Assay עיכוב (איץ ' אי) Hemagglutination אופטימיזציה לכמת נוגדן ספציפי שפעת Titers

הפרוטוקולים הציג מתארים כיצד לבצע וזמינותו עיכוב hemagglutination לכמת נוגדן ספציפי שפעת titers מן הדוגמאות סרום מקבלי החיסון נגד שפעת. הבדיקה הראשונה קובע ריכוזים מיטביים אנטיגן ויראלי על-ידי hemagglutination. הבדיקה השניה מכמתת נוגדן ספציפי שפעת titers על ידי עיכוב hemagglutination.

המטרה הכוללת של בדיקת עיכוב המגלוטינציה זו היא למדוד את טיטר הנוגדנים כנגד נגיפים ספציפיים מעניינים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום החיסונים לגבי חסינות והגנה בתיווך חיסון בקרב אוכלוסיות שונות ובקרב קבוצות גיל ומטופלים שונות. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא מדויקת ושהיא מאפשרת קביעת טיטר מהירה של נוכחות נוגדנים מנטרלים.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי טיטרים של נוגדנים אנושיים, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות, כגון טיטרים נוגדנים לסרום עכברים, גם סופרנטנטים תרביים. התחל בתיוג 96 לוחות מיקרוטיטר באר עם המידע הניסויי המתאים. לאחר מכן סובב את הצלחת בכיוון האנכי והשתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי להוסיף 25 מיקרוליטר PBS לכל באר, למעט הבאר הראשונה בשורת הטיטרציה האחורית התחתונה.

הוסף 50 מיקרוליטר מתמיסת האנטיגן הטרייה שהוכנה מעניינת לבאר הראשונה של שורת הטיטרציה האחורית, ואחריה תוספת של 25 מיקרוליטר של דגימות סרום שטופלו ב-RDE לבארות הראשונות של עשר השורות העליונות. הוסף 25 מיקרוליטר של האנטי-סרום המתאים לבאר הראשונה של השורה ה -11 כבקרה חיובית. העברת 25 מיקרוליטר מהבאר הראשונה של כל שורה לבארות העוקבות שלהם לביצוע דילול טורי כפול.

פיפטה למעלה ולמטה 10 עד 15 פעמים עבור כל שלב דילול, תוך השלכת 25 המיקרוליטרים האחרונים מהבארות האחרונות. לאחר מכן, הוסף 25 מיקרוליטר של תמיסת האנטיגן לכל באר שורות אחת עד 11 ו-25 מיקרוליטר של PBS רק לכל באר בשורת הטיטרציה האחורית. הקש על הצלחת בזהירות 10 פעמים מכל ארבעת הצדדים כדי לערבב.

לאחר מכן מכסים את הצלחת למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. בתום הדגירה מוסיפים 50 מיקרוליטר תמיסת כדוריות דם אדומות לכל באר ומערבבים את הצלחת עם הקשה נוספת. לאחר מכן מכסים שוב את הצלחת ודוגרים על כדוריות הדם האדומות בהתאם למין המשמש כמתואר בטבלה.

לאחר הוספת כדוריות הדם האדומות לצלחת, הקפידו על זמן הדגירה המתאים לסוג הדם המשמש בבדיקה. דגירה קצרה מדי או ארוכה מדי תוביל לפרשנות שגויה של התוצאות. בתום הדגירה, העריכו את ההמגלוטינציה על ידי הטיית הצלחת 90 מעלות למשך 25 שניות וסמנו את התוצאות עבור כל באר, בזמן שהצלחת עדיין מוטה, על גבי סכמה מודפסת של צלחת 96 הבארות.

בניסוי זה, תגובת הנוגדנים המושרה על ידי החיסון הוערכה ב-26 מתנדבים בריאים שקיבלו חיסון שפעת משולש מומת המכיל שפעת A/H1N1/קליפורניה/2009, A/H3N2/טקסס/2012 ו-B/Massachusetts/O2/2012 לפני עונת השפעת של 24 2015. נצפתה תגובה חיסונית צולבת עבור זני הנגיף A/H3N2/Switzerland/2013 ו-A/H3N2/Texas/2012, עם טיטרים נמוכים משמעותית של עיכוב המגלוטינציה גיאומטרית ממוצעת והגנה סרולוגית מושרית מפני שפעת A/H3N2/Switzerland/2013 בהשוואה לשפעת A/H3N2/Texas/2012. לאחר החיסון, רמות הנוגדנים נגד שני הזנים עלו, למרות שהזן A/H3N2/Switzerland/2013 לא היה נוכח בחיסון.

המגלוטינין ויראלי מדגים פוטנציאל תלוי מין להמגלוטינציה של אריתרוציטים. מעניין, דם שרקנים אינו המגלוטינט כראוי עם שפעת B ולדם הודו יש פוטנציאל להמגלוטינציה עם טיטרים גבוהים ותגובתיות צולבת נמוכה. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך שלוש שעות אם היא מבוצעת כראוי.

בזמן ניסיון הליך זה חשוב לזכור סרום עם RDE כדי לנטרל כל מעכב לא ספציפי וקשירה לא ספציפית במהלך ההמגלוטינציה של הנגיף. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ELISA כדי לענות על שאלות נוספות לגבי תפקידם של אימונוגלובולינים ספציפיים לפתוגן בודד. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האימונולוגיה הנגיפית לקדם את ההבנה שלנו לגבי חסינות הקשורה לחיסונים בחולים בריאים ומדוכאי חיסון בקבוצות גיל שונות.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע בדיקת עיכוב המגלוטינציה כדי לכמת טיטרים של נוגדנים ספציפיים לזן שפעת בקנה מידה גדול. אל תשכח שעבודה עם אנטיגנים ויראליים, דם של בעלי חיים ודגימות סרום אנושי עלולה להיות מסוכנת ביותר וכי תמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון עבודה במעבדת BSL2 בעת ביצוע הליך זה.