Name: העשרה של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס מהמוח האנושי לאחר המוות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: למד פרוטוקול לבידוד אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיסים מרקמת מוח אנושית לאחר המוות. שיטה זו מאפשרת זיהוי ואפיון של חלבונים מקופלים שלא כהלכה במחלות נוירודגנרטיביות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים ד"ר ג'ים בורסי, אלן Levey, היחידה לנוירולוגיה של אמורי, על הערות מועילות והצעות. עבודה זו מומן בחלקו על ידי האצת שותפות רפואה המענק (U01AG046161-02), אמורי האלצהיימר של מרכז המחקר של המחלה (P50AG025688) ואת הלאומי להזדקנות הענק (R01AG053960-01) ל- N.T.S. מחקר זה גם נתמך בחלקה על ידי הגרעין Neuropathology של המענק אמורי Neuroscience NINDS הליבה מתקנים, P30NS055077.

אתיקה במשפט: לכל רקמות מוח, התקבלו האלצהיימר אמורי &#39; s מחלות מחקר במרכז (ADRC) המוח הבנק. רקמות לאחר המוות נרכשו תחת פרוטוקולים לוח סקירה מוסדיים (IRB) תקין.
 1. המגון ו Fractionation <ol><li>רקמות הבחירה הערה: קפוא רקמות לאחר המוות החזיתית מ בקרה בריאים (Ctl), באופן פתולוגי מקרים מאושרים של המודעה נבחרו מתוך אמורי ADRC המוח הבנק (n = 2). הערכה neuropathological פוסט-מורטם של הפצה פלאק עמילואיד בוצעה על פי האיחוד להקים רישום עבור אלצהיימר &#39; s המחלה למחצה כמותיים ניקוד קריטריונים 24, למרות סבך neurofibrillary פתולוגיה הוערך לפי מערכת הזמני braak. 16 <ol><li>קבל קפוא רקמת המוח לאחר המוות מ בקרה בריאים (Ctl), באופן פתולוגי לספירה מקרים מאומתים. ניצול מיכלים של קרח יבש, מלקחיים, סכין גילוח, בלו ~ 250 מ"ג חלקים של החומר האפור של כל דגימה רקמה על הפנויה tared שוקל סירות, לטפל כדי למנוע את הרקמה מפשיר. להקליט את המשקל של כל פיסת להיות הומוגני.</li>
		<li>בלו ~ 250 מ"ג של החומר האפור באמצעות מלקחיים, גילוח על-ידי בדיקה חזותית כדי לאתר את הממשק בין החומר האפור החיצוני לבין חומר לבן פנימי. להימנע חומר לבן וחשוב יותר, כל כלי דם גדולים או אזורים מדם, קרומי המוח או מאטר מעידה. לשמור את הרקמה קפוא במהלך תהליך חיתוך על ידי עובדים במהירות והצבת לעתים קרובות הסירה במשקל עם רקמת המוח לתוך מיכלים פוליסטירן עם קרח יבש</li>
		<li>רושמות את משקל מדויק של החומר האפור טוחנות מ כל חתיכה קפוא באמצעות איזון האנליטי. חישוב הנפח של מאגר מלח נמוכה (LS) (ראה טבלה 1) לצורך המגון דאונס (5 מ ל/g או 20% w/v).</li>
		<li>10 להכין מאגר מ ל LS עם 1 x מעכב פרוטאז, פוספטאז קוקטייל ולא צונן על קרח</li>
		<li>להסיר רקמות שנשקל והסירה במשקל קרח יבש והן הקוביות לחתיכות מ מ 2 x 2 בערך כמו זה מפשירה. העברת צינור מהמגן 2 מ"ל דאונס טרום מקורר על קרח</li>
		<li>הוסף 5 מ ל/g (20% w/v) מאגר מלח נמוכה כקרח (LS) עם 1 X מעכב פרוטאז, פוספטאז קוקטייל.</li>
		<li>Homogenize רקמת המוח על קרח באמצעות כ 10 קווים של סיווג גבוהות שהעקב A ו- 15 משיכות של סיווג נמוך שהעקב B.</li>
		<li>העברת homogenate כל צינור פוליפרופילן 2 mL באמצעות כוס פסטר פיפטה. תווית ברכבת התחתית עם &#8220; תאנון &#8221; (כולל Homogenate), הרקמה קייס המספר, homogenate נפח. Aliquot 0.8 מ לתוך צינור שכותרתו mL 1.5. כל homogenate עודף יכול להיות דומה aliquoted ומאוחסן ב-80 מעלות צלזיוס</li>
		<li>כל 0.8 מ ל aliquot, להוסיף 100 µL כל של 5 M NaCl ו- 10% (w/v) sarkosyl ריכוזים של 0.5 M ו- 1% w/v, בהתאמה. לערבב צינורות היטב על ידי היפוך, דגירה על קרח במשך 15 דקות צינורות בתווית עם &#34; ה-S &#34; (סה כ Homogenate-Sarkosyl) כדי לציין homogenates פועלות sarkosyl-מאגר (טבלה 1).</li>
		<li>Sonicate כל שפופרת עבור s 5 3 פולסים במהירות של 30% משרעת על קרח (העוצמה המקסימלית = 40%) באמצעות בדיקה microtip.</li> <li>לקבוע ריכוז חלבון homogenates באמצעות החומצה bicinchoninic (BCA) assay 25 שיטת. 
		הערה: ריכוז חלבון הממוצע של ה-S homogenates מוכן ב 5 מ ל LS לגרם של רקמות היא 15-20 מ"ג/מ"ל. Homogenates ניתן fractionated מיד או המאוחסנים ב- 80 ° C עד השימוש.</li>
		<li>Homogenates ה-S לדלל כדי 10 מ"ג/מ"ל באמצעות מאגר סארק כקרח (טבלה 1) עם 1 x מעכבי פרוטאז, פוספטאז.</li>
		<li>להעביר 5 מ ג חלבון (0.5 מ ל) של כל אחד homogenate ה-S לתוך 500 µL פוליקרבונט ultracentrifuge צינורות, זוג-איזון עם סארק-buffer. לטעון צינורות לתוך טרום מקורר רוטור ultracentrifuge ב 180,000 x g למשך 30 דקות ב- 4 supernatants העברה sarkosyl מסיסים מעלות צלזיוס (S1) כדי 1.5 mL צינורות ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס 
		הערה: (שטיפת אופציונלי) µL להוסיף 200 סארק-המאגר כדי ultracentrifuge צינורות המכילים שברים דטרגנט-לא מסיס (P1) ועוקרות כדורי (P1) מהחלק התחתון של הצינורות ultracentrifuge באמצעות טיפ פיפטה 200 µL.</li>
		<li>בקצרה את הדופק-ספין הפוך צינורות עבור s 2-3 (&#8804; 2,500 x g) ב- microcentrifuge כדי להעביר את החבילות (P1) ואת מאגר הצינורות 1.5 mL להלן. Resuspend כדורי לא מסיסים (P1) במאגר-סרק על ידי pipetting למעלה ולמטה כדי להבטיח בגדר מופרת.</li>
		<li>זוג-איזון, צנטריפוגה ב 180,000 x g למשך 30 דקות נוספות ב-4 מעלות צלזיוס</li>
		<li>למחוק את תגובת שיקוע שטיפת אופציונלי (S2), דגירה כדורי sarkosyl-לא מסיס (P2) ב- 50-75 µL מאגר אוריאה (טבלה 1) עם 1 x תמונה (פרוטאז, פוספטאז מעכב קוקטייל) במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי solubilize צניפה- 
		הערה: מאגר אוריאה חמים לטמפרטורת החדר לפני השימוש כדי למנוע מרחביות משקעים. ליישומים הרגישים דטרגנט, להשמיט זמנים תוססים מהמאגר אוריאה ולשקול שטיפה בגדר לא מסיסים (P2) במאגר מלח נמוכה לפני resuspending במאגר שתנן.</li>
		<li>להעביר את כדורי resuspended (P2) צינורות 0.5 mL ולהשתמש קצר (1 s) microtip sonication-משרעת 20% (העוצמה המקסימלית = 40%) כדי באופן מלא solubilize כדורי.</li>
		<li>לקבוע את ריכוזי חלבונים מסיסים sarkosyl (S1) ו- assay לא מסיסים שברים (P2) באמצעות BCA את השיטה. להשתמש שברים אלה באופן מיידי או לאחסן ב- 80 ° C עד שימוש.</li>
	</ol></li></ol> 2. Immunoblotting <ol><li>המערבי סופג הערה: סופג המערבית בוצעה על פי הנהלים שדווחה בעבר עם שינויים קלים. 5 , 10 <ol><li>40 להכין דגימות µg סה כ homogenates (ה-S), סארק מסיסים (S1), סארק-לא מסיס שברים (P2) במאגר מדגם X Laemmli מרחביות-דף 1 עם 5 מ מ TCEP pH 7. דגירה בדגימות ב 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דק</li>
		דוגמאות <li>טען ב- Bis-טריס precast 10-ובכן 4-12% מרחביות-דף ג'ל. Electrophorese-80 V על הסנטימטר הראשונה (10 דקות) ו 120 V עד לתום (60 דקות) או עד לצבוע מעקב מגיע לתחתית של הג'ל.</li>
		<li>להשתמש טריים גילוח וסכין ג'ל על פיצול-פתיחה בקלטת ג'ל טרומי. בעדינות לחתוך משם את קומבס ואת התחתון של הג'ל עם סכין גילוח טריים.</li>
		<li>Resuspend כדורי לא מסיסים (P1) 200 µl סארק-מאגר עם x 1 PIC על-ידי pipetting למעלה ולמטה.</li>
		<li>העברת קרום ניטרוצלולוזה 0.2 µm באמצעות שיטת העברה יבש על מכונת blotting (ראה טבלת חומרים).</li>
		<li>לחסום את הקרום במאגר חסימה (BB) ללא Tween 20 למשך 30 דקות, ואחריו עם BB עם 0.05% 20 Tween (BB/T) למשך 30 דקות. לאחר חסימת, לשטוף את הקרום ב- TBS/T (0.1% Tween 20) עבור 5 דקות כדי להסיר עודפי מאגר חסימה.</li>
		<li>הכן דילולים 1:1,000 של נוגדנים ראשי pT231, טאו-2 (פאן טאו), AT8 ו EEA1 ב BB/T (0.05% Tween 20).</li>
		<li>תדגור על הממברנות בפתרון נוגדן ראשוני בין לילה ב 4 ° C עם עצבנות מעגלית לשטוף את הקרום ב- TBS/T עבור 3 x 15 דק</li>
		<li>בדיקה הקרום לדילול 1:20,000 שכותרתו fluorescently ליד-IR משני הנוגדן ב- BB/T עבור 60 דקות בטמפרטורת החדר בחושך בשייקר. לשטוף את הקרום 3 x 10 דקות ב- TBS/T ו- 2 x 5 min ב- TBS.</li>
		<li>לסרוק את הקרום באמצעות אינפרא מערכת-הגל המתאימים עירור (לדוגמא 700 nm (ערוץ אדום) עבור צבע אינפרא-אדום 680 עז העכבר אנטי איג (H + L) המשנית, 800 nm (ערוץ ירוק) עבור צבע אינפרא-אדום 790 החמור נגד אינץ ארנב IgG (H + L הדמיה ) משני).</li>
		<li>משתמש בתוכנת הדמיה לכמת עוצמות האות ולבצע מדידות densitometry לפי היצרן &#39; s הוראות, הבטחת אוטומטי-רקע הגדרת מוגדר ממוצע את הרקע כולו.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+Proteins+in+Neurodegenerative+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Toxic Proteins in Neurodegenerative Disease.</a> Science. 296 (5575), 1991(1991).</li>
<li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature Medicine. 10, S10-S17 (2004).</li>
<li>Ramírez-Alvarado, M., Merkel, J. S., Regan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+exploration+of+the+influence+of+the+protein+stability+on+amyloid+fibril+formation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">A systematic exploration of the influence of the protein stability on amyloid fibril formation in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (16), 8979-8984 (2000).</li>
<li>Hamley, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Amyloid+Beta+Peptide%3A+A+Chemist%27s+Perspective.+Role+in+Alzheimer%27s+and+Fibrillization%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">The Amyloid Beta Peptide: A Chemist's Perspective. Role in Alzheimer's and Fibrillization.</a> Chem Rev. 112 (10), 5147-5192 (2012).</li>
<li>Diner, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+Properties+of+the+Small+Nuclear+Ribonucleoprotein+U1-70K+in+Alzheimer+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Aggregation Properties of the Small Nuclear Ribonucleoprotein U1-70K in Alzheimer Disease.</a> J. Biol. Chem. 289 (51), 35296-35313 (2014).</li>
<li>Gozal, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+Analysis+Reveals+Novel+Components+in+the+Detergent-Insoluble+Subproteome+in+Alzheimer%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Proteomics Analysis Reveals Novel Components in the Detergent-Insoluble Subproteome in Alzheimer's Disease.</a> J. Proteome Res. 8 (11), 5069-5079 (2009).</li>
<li>Hales, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+detergent-insoluble+brain+proteome+linked+to+amyloid+and+tau+in+Alzheimer%27s+Disease+progression%5BTitle%5D)+AND+%22PROTEOMICS%22%5BJournal%5D)">Changes in the detergent-insoluble brain proteome linked to amyloid and tau in Alzheimer's Disease progression.</a> PROTEOMICS. , (2016).</li>
<li>Julien, C., Bretteville, A., Planel, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJulien%2C+C+%22Amyloid+Proteins%3A+Methods+and+Protocols%22">Amyloid Proteins: Methods and Protocols</a>. Sigurdsson, E. M., Calero, M., Gasset, M. , Humana Press. 473-491 (2012).</li>
<li>Nizhnikov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Screening+for+Amyloid+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Proteomic Screening for Amyloid Proteins.</a> PLoS ONE. 9 (12), e116003(2014).</li>
<li>Seyfried, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+the+detergent-insoluble+brain+proteome+in+frontotemporal+lobar+degeneration+using+SILAC+internal+standards%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of the detergent-insoluble brain proteome in frontotemporal lobar degeneration using SILAC internal standards.</a> J. Proteome Res. 11 (5), 2721-2738 (2012).</li>
<li>Woltjer, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+determination+of+widespread+detergent+insolubility%2C+including+A%CE%B2+but+not+tau%2C+early+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Proteomic determination of widespread detergent insolubility, including Aβ but not tau, early in the pathogenesis of Alzheimer's disease.</a> FASEB J. , (2005).</li>
<li>Miake, H., Mizusawa, H., Iwatsubo, T., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+Characterization+of+the+Core+Structure+of+%CE%B1-Synuclein+Filaments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Biochemical Characterization of the Core Structure of α-Synuclein Filaments.</a> J. Biol. Chem. 277 (21), 19213-19219 (2002).</li>
<li>Hasegawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylated+%CE%B1-Synuclein+Is+Ubiquitinated+in+%CE%B1-Synucleinopathy+Lesions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Phosphorylated α-Synuclein Is Ubiquitinated in α-Synucleinopathy Lesions.</a> J. Biol. Chem. 277 (50), 49071-49076 (2002).</li>
<li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitinated+TDP-43+in+Frontotemporal+Lobar+Degeneration+and+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> Science. 314 (5796), 130(2006).</li>
<li>Bishof, I., Diner, I., Seyfried, N. <a target="_blank" href="http://www.fasebj.org/content/29/1_Supplement/712.3">An Intrinsically Disordered Low Complexity Domain is Required for U1-70K Self-association.</a> FASEB J. 29 (Suppl 1), (2015).</li>
<li>Braak, H., Braak, E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1759558">Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes.</a> Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).</li>
<li>Noguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Patient-derived%2C+Toxic%2C+High+Mass+Amyloid+%CE%B2-Protein+%28A%CE%B2%29+Assembly+from+Alzheimer+Disease+Brains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Patient-derived, Toxic, High Mass Amyloid β-Protein (Aβ) Assembly from Alzheimer Disease Brains.</a> J. Biol. Chem. 284 (47), 32895-32905 (2009).</li>
<li>Bai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((U1+small+nuclear+ribonucleoprotein+complex+and+RNA+splicing+alterations+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (41), 16562-16567 (2013).</li>
<li>Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+%CE%B2-Amyloid+Protein+Is+Covalently+Modified+when+Dissolved+in+Formic+Acid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's β-Amyloid Protein Is Covalently Modified when Dissolved in Formic Acid.</a> J Neurochem. 54 (6), 2050-2056 (1990).</li>
<li>Yang, L. -S., Gordon-Krajcer, W., Ksiezak-Reding, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+Released+from+Paired+Helical+Filaments+with+Formic+Acid+or+Guanidine+Is+Susceptible+to+Calpain-Mediated+Proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Tau Released from Paired Helical Filaments with Formic Acid or Guanidine Is Susceptible to Calpain-Mediated Proteolysis.</a> J Neurochem. 69 (4), 1548-1558 (1997).</li>
<li>Bai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((U1+small+nuclear+ribonucleoprotein+complex+and+RNA+splicing+alterations+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).</li>
<li>Hales, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((U1+small+nuclear+ribonucleoproteins+%28snRNPs%29+aggregate+in+Alzheimer%27s+disease+due+to+autosomal+dominant+genetic+mutations+and+trisomy+21%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">U1 small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) aggregate in Alzheimer's disease due to autosomal dominant genetic mutations and trisomy 21.</a> Mol Neurodegener. 9 (1), 15(2014).</li>
<li>Xiong, L. -W., Raymond, L. D., Hayes, S. F., Raymond, G. J., Caughey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+change%2C+aggregation+and+fibril+formation+induced+by+detergent+treatments+of+cellular+prion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Conformational change, aggregation and fibril formation induced by detergent treatments of cellular prion protein.</a> J Neurochem. 79 (3), 669-678 (2001).</li>
<li>Mirra, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Consortium+to+Establish+a+Registry+for+Alzheimer%27s+Disease+%28CERAD%29.+Part+II.+Standardization+of+the+neuropathologic+assessment+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">The Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease (CERAD). Part II. Standardization of the neuropathologic assessment of Alzheimer's disease.</a> Neurology. 41 (4), 479-486 (1991).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).</li>
<li>Guo, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+pathological+tau+conformers+from+Alzheimer%27s+brains+transmit+tau+pathology+in+nontransgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Unique pathological tau conformers from Alzheimer's brains transmit tau pathology in nontransgenic mice.</a> J. Exp. Med. 213 (12), 2635-2654 (2016).</li>
<li>Matveev, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+subfraction+of+A%CE%B2+is+responsible+for+the+high-affinity+Pittsburgh+compound+B-binding+site+in+Alzheimer%27s+disease+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">A distinct subfraction of Aβ is responsible for the high-affinity Pittsburgh compound B-binding site in Alzheimer's disease brain.</a> J Neurochem. 131 (3), 356-368 (2014).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

בזאת אנו להציג ולדון פרוטוקול דטרגנט-fractionation צעד אחר צעד מקוצר הרלוונטיים למגוון רחב של יישומים ניסיוני ועד ניתוח פרוטאומיקס מסה ספקטרומטר מבוססי חלבונים פונקציונליים misfolding מבחני אפילו השחרת המערבי. 5 , 6 , 7 , 10 מתודולוגיה זו היא אולי הכי יעיל כאשר נעשה שימוש כדי ללמוד proteinopathies ניווניות כגון אלצהיימר, ALS, מחלת הנטינגטון, פריון ומחלות של tauopathies שונים. בהשוואה לפרוטוקול ...

מחלות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר (AD), מחלת פרקינסון (PD), מחלת הנטינגטון (HD), נוירודגנרטיביות (ALS) ומחלות של פריון הקשורים קשר הדוק הן proteinopathies מאופיין על ידי הצטברות הדרגתית של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס במוח. עם ליווי קוגניטיבית לסרב. 1 , 2 תכונה פתולוגית משותפת זו הוא חשב לשחק תפקיד מרכזי אטיולוגיה, פתופיזיולוגיה של אלה מחלות ניווניות. 2 אגרגטים אלה בדרך כלל מורכבים של סיבי עמילואיד פולימריים, אשר מורכבים של חוזרות יחידות של חלבונים misfolded מפגין צלב β-מבנה. 1 , 2 , 3 , 4 . מבחינה ביוכימית, אגרגטים עמילואיד הם עמידים מאוד בפני דנטורציה כימי או תרמי ו- solubilization,3 אשר מציג אתגרים ייחודיים על טיהור שלהם, ניתוח וללמוד באמצעות טכניקות מסורתיות הביוכימי. 2 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 באופן לא מפתיע, השבר לא מסיס-אבקת חלבון הייתה המוקד של מחקרים רבים לתוך הפתופיזיולוגיה של מחלות ניווניות הקשורות ההצטברות של חלבונים misfolded. 6 , 12 , 13 , 14
טכניקות fractionation הביוכימי כבר נעזרו לעיתים קרובות כדי להעשיר את השבר דטרגנט-לא מסיס מן המוח לאחר המוות homogenates. 6 , 12 , 13 , 14 באחת השיטות הנפוצות ביותר כרוך החילוץ רציפים של רקמת homogenates עם מאגרי וחומרי ניקוי של הגדלת לכתחילה, ואחריו ultracentrifugation מחיצות שברים מסיסים ובחלקם לא מסיסים. נפוץ fractionation רציפים פרוטוקול6,14 מערבת את המגון דגימות רקמה קפוא במאגר מלח נמוכה ללא דטרגנט (האם), כדורי לא מסיסים תוצאות ואז מופקים באופן רציף עם מאגרי המכילה מלח גבוהה, חומרי ניקוי ללא יונית, סוכרוז גבוהה, דטרגנטים יוניים, ולבסוף chaotropes כמו שתנן. 6 , 14 חסרון ברור מהפרוטוקולים fractionation רציפים הוא זמן ניכר ומחויבות לעבודה הדרושה כדי להשלים אותם. כולל המגון ultracentrifugation, פרוטוקול טיפוסי fractionation חמישה צעדים יכולה לקחת כמה שעות או אפילו ימים כדי להשלים. 4 , 6 , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18 . בנוסף, אגרגטים חלבון פיפטות רבים נותרים מסיסים בסך הכל, אבל ה19,החריפה תנאים20 רוב השברים שנוצר הם בעלי ערך מוגבל. כך, המדרגות fractionation פחות מחמירים ניצול ריכוז המלח גבוה ודטרגנטים ללא יונית הם במידה רבה מיותר.
מחקרים קודמים הראו כי הנוזל יוניים לאוריל-N-sarcosine (sarkosyl) הוא מועמד מצוין עבור פרוטוקול fractionation דטרגנט מפושטת של צעד אחר צעד. 5 , 6 , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23 כמו חומר ניקוי denaturing, sarkosyl היא מחמירה מספיק כדי solubilize הרוב המכריע של חלבונים מקופלים מקורי במוח ללא solubilizing אגרגטים חלבון misfolded המורכב בטא עמילואיד (Aβ),6,11 טאו phosphorylated (pTau),6 זפת DNA מחייב חלבון 43 (TDP-43),14 אלפא-synuclein,12,13 scrapie,23 או U1 קטן הגרעין ribonucleoproteins (U1 snRNPs) כגון U1 - 70 K. 5 , 21 , 22 כמו sarkosyl הוא פחות מחמירים יותר סולפט dodecyl בכל מקום anionic נתרן דטרגנט (מרחביות), שומרת על צורות oligomeric פחות חזקים של אגרגטים חלבון misfolded שלא יכול לעמוד טיפול מרחביות. 9
בעבר, תיאר לנו פרוטוקול דטרגנט-fractionation מקוצר להשיג תוצאות להשוות מתודולוגיות fractionation רציפים יותר מפרך. 5 על-ידי השמטת את השלבים fractionation מחמירים פחות, הצלחנו לפתח פרוטוקול נתיישב fractionation צעד אחר צעד העשרה של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס מהמוח האנושי לאחר המוות. 5 פרוטוקול מפורט זה המתוארים בזאת הוא גם מתאים למגוון רחב של יישומים ניסיוני החל סופג המערבי, מבחני מבוססי ספקטרומטר מסה פרוטאומיקס חלבון פונקציונלי misfolding, צבירת זריעה. 5 , 6 , 21

<table><tbody><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז ופוספטאז, ללא EDTA (100X)</td><td></td><td></td> <td>קוקטייל מעכב פרוטאז ופוספטאז קוקטייל מעכב</td></tr><tr><td>סוניק מערכת דיסמברטור (אולטרסאונד)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>FB505110</td><td>מיקרו-טיפ אולטראסוניקטור</td></tr><tr><td>אופטימקס TLX אולטרה-צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td>361545</td><td>רוטור אולטרה-צנטריפוגה מקוררת</td></tr><tr><td>TLA120.1</td><td>בקמן קולטר</td><td>362224</td><td>רוטור אולטרה-צנטריפוגה</td></tr><tr><td>500 ul (8 x 34 מ"מ) צינורות פוליקרבונט,</td><td>צינורות אולטרה-צנטריפוגה עבים של בקמן קולטר 343776 לרוטור TLA120.1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4X SDS מאגר דגימה</td><td>תוצרת בית</td><td>תוצרת N/A</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>TCEP, pH ניטרלי</td><td>Thermo Fisher</td><td>77720</td><td>חומר הפחתה</td></tr> <tr><td>חוסם (TBS) מאגר תרמו</td><td>פישר</td><td>37542</td><td>מאגר</td></tr> <tr><td>חוסם (TBS) מאגר חוסם + 0.05% Tween 20</td><td>Thermo Fisher</td><td>37543</td><td>חוצץ חוסם ומדלל נוגדנים</td></tr><tr><td>4-12% ג'ל Bolt Bis-Tris Plus, 10 בארות</td><td>Thermo Fisher</td><td>NW04120BOX</td><td>ג'ל SDS-PAGE טרומי</td></tr><tr><td>MES SDS מאגר ריצה (20X)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>B0002</td><td>SDS-PAGE מאגר רץ</td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosine מלח נתרן (סרקוזיל)</td> <td>Sigma </td><td>חומר ניקוי</td>Aldrich <td>L5777-50G</td></tr><tr><td>נוגדן נגד Tau-2 (פאן טאו)</td> נוגדנים <td>Chemicon</td><td>MAB375</td><td>נוגדנים</td></tr><tr><td>נגד פוספו-תראונין 231 נוגדן טאו</td><td>Millipore</td><td>MAB5450</td><td>נוגדנים</td></tr><tr><td>אנטי-פוספו-סרואין 202 ותראונין 205 נוגדן טאו (AT8)</td> <td>נוגדנים</td> <td>Thermo Fisher</td><td>MN1020</td></tr><tr><td>נוגדנים אנטי-אנדוזום מוקדם 1 (EEA1)</td><td>abcam</td><td>נוגדנים</td> <td>ab2900</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 680 עז נגד עכבר IgG (H+L) נוגדן משני</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21058</td><td>נוגדנים</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 790 חמור נגד ארנב IgG (H+L) נוגדן משני</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11374</td><td>נוגדנים</td></tr><tr><td>iBlot2 Dry Blotting System</td><td>Thermo Fisher</td><td>IB21001</td><td>העברת ג'ל</td></tr><tr><td>iBlot2 Transfer Stacks, ניטרוצלולוז, מיני</td><td>תרמו פישר</td><td>IB23002</td><td>העברת ג'ל</td></tr></tbody></table>

העשרה של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס מהמוח האנושי לאחר המוות

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול מקוצרת fractionation צעד אחר צעד העשרה של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס מהמוח האנושי לאחר המוות. ? הנוזל יוניים לאוריל-N-sarcosine (sarkosyl) solubilizes ביעילות באופן מקורי מקופל חלבונים ברקמת המוח המאפשר את העשרת של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס מתוך מגוון רחב של proteinopathies ניווניות, כגון מחלת אלצהיימר (AD), מחלת פרקינסון, נוירודגנרטיביות ומחלות פריון. לשליטת האדם ורקמות המוח לאחר המוות לספירה היו הומוגני, sedimented על ידי ultracentrifugation בנוכחות sarkosyl להעשיר אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס כולל פיפטות phosphorylated טאו, מרכיב מרכזי neurofibrillary קשרים לספירה. סופג המערב הפגינו המסיסות דיפרנציאלית של טאו phosphorylated צבור, החלבון דטרגנט מסיסים, מוקדם 1 אנטיגן אנדוזום (EEA1) ב AD המוח ובקרה. ניתוח פרוטיאומיה מבנית גם גילה העשרה של β-עמילואיד (Aβ), טאו, snRNP70 (U1 - 70 K), ו אפוליפופרוטאין E (ספקיות) ב sarkosyl-לא מסיס שברים של המוח לספירה בהשוואה לאלו של שליטה, בקנה אחד עם אסטרטגיות fractionation רקמות הקודם . לפיכך, פרוטוקול העשרה פשוטה זה הינו אידיאלי עבור מגוון רחב של יישומים ניסיוני החל סופג המערבי חלבון פונקציונלי צבירת שיתוף מבחני פרוטאומיקס מבוססי ספקטרומטר מסה.

פרוטוקול sarkosyl צעד אחר צעד מקוצרת-fractionation שימש להעשיר אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס של שליטה והמוח לספירה לאחר המוות (איור 1). חלבונים מן ה-S, S1, S2 ו- P2 שברים שנפתרו על ידי עמודים מרחביות, קבוע למשך 15 דקות Coomassie מאגר מקבע כחול ולאחריו מכתים עדין עם מאגר מוכתמים G-250 Coomassie כחול מבריק. הצעד resuspension הוא אופציונלי, מכיוון שהיו רמות לא לגילוי של חלבון השבר S2 (ראה 1.1.14). תספיג ניתוח (איור 2 א</stro...

פרוטוקול fractionation מקוצר העשרה של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס מהמוח האנושי לאחר המוות מתואר.

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

המטרה הכללית של פרוטוקול הפרקציה זה היא להעשיר אגרגטים של חלבונים שאינם ממיסים בדטרגנט מרקמת מוח אנושית לאחר המוות. לפיכך, שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הניורודגנרציה, כגון זיהוי ואפיון של אגרגטים של חלבונים מקומטים במחלה. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא ההעשרה והבידוד המהירים של אגרגטים של חלבונים שאינם ממיסים בדטרגנט מרקמת מוח בתוך מסגרת זמן קצרה.טראם נגוין, טכנאי מהמעבדה שלי, ידגים את ההליך הזה. השג רקמות מוח קפואות לאחר המוות מקבוצת ביקורת בריאה וממקרים עם אבחנה פתולוגית של AD. השתמש בפינצטה ובלהב תער כדי להוציא חלקים של כ-250 מיליגרם של חומר אפור מכל דגימת רקמה. אפשר למקטע המוח להפשיר במשך דקה אחת.כעת, חתכו חלק מרקמה לקוביות בגודל של כ-2 mm³ בזמן שהיא מפשירה. העבירו לשפופרת הומוגניזציה מסוג Dounce בנפח 2 mL שקוללה מראש על קרח. זכרו להימנע מחומר לבן ומכל כלי דם גדולים.עבדו במהירות והניחו את הרקמה על כלי שקילה חד-פעמיים שכוילו (TARE). הקפידו למנוע את הפשרת הרקמה על ידי העברה תכופה של כלי השקילה עם רקמת המוח למכלי פוליסטירן עם קרח יבש. לאחר חיתוך ושקילה של כל חלקי הרקמה הנדרשים, הוציאו כלי שקילה המכיל חלק מרקמה מהקרח היבש.בשלב הבא, הוסיפו חמישה מיליליטר של באפר דל-מלח קר מאוד עם תערובת מעכבי פרוטאז ופוספטאז לכל גרם רקמה, והומוגניזו על קרח באמצעות כ-10 תנועות של פ

enrichment-detergent-insoluble-protein-aggregates-from-human

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

ההטרוגניות הסלולר של רקמת המוח מהווה מגבלה משמעותית לחקר סימונים epigenetic ב הכרומטין כי רוב מבחני חוסר ברזולוציה תא בודד. נוירונים הם בדרך כלל התערבבו עם גליה ולמוסדות אחרים ללא כוונת תאים עצביים. אנו מספקים פרוטוקול לחלץ ולאסוף גרעינים העצבית מהמוח האנושי.

גרעינים בידוד עצבי שלאחר המוות של רקמת מוח האדם

אנו מתארים טכניקה להכנת הבהיר homogenates קליפת המוח האנושי, הפרדת חלבונים על ידי SDS-PAGE, אחזור אנטיגן ו immunoblotting עם נוגדן ל הפפטיד Aβ. שימוש בפרוטוקול זה, אנו באופן עקבי לזהות Aβ monomeric ו multimeric ברקמת קליפת המוח של בני אדם עם פתולוגיה אלצהיימר.

איתור SDS-PAGE/Immunoblot של Multimers Aβ ברקמה קליפתיים האדם Homogenates באמצעות Antigen-epitope אחזור

זן חדש של חלבון פריון תאי...

בידוד של oligomers PRP המסיס ובלתי מסיס במוח האנושי הרגיל

סרטון זה מדגים את הפרוטוקול לבידוד סיבי עמילואיד מתמצית רקמת מוח של עכבר באמצעות צנטריפוגה של שיפוע צפיפות ועיכול של חלבונים שאינם עמילואידים.

בידוד סיבי עמילואיד מתמצית רקמת המוח

סרטון זה מסביר את תהליך הבידוד וההעשרה של צברי חלבונים בלתי מסיסים בדטרגנטים מרקמת מוח אנושית קפואה לאחר המוות. הוא מדגים שלבים מרכזיים, כולל הומוגניזציה, טיפול בחומרי ניקוי, סוניקציה ואולטרה-צנטריפוגה כדי להפריד ולטהר את האגרגטים הבלתי מסיסים. השלב האחרון כולל מסיסה של האגרגטים במאגר אוריאה לניתוח נוסף.

בידוד צברי חלבונים בלתי מסיסים בדטרגנט מרקמת מוח אנושית לאחר המוות

פרוטוקול מיצוי חלבון נפוץ באמצעות מאגר האוריאה / thiourea / SDS לרקמת מוח אדם ועכברים מאפשר indentification של חלבונים על ידי 2D-DIGE והאפיון הבא שלהם על ידי immunoblotting 2DE המיני. שיטה זו מאפשרת לאדם להשיג תוצאות יותר לשחזור ואמינים מביופסיות אדם ומודלים ניסיוניים.

חלבון נגזר מוח קונסנסוס, חליצה ​​פרוטוקול לחקר האדם וMurine המוח Proteome שימוש בשתי 2D-DIGE ומיני 2DE immunoblotting

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד של אלפא-סינוקלאין (α-syn) שהופך ליותר ויותר בלתי מסיס/מצטבר מרקמת מוח אנושית לאחר המוות. באמצעות ניצול חוצצים עם חוזק חומר ניקוי הולך וגובר וטכניקות אולטרה-צנטריפוגה במהירות גבוהה, ניתן לבחון את המאפיינים המשתנים של צבירת α-syn ברקמות חולה ולא חולות.

הפקה רציפה של המסיס ובלתי מסיס אלפא-סינוקלאין ממוח פרקינסון

אנו מדווחים על בדיקה פשוטה, יעילה בזמן וספקטרוסקופיה מבוססת תפוקה גבוהה לכימות סיבי אקטין בדגימות ביולוגיות אקס ויוו מרקמות המוח של מכרסמים ונבדקים אנושיים.

בדיקה מבוססת ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית חסכונית בזמן להערכת מצב פולמור Actin במכרסמים ורקמות מוח אנושיות

שיטת טיהור ביוכימית זו עם ניתוח פרוטאומי מבוסס ספקטרומטריית מסה מאפשרת אפיון חזק של ליבות פיבריל עמילואידיות, מה שעשוי להאיץ את זיהוי המטרות למניעת מחלת אלצהיימר.

טיהור ביוכימי ואפיון פרוטאומי של ליבות פיבריל עמילואידיות מהמוח

מחקר זה מתאר שיטות ניסוי לאפיון ביוכימי של GFAP והמוטציות הגורמות למחלות, תוך התמקדות בהרכבת פילמנט, הצבירה ושינוי פוסט-תרגום. נבדקו בחלבוני GFAP טהור גבוה, וחשפו תובנות לגבי מנגנוני מחלת אלכסנדר שעשויים לספק מסגרת לחקר מטרות טיפוליות פוטנציאליות ולהבנת מוטציות GFAP והפרעות נלוות.

גישות ניסיוניות לניתוח ביוכימי של חלבון חומצי סיבי גליאלי ושל וריאנטים הקשורים למחלה

למד פרוטוקול לבידוד אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיסים מרקמת מוח אנושית לאחר המוות. שיטה זו מאפשרת זיהוי ואפיון של חלבונים מקופלים שלא כהלכה במחלות נוירודגנרטיביות.

העשרה של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס מהמוח האנושי לאחר המוות

גלה סרטונים נוספים