להיות מוחל על חולים immunosuppressed להגיע titers מגן? מהו המינון היעיל ביותר? מהי ההשפעה של אדג'וונט הרומן על חיסון שלאחר נוגדן titers? המדד של ייצור נוגדנים ספציפיים חיסון עשוי לעזור לענות על שאלות חשובות אלה ולשפר את תוצאות חיסון.
כימות של נוגדנים ספציפיים וירוס titers יכול להתבצע עם שיטות חיסוניות שונות. זה כולל מוצק-שלב10 או מבוסס-חרוז אליסה11 מבחני HI assay12, מבחני נטרול13. שיטות מבוססות-אליסה לאפשר ההקרנה של כמויות גדולות יחסית של הדוגמאות סרום נגד אנטיגנים שונים. כמו כן, אימונוגלובולינים (Ig) M ו- IgG ספציפי פתוגן ניתן בנפרד לסייר. למרות המאפיינים של אנטיגן, למשל, רצף ליניארי חומצת אמינו או חלקיקים דמויי וירוס עשוי להשפיע על הכריכה של נוגדנים, הספקטרום של epitopes פוטנציאלי רחב מאוד, ואינו מספק מידע על אם נוגדן התגובה יש רלוונטיות פונקציונלי.
לעומת זאת, וזמינותו ניטרול קובע את הפוטנציאל של נוגדנים באופן פונקציונלי לעכב את הזיהום של תאים, לכן ומשקף הניטרול פוטנציאליים. עם זאת, שיטה זו היא עבודה מאוד אינטנסיבית, דורש culturing של ספציפי תא קווים ולחיות וירוסים, לכן, זה זמן רב, יקר, והוא דורש ציוד מיוחד.
מאמר זה מתאר שלב אחר שלב פרוטוקול מבוסס-ארגון הבריאות העולמי WHO HI12 לכמת נוגדן ספציפי שפעת titers. Hemagglutination היא תופעת האופיינית של וירוסים מסוימים שמוביל התלכדות של אריתרוציטים. עיכוב של האפקט הזה עם המטופל סרה מאפשר מדידת ריכוז נוגדן מעכבות, אשר משקף השפעה ניטרלית.
יש לשנות את זרימת העבודה של הפרוטוקול-המי כדי לאפשר טיפול יעיל יותר של דוגמאות מרובות במקביל, ובכך מקצר את הזמן הנדרש. הפרוטוקול הראשון מתאר את הקביעה של הפוטנציאל התלכדות של אנטיגן מסוים שפעת. בעשותו כן, נקבע ריכוז אנטיגן שפעת הנכון עבור פרוטוקול השני. החלק הזה יש לחזור עם כל אנטיגן ויראלי חדש, כמו גם כל אצווה של דם.
פרוטוקול השני מתאר את הקביעה של נוגדנים ספציפיים שפעת titers. הפרוטוקולים הציג ממוטבים עבור החקירה של וירוס שפעת ודוגמאות בנסיוב אדם לעומת זאת, אותה ניתן להחיל גם הדוגמאות סרום העכבר או תרבית תאים supernatants מ מגורה תאים חיסוניים, למשל, תאי-B וירוסים ספציפיים. תוצאות יכול להיקבע כמו titers נמדד מוחלטת. במחקרים רבים חיסון, את titers הגיאומטרי ועל סמך 95% מוצגים עבור כל אוכלוסייה מסוימת. פרשנות, seroprotection או seroconversion משמשים לעתים קרובות כדי לתאר את הרגישות של אוכלוסיה לוירוס מסוימים. Seroprotection מוגדרת כייל של ≥1:40, seroconversion כמו כייל נוגדנים 4-fold יותר מ להגביר עם הישג של seroprotective titers בין שתי נקודות זמן (הנפוץ ביותר לפני מתן החיסון, חיסון שלאחר 30 יום משמשים).
פרוטוקולים קל לשימוש, הם ניתן להתאים למגוון רחב של שאלות המחקר. בפרט, הם יכולים לשמש כדי לקבוע באופן אמין ובמהירות titers נוגדנים נגד וירוסים שונים אחרים עם יכולת hemagglutination, כגון חצבת, polyomaviruses, חזרת או אדמת14,15,16 .

<table><tbody><tr><td>25 מ"ל מאגרי פיפטה רב-ערוציים חד פעמיים</td><td>Integra</td><td>4312</td><td></td></tr><tr><td>צינורות PCR 8 בארות</td><td>מותג GMBH</td><td>781332</td><td>עבור צלחת</td></tr><tr><td>מיקרוטיטר 96 בארות בסרום,</td><td>TPP</td><td>92097</td><td>בצורת U לבדיקת HI בעת שימוש ב-RBCs יונקים</td></tr><tr><td>צלחת מיקרוטיטר 96 בארות,</td><td>קורנינג קוסטאר</td><td>3897</td><td>בצורת V לבדיקת HI בעת שימוש ב-RBCs</td></tr> <tr><td>עופותAqua ad iniect. Steril</td><td>Bichsel AG</td><td>1000004</td><td>להכנת תמיסות אנטיגן שפעת וכולרה תמיסות תסנין</td></tr><tr><td>עוף RBC (10%)</td> <td>Cedarlane</td><td>CLC8800</td><td>תרחיף 10% של כדוריות דם אדומות עוף בתמיסה של אלסבר</td></tr><tr><td>תסנין כולרה</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8772</td><td>משמש כאנזים הורס קולטנים (RDE)</td></tr><tr>PBS <td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td> <td>של Dulbeccoלדילול דגימות הסרום, תאי דם אדומים ואנטיגנים</td></tr><tr><td>Eppendorf Multichannel pipette, 12 ערוצים, 10-100 ומיקרו; l</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>Z683949</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה רב-ערוצית של אפנדורף, 8 ערוצים, 10-100 ומיקרו; l</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z683930</td><td></td></tr><tr><td>שרקנים RBC (10%)</td><td>Cedarlane</td><td>CLC1800</td><td>תרחיף של 10% של תאי דם אדומים של שרקנים בתמיסת Alsever's</td></tr><tr><td>Influenza Anti-A/California/7/09 HA סרום&nbsp;</td><td>NIBSC</td><td>14/134&nbsp;</td><td>משמש כבקרה חיובית במבחן HI</td></tr><tr><td>סרום HA דמוי שפעת נגד שפעת&9715293/2013&nbsp;</td><td>NIBSC</td><td>14/272</td><td>משמש כבקרה חיובית בבדיקת HI</td></tr><tr><td>Influenza Anti-A/Texas/50/2012-Like HA Serum&nbsp;</td><td>NIBSC</td><td>13/178</td><td>משמש כבקרה חיובית בבדיקת HI</td></tr><tr><td>Influenza Anti-B/Brisbane/60/2008-HA&nbsp;</td><td>NIBSC</td><td>13/254&nbsp;</td><td>משמש כבקרה חיובית במבחן HI</td></tr><tr><td>אנטי שפעת B / מסצ'וסטס / 02/2012 סרום HA &nbsp;</td><td>NIBSC</td><td>13/182</td><td>משמש כבקרה חיובית בבדיקת HI</td></tr><tr><td>אנטיגן שפעת A/California/7/09 (H1N1)(NYMC-X181)&nbsp;</td><td>NIBSC</td><td>12/168</td><td>מושבת, מטוהר חלקית A/California/7/09 (H1N1)(NYMC-X181)&nbsp; וירוס (כ-46&מיקרו; gHA/ml)</td></tr><tr><td>אנטיגן שפעת A/שוויץ/9715293/2013 (NIB88)</td><td>NIBSC</td><td>14/254</td><td>נגיף A/Switzerland/9715293/2013 (NIB88) מומת, מטוהר חלקית (כ-55&מיקרו; gHA/ml)</td></tr><tr><td>אנטיגן שפעת A/Texas/50/2012 (H3N2)(NYMCX-223)</td><td>NIBSC</td><td>13/112</td><td>נגיף A/Texas/50/2012 (H3N2)(NYMCX-223) (כ-74&micro; gHA/ml)</td></tr><tr><td>אנטיגן שפעת B/Brisbane/60/2008</td><td>NIBSC</td><td>13/234</td><td>נגיף B/Brisbane/60/2008 מומת, מטוהר חלקית (כ-42&micro; gHA/ml)</td></tr><tr><td>אנטיגן שפעת B/Massachusetts/02/2012</td><td>NIBSC</td><td>13/134</td><td>נגיף B/Massachusetts/02/2012 מושבת, מטוהר חלקית (כ-35&micro; gHA/ml)</td></tr><tr><td>שפופרות סרום</td><td>S-Monovette, Sardstedt</td><td>01.1601.100</td><td>למיצוי סרום עם מפעיל קרישה עם</td></tr><tr><td>תורם יחיד RBC אנושי, סוג 0</td><td>מחקר חדשני</td><td>IPLA-WB3&nbsp;</td><td>השעיית כדוריות דם אדומות אנושיות מתורם יחיד בתמיסה של אלסבר (כ-26%)</td></tr><tr><td>תרחיף RBC טורקי (10%)</td><td>Cedarlane</td><td>CLC1180</td><td>תרחיף של 10% של תאי דם אדומים של הודו בתמיסה של Alsever</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

assay עיכוב (איץ ' אי) hemagglutination אופטימיזציה לכמת נוגדן ספציפי שפעת titers

An Optimized Hemagglutination Inhibition (HI) Assay to Quantify Influenza-specific Antibody Titers

נוגדנים titers משמשים כסמני הפונדקאית להגנה סרולוגית נגד שפעת, פתוגנים אחרים. מידע מפורט על ייצור נוגדנים מראש, שלאחר חיסון נדרש להבין חסינות חיסון-induced. מאמר זה מתאר פרוטוקול נקודה-מאת-נקודת אמין לקביעת נוגדן ספציפי שפעת titers. הפרוטוקול הראשון מתאר שיטה כדי לציין הכמויות אנטיגן הדרושים עבור hemagglutination, דיפרנצילי המשקלל הריכוזים לשימוש עוקבות בפרוטוקול השני (hemagglutination assay, HA assay). פרוטוקול השני מתאר כימות של נוגדנים ספציפיים שפעת titers נגד זנים ויראלי באמצעות טורי לדילול האדם סרום או תא תרבות supernatants (hemagglutination עיכוב assay, HI assay).
כדוגמה יישומית, אנו מראים את התגובה נוגדן של עמית בריאים, אשר קיבל חיסון שפעת מוחלש. בנוסף, אשיג בין וירוסים שפעת שונים מוצג, שיטות כדי למזער אשיג באמצעות סוגים שונים של תאי דם אדומים בעלי חיים (RBCs) מוסברים. הדיון מדגיש את היתרונות ואת החסרונות של מבחני הציג איך הקביעה של נוגדנים ספציפיים שפעת titers יכול לשפר את ההבנה של חסינות הקשורות החיסון.

תגובת נוגדנים מושרה מראש, שלאחר חיסון נגד שפעת A H3N2 תגובת חיסון-induced נוגדן נאמד ב- 26 מתנדבים בריאים אשר קיבלו חיסון שפעת יחידת משנה כ מוחלש המכיל שפעת A/H1N1/קליפורניה/2009 A/H3N2/טקסס/2012, B/מסצ'וסטס/02/2012 לפני 2014 / עונת שפעת 2015. איור 6 מראה דוגמה נציג מקבלי החיסון 2. מעניין, במהלך העונה שפעת מסוים, א/H3N2/טקסס/2012 לא היתה במחזור, וכללה במקום זאת העונה עומס נגיפי שונה במקצת: A/H3N2/שוויץ/2013. Hemagglutinin נגיפית A/H3N2/טקס...

הפרוטוקולים הציג מתארים כיצד לבצע וזמינותו עיכוב hemagglutination לכמת נוגדן ספציפי שפעת titers מן הדוגמאות סרום מקבלי החיסון נגד שפעת. הבדיקה הראשונה קובע ריכוזים מיטביים אנטיגן ויראלי על-ידי hemagglutination. הבדיקה השניה מכמתת נוגדן ספציפי שפעת titers על ידי עיכוב hemagglutination.

Assay עיכוב (איץ ' אי) Hemagglutination אופטימיזציה לכמת נוגדן ספציפי שפעת Titers

Antibody titers are commonly used as surrogate markers for serological protection against influenza and other pathogens. Detailed knowledge of antibody ...

המטרה הכללית של בדיקת עיכוב המגלוטינציה של כדוריות דם (hemagglutination inhibition assay) זו היא למדוד את תרכיזי הנוגדנים (antibody titers) נגד וירוסים ספציפיים רלוונטיים. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הווקסינולוגיה בנוגע לחסינות ולמיגון המתווכים על ידי החסון בקרב אוכלוסיות שונות ובקבוצות גיל וחולים מגוונות. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם דיוקה והיכולת לקבוע במהירות את התרכיז של נוגדנים מנטרלים.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי רמות נוגדנים (titers) בבני אדם, ניתן להחיל אותה גם על מערכות אחרות, כגון רמות נוגדנים בסרום של עכברים או בתעלילי תרבית. התחילו בסימון של פלטות מיקרוטיטר בעלות 96 בארות עם המידע הניסויי המתאים. לאחר מכן, העמידו את הפלטה במצב אנכי והשתמשו בפיפט רב-ערוצי כדי להוסיף 25 µL של PBS לכל באר, למעט הבאר הראשונה בשורת הדילול (titration row) האחורית התחתונה.הוסף 50 µL של תמיסת האנטיגן הרלוונטית שהוכנה טרי לבאר הראשונה של שורת התיתראציה ההפוכה (back titration), ולאחר מכן הוסף 25 µL של דגימות סרום שעובדו ב-RDE לבארות הראשונות של עשר השורות העליונות. הוסף 25 µL של האנטי-סרום המתאים לבאר הראשונה של השורה ה-11 כביקורת חיובית. העבר 25 µL מהבאר הראשונה של כל שורה לבארות העוקבות כדי לבצע דילול סדרתי פי שניים.בצעו פיפטור מעלה ומטה 10 עד 15 פעמים עבור כל שלב בדילול, והשליכו את 25 המיקרוליטרים האחרונים מהבארות האחרונות. לאחר מכן, הוסיפו 25 µL של תמיסת האנטיגן לכל באר בשורות 1 עד 11, ו-25 µL של PBS בלבד לכל באר בשורת הטיטראציה ההפוכה. הקישו בעדינות על הפלטה 10 פעמים מכל ארבעת צדדיה כדי לערבב.לאחר מכן, כסו את הפלטה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. בתום הדגירה, הוסיפו 50 microliters של תמיסת תאי דם אדומים לכל באר וערבבו את הפלטה באמצעות טפיחות נוספות. לאחר מכן, כסו שוב את הפלטה והדגירו את תאי הדם האדומים בהתאם למין שבו נעשה שימוש, כפי שמתואר בטבלה.לאחר הוספת תאי הדם האדומים לפלטה, היצמדו לזמן האינקובציה המתאים לסוג הדם ששימש בבדיקה. אינקובציה קצרה מדי או ארוכה מדי תוביל לפרשנות שגויה של התוצאות. בסיום האינקובציה, העריכו את ההמגלוטינציה על ידי הטיית הפלטה ב-90 מעלות למשך 25 שניות, וסמנו את התוצאות עבור כל באר, בעוד הפלטה עדיין מוטה, על גבי תרשים מודפס של פלטת 96 בארות.בניסוי זה, נבחנה התגובה הנוגדנית המושרה על ידי החיסון ב-26 מתנדבים בריאים שקיבלו חיסון שפעת טריוולנטי מומת המכיל influenza A/H1N1/California/2009, A/H3N2/Texas/2012 ו-B/Massachusetts/O2/2012 לפני עונת השפעת של 2015-2014. נצפתה תגובה חיסונית של תגובתיות צולבת עבור זני הנגיף A/H3N2/Switzerland/2013 ו-A/H3N2/Texas/2012, עם תרי של ממוצע גיאומטרי של עיכוב המגלוטנין (hemagglutination inhibition titers) נמוך משמעותית והגנה סרומית מושרית נגד influenza A/H3N2/Switzerland/2013 בהשוואה ל-influenza A/H3N2/Texas/2012. לאחר החיסון, רמות הנוגדנים נגד שני הזנים עלו, למרות שזן ה-A/H3N2/Switzerland/2013 לא נכלל בחיסון.המוגלוטינין הנגיפי מפגין פוטנציאל להמגלוטינציה של אריתרוציטים התלוי במין. ראוי לציין כי דם של חזיר גינאה אינו עובר המגלוטינציה תקינה עם שפעת B, ודם של הודו בעל פוטנציאל להמגלוטינציה עם טיטרים גבוהים ותגובת צולבת נמוכה. לאחר רכישת המיומנות, ניתן להשלים טכניקה זו תוך שלוש שעות אם היא מבוצעת כראוי.בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לטפל בסרום באמצעות RDE כדי לבטל עיכובים לא ספציפיים וקישור לא ספציפי במהלך ההמגלוטינציה של הווירוס. לאחר ביצוע הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון ELISA, כדי לענות על שאלות נוספות לגבי תפקידן של אימונוגלובולינים ספציפיים לפתוגן בודד. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום האימונולוגיה הווירוסית להעמיק את הבנתנו לגבי חסינות הקשורה לחיסונים במטופלים בריאים ובמטופלים עם דיכוי חיסוני מקבוצות גיל שונות.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן ביצוע בדיקת עיכוב המגלוטינציה של כדוריות דם (hemagglutination inhibition assay) לצורך כימות טיטרי של נוגדנים ספציפיים לזן שפעת בקנה מידה רחב. זכרו כי עבודה עם אנטיגנים ויראליים, דם של בעלי חיים ודגימות סרום אנושיות עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון עבודה במעבדה ברמת בטיחות BSL2, בעת ביצוע נוהל זה.

an-optimized-hemagglutination-inhibition-hi-assay-to-quantify

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

שיטה פשוטה כתם חריץ פותחה עבור כימות של hemagglutinin שפעת ויראלי neuraminidase באמצעות נוגדנים אוניברסלי מיקוד רצפים שימור ביותר שלהם מזוהה באמצעות ניתוחים ביואינפורמטיקה. גישה חדשנית זו עשויה לספק חלופה שימושי להגדרה כמותית של hemagglutinin כל נגיפיים neuraminidase.

ניתוח כמותי של השפעת כל סוג Hemagglutinins ויראלי ו Neuraminidases באמצעות נוגדנים יוניברסל מבחני כתם פשוט חריץ

שיטה זו מתארת ​​את השימוש במערכת הדמיה צבע אינפרא אדום מבוסס על זיהוי של H1N1 בנוזל bronchioalveolar (BAL) שטיפה של עכברים נגועים על רגישות גבוהה. מתודולוגיה זו ניתן לבצע 96 - או 384 גם צלחת, דורש &lt;10 נפח μl של חומר הבדיקה יש פוטנציאל הקרנה בו זמנית של פתוגנים רבים.

תפוקה גבוהה איתור שיטת וירוס השפעת

הסרטון מדגים בדיקת עיכוב hemagglutination לאיתור נוגדנים בסרום כנגד אנטיגנים ספציפיים. אישור של עיכוב המגלוטיציה בבאר הבדיקה והמגלוטינציה בבאר הבקרה מושג באמצעות דפוסים חזותיים ברורים. בדיקה זו ממלאת תפקיד מכריע בהערכת התגובה החיסונית, יעילות החיסון וחקר זיהומים נגיפיים בווירולוגיה ובאימונולוגיה.

בדיקת עיכוב Hemagglutination לאיתור נוגדנים בסרום כנגד אנטיגן מטרה

סרטון זה מדגים טכניקה ליצירת גרסאות מילוט של נוגדנים חד-שבטיים של נגיף השפעת המנטרל. תרחיף וירוס מנוטרל נוגדנים מוזרק לביצי תרנגולת עובריות כדי להפיץ גרסאות בריחה באופן סלקטיבי. התוצאה היא אוכלוסיית וירוסים בעיקר של וריאנטים בריחה, שאושרו באמצעות בדיקת Hemagglutination.

יצירת וריאנטים של הימלטות מנגיף השפעת מפני נוגדנים מנטרלים

סרטון זה מדגים בדיקה המודדת שפעת נוירמינידז (NA) המעכבת טיטרים נוגדנים בדגימת סרום. דגימת סרום המכילה נוגדנים נגד NA מתווספת לצלחת מיקרווול מצופה פטואין. עם הוספת הנגיף, הנוגדנים מונעים מ-NA נגיפי לנתק את הפטואין ולחשוף את הגלקטוז שלו. לאחר מכן מוסיפים לקטין מצומד פרוקסידז, שנקשר לגלקטוז החשוף. טיטר נוגדנים מעכבי NA נקבע באמצעות בדיקה קולורימטרית, שבה מצע פרוקסידאז נבקע על ידי פרוקסידאז מצומד לקטין משותק כדי לייצר צבע.

בדיקה למדידת נוגדנים מעכבי שפעת Neuraminidase Inhibition Titers

אנו מתארים את בדיקת הלקטין המקושרת לאנזים (ELLA) למדידת טיטר נוגדנים לעיכוב שפעת נויראמינידאז (NA) ב-sera. הבדיקה משתמשת באגלוטינין בוטנים כדי לכמת שאריות גלקטוז שהופכות לנגישות כאשר NA מסיר חומצה סיאלית מצלחות מצופות פטואין, 96 בארות.

מדידת טיטר נוגדנים עיכוב Neuraminidase שפעת ידי enzyme-linked Assay לקטינים

מחקר זה מתאר   מבוססי הדמיה assay מיקרו-נטרול לנתח את היחסים בין אנטיגני וירוסים. פרוטוקול מעסיקה וסורק ויש לו ארבעה שלבים, כולל טיטרציה, quantitation טיטרציה, נטרול, ו quantitation הניטרול. את assay עובד היטב עם שפעת A במחזור הנוכחי (H1N1) pdm09, A (H3N2), ווירוסים B.

אופטימיזציה של Assay כמותי מיקרו-נטרול

אנו מתארים שיטה שבאמצעותה אנו מזהים שאריות קריטי הנדרש עבור האיגוד של נוגדנים חד-שבטיים אנושית או מאתר שמכוונות את hemagglutinin נגיפי שפעת A וירוסים. הפרוטוקול ניתן להתאים glycoproteins משטח אחר וירוס, נוגדנים נטרול המתאימים שלהם.

דור של בריחה וריאציות של נטרול נוגדנים חד-שבטיים של וירוס שפעת

אנו מתארים שיטה כדי למדוד ההפעלה של פונקציות אפקטור Fc בתיווך על ידי נוגדנים את המטרה hemagglutinin וירוס שפעת. ניתן גם להתאים assay הזה כדי להעריך את היכולת של נוגדנים חד-שבטיים או polyclonal סרה מיקוד אחרים glycoproteins משטח ויראלי לזירוז חסינות בתיווך Fc.

שיטה להערכת פונקציות אפקטור בתיווך Fc המושרה על ידי שפעת Hemagglutinin נוגדנים ספציפיים

נוגדנים נטרול שפעת לתאם עם הגנה של דלקות שפעת. מבחני Microneutralization למדוד נוגדנים נטרול של sera אנושי, משמשים לעתים קרובות על שפעת אנושית סרולוגיה. אנו מתארים וזמינותו של microneutralization באמצעות MDCK-SIAT1 תאים כדי למדוד נטרול נוגדן titers עכשווי וירוסים A(H3N2) 3C.2a ו- 3C.3a בעקבות חיסון שפעת או זיהום.

מבחני מדידת שפעת בנטרול תגובות נוגדנים וירוסים A(H3N2) סרה האנושי על-ידי Microneutralization באמצעות תאים MDCK-SIAT1

מאמר זה מציג שיטה פשוטה להכנת אנטיגן של 4 יחידות המגלוטינציה לבדיקה סרולוגית של נגיף מחלת ניוקאסל. על ידי קביעה מדויקת של טיטר ההמגלוטינציה של האנטיגן, בשילוב עם שיטת טיטרציה לאחור קפדנית יותר, ותהליך התאמה מוגדר היטב, הוא משפר את יעילות הבדיקה, מפחית תוצאות חיוביות כוזבות ומשפר את מעקב המחלות בעופות.

אופטימיזציה של הכנת אנטיגן לבדיקת עיכוב המגלוטינציה של סרולוגיה של נגיף מחלת ניוקאסל

למדו את פרוטוקול עיכוב ההמגלוטינציה לכימות נוגדנים ספציפיים לשפעת בדגימות סרום. שיטה זו מאפשרת הערכה מדויקת של חסינות מופקת מחיסון באוכלוסיות שונות.

Assay עיכוב (איץ ' אי) Hemagglutination אופטימיזציה לכמת נוגדן ספציפי שפעת Titers

גלה סרטונים נוספים