מיפוי רחב של הגנום של אינטראקציות DNA-חלבון עם CHEC-Seq ב Saccharomyces cerevisiae

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור מפות כלל-גנומיות של אינטראקציות חלבון-DNA באתרן ברזולוציה גבוהה ורקע נמוך, ללא צורך בקישור צולב של פורמלדהיד, מסיסות כרומטין או נוגדנים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום השעתוק, כגון היכן גורמים רגולטוריים שונים קשורים לכרומטין, ביחס לאזורי ויסות גנים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת מפות קשירה גנומיות ברזולוציה גבוהה עם רקע זניח, ונמנעת ממגבלות הקשורות לפרוטוקולי ChEC-seq סטנדרטיים.

מי שידגים את ההליך יהיה סבסטיאן גרונברג, עמיתי מהמרכז לחקר הסרטן ע"ש פרד האצ'ינסון. בשעות אחר הצהריים או הערב של היום שלפני הניסוי, התחל תרבית מוקדמת של זן השימוש הניסיוני. יש לחסן שלושה מיליליטר של פפטון דקסטרוז משומש, או מדיום סלקטיבי מתאים עם מושבה אחת של הזן, הנושא את הגורם המתויג MNase.

דגרו על תרבית זו למשך הלילה בחממת שייקר של 30 מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, יש לדלל את תרבית הלילה ל-50 מיליליטר של צפיפות בינונית עד אופטית ב-600 ננומטר של 0.2 עד 0.3. דגרו את התרבית בחממת השייקר עד שהיא מגיעה לצפיפות אופטית של 600 ננומטר של 0.5 עד 0.7.

הכן את הכמות הדרושה של תוספי Buffer A בתוספת תוספים, ושמור אותה בטמפרטורת החדר במהלך ההליך. הכן צינורות מיקרופוגה לאיסוף דגימות. עבור כל גורם חדש שנותח, אספו דגימות ללא תוספת סידן, והוסיפו 30 שניות, דקה, 2.5 דקות, 5 דקות ו-10 דקות לאחר הוספת הסידן.

לכל צינור הוסף 90 מיקרוליטר של תמיסת עצירה, ו -10 מיקרוליטר של 10% SDS. כאשר התרבית הגיעה לצפיפות אופטית ב-600 ננומטר של 0.5 עד 0.7, שפכו את התרבית לצינור חרוטי של 50 מיליליטר, וצנטריפוגה ב-1,500 פעמים גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. הסירו את הסופרנטנט, השעו מחדש את התאים ביסודיות במיליליטר אחד של בופר A, והעבירו את התאים המרחפים לצינור מיקרופוגה.

גלולה את התאים התלויים במיקרופוגה ב -1, 500 פעמים גרם למשך 30 שניות בטמפרטורת החדר. שאפו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את התאים ביסודיות במיליליטר אחד של מאגר A על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. גלולה את התאים התלויים ב -1, 500 פעמים גרם למשך 30 שניות בטמפרטורת החדר.

הסר את הסופרנטנט, השהה מחדש את התאים במיליליטר אחד של מאגר A, וצנטריפוגה שוב. לאחר הסרת הסופרנטנט, השעו היטב את התאים ב-570 מיקרוליטר של בופר A.הוסיפו 30 מיקרוליטר של 2% דיגיטונין כדי להקל על חדירות התאים, והפכו לערבוב. לחדור את התאים בגוש חום בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

פיפטה את התגובה למעלה ולמטה כדי להבטיח פיזור אחיד של התאים. כבקרה שלילית, העבירו 100 מיקרוליטר של תאים חדירים לצינור מיקרופוגה המכיל תמיסת עצירה ו-SDS, ומערבולת קצרה לערבוב. לפני תחילת מסלול הזמן זה קריטי שיהיו צינורות תמיסת העצירה, הפיפטה, קצות הפיפטות וטיימר ליד גושי החום כדי שניתן יהיה לאסוף את נקודות הזמן המוקדמות ביעילות.

כדי להתחיל את מהלך הזמן, הוסף 1.1 מיקרוליטר של סידן כלורי מולארי אחד לתאים החדירים כדי להפעיל MNase, והפוך מספר פעמים במהירות כדי לערבב. החזר מיד את התגובה המעורבת ל -30 מעלות צלזיוס והפעל טיימר. בכל נקודת זמן שיש לאסוף, פיפטה את התגובה למעלה ולמטה כדי להבטיח פיזור אחיד של תאים, ולאחר מכן הסר 100 מיקרוליטר של תאים חדירים לצינור מיקרופוגה המכיל תמיסת עצירה ו-SDS.

מערבולת קצרה לערבב. לאחר איסוף כל נקודות הזמן, הוסף ארבעה מיקרוליטר של 20 מיליגרם למיליליטר פרוטאינאז K לכל דגימה. מערבולת קצרה לערבב, ודגירה בחום של 55 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

הוסף 200 מיקרוליטר פנול: כלורופורם: אלכוהול איזואמיל לכל דגימה, מערבולת נמרצת לערבוב וצנטריפוגה במהירות מקסימלית למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. הסר את השלב המימי לצינור חדש. הוסף 30 מיקרוגרם גליקוגן, ו -500 מיליליטר של 100% אתנול.

מערבולת נמרצת לערבב, ומשקעים על קרח יבש למשך 10 דקות, או עד שהתמיסה צמיגה. גלולה את ה- DNA המשקע על ידי צנטריפוגה במהירות מרבית, וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. רוקנים את הסופרנטנט ושוטפים כל כדור עם מיליליטר אחד של טמפרטורת החדר 70% אתנול.

רוקנים את האתנול ומסירים את השארית על ידי היפוך, והקשה עדינה על הצינורות על מגבת נייר. סובב בקצרה את הדגימות באמצעות צנטריפוגה על ספסל, ולאחר מכן השתמש בפיפטה כדי להסיר שאריות אטנול, תוך הקפדה לא להפריע לגלולה. יבש את הכדורים באוויר בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

בזמן שכדורי ה-DNA מתייבשים, הכינו תערובת מאסטר של Tris buffer ו-RNase A להשעיית הכדורים לאחר ייבושם, ומערבולת לערבוב. הוסף 30 מיקרוליטר של תמיסת RNase A לכל כדור DNA מיובש, מערבולת לערבוב ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לעיכול RNa. לאחר 20 דקות מערבבים מיקרוליטר אחד של צבע טעינת DNA 6X עם חמישה מיקרוליטר מכל דגימה, ופועלים על ג'ל אגרוז 1.5% ב-120 וולט למשך 40 דקות.

התחל את הליך בחירת הגודל על ידי הוספת 75 מיקרוליטר של חרוזי SPRI בתמיסת פוליאתילן גליקול. פיפטה למעלה ולמטה 10 פעמים כדי לערבב את החרוזים ותערובת ה- DNA, ולאחר מכן לדגור בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. במהלך הדגירה של חרוזי SPRI, הכינו צינורות מיקרופוגה המכילים 96 מיקרוליטר של 10 מילי-מולרי Tris pH 8.0, וארבעה מיקרוליטרים של חמישה נתרן כלורי מולרי לכל דגימה.

הניחו את הצינורות המכילים את החרוזים ותערובת הדנ"א במדף מגנטי למשך שתי דקות כדי לאסוף חרוזים בצד הצינור, ואז העבירו כל סופרנטנט לצינור חדש המכיל טריס ונתרן כלורי. הוסף 200 מיקרוליטר של פנול: כלורופורם: אלכוהול איזואמיל לכל דגימה, מערבולת לערבוב וצנטריפוגה במהירות מקסימלית בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. הסר כל שלב מימי לצינור חדש, הוסף 30 מיקרוגרם גליקוגן ו -500 מיקרוליטר של 100% אתנול.

זרז DNA על קרח יבש למשך 10 דקות, או עד שהתמיסה צמיגה. גלולה את ה- DNA המשקע על ידי צנטריפוגה במהירות מרבית וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. שפכו את הסופרנטנט ושטפו כל כדור עם מיליליטר אחד של אתנול 70%.

שפכו את האתנול, הסירו את השארית על ידי היפוך והקשה עדינה על הצינורות על מגבת נייר. סובב בקצרה את הדגימות באמצעות צנטריפוגה על ספסל, והשתמש בפיפטה כדי להסיר שאריות אתנול, תוך הקפדה לא להפריע לגלולה. יבש את הכדורים באוויר בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

השעו מחדש כל כדור מיובש ב-25 מיקרוליטר של Tris pH 8. קבע את הריכוז של כל דגימה באמצעות מבחן רגישות גבוהה. אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז של DNA מניתוח מחשוף אנדוגני של כרומטין של Reb1, גורם רגולטורי כללי הקושר אזורים מדוללי נוקלאוזום, חושף עלייה תלוית סידן בפיצול ה-DNA לאורך זמן כפי שמצוין על ידי מריחה, ובסופו של דבר עיכול מלא של DNA גנומי.

הדמיה של קצוות שברים מניסוי ריצוף מחשוף אנדוגני של כרומטין Reb1 חושפת העשרה חזקה של Reb1 על הרקע, שמקורה בזן MNase החופשי לאחר 30 שניות של טיפול בסידן. באופן דומה, מחשוף DNA משמעותי נצפה על ידי מיזוג של תת-היחידה המתווכת Med8 עם MNase, אך לא מונע MNase חופשי על ידי מקדם Med8 דקה לאחר הוספת סידן. כדי להשוות את נתוני ריצוף המחשוף האנדוגני של כרומטין Reb1 לנתוני ריצוף חיסוני של כרומטין ותפוקה גבוהה, 1,992 שיאי Reb1 שנקבעו על ידי השיטה האורגנית היו מרוכזים במוטיב, ונקבעה ספירת קצה השבר הממוצעת בכל מיקום בסיס בחלון של 100 זוגות בסיסים סביב נקודת האמצע של המוטיב .

אסימטריה ומחשוף בולטים נצפו כאשר רוב קצוות השברים המשוחררים של Reb1-MNase מופו לצד במעלה הזרם של המוטיב לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו ביום עבודה מלא אחד, אם היא מבוצעת כראוי. כאשר מנסים הליך זה חשוב לזכור להגביל את מספר הדגימות שנבדקו במקביל, כדי להבטיח זמני פיפטינג וטיפול מדויקים.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום השעתוק, לראשונה, לאפיין באופן חד משמעי את הקשר הגנומי של קומפלקס חלבון בגודל מגה-דלטון שאינו קושר DNA בשמרים. לאחר צפייה בסרטון זה, אמור להיות לכם מושג טוב כיצד לבצע את שיטת ChEC-Seq למיפוי כלל הגנום של אתרי קשירת חלבונים בגנום השמרים המתהווה.