Name: מיפוי רחב של הגנום של אינטראקציות DNA-חלבון עם CHEC-Seq ב Saccharomyces cerevisiae (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: למדו את שיטת ChEC-seq למיפוי אינטראקציות DNA-חלבון ברזולוציה גבוהה ב-Saccharomyces cerevisiae. טכניקה זו מספקת מפות קישור גנומיות עם רקע זניח ללא צלב קפורמלדהיד.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים למוסטפה סאלח ולג&#39;יי טוריגני על קריאה ביקורתית של כתב היד וסטיבן האן וסטיבן הניקוף על הדרכה ותמיכה במהלך הפיתוח של CHEC-seq ויישומה למתווך המתווך. SG נתמך על ידי מענקים NIH R01GM053451 ו R01GM075114 ו GEZ נתמך על ידי קרנות ההפעלה של אוניברסיטת אינדיאנה.

1. הדור של זנים שמרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור זן שמרים הנושאת את גורם הריבית מתויג עם MNase. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PCR להגביר את קלטת תיוג MNase מן הרצוי וקטור ( טבלה 1 ) באמצעות תערובת התגובה שצוין ( טבלה 2 ) ותנאי רכיבה ( טבלה 3 ). מערבבים 5 μL של התגובה PCR ו 1 μL של 6X DNA לטעון צבע. הפעל כל aliquot PCR על 0.8% agarose ג&#39;ל ב 120 V במשך 40 דקות. גודל המוצר הצפוי הוא ~ 2.3 kb. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את קלטת תיוג מוגבר לתוך זן של בחירה באמצעות שינוי סטנדרטי ליתיום אצטט 22 ולבצע הבחירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אמת את האינטגרציה הנכונה של קלטת התיוג עם המושבה PCR. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את תערובת התגובה שצוין ( טבלה 4 ) עבור מספר המושבות להיות מוקרן. שמור על הקרח עד הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר חלק מכל מושבה להיות tesTed לתוך החלק התחתון של צינור PCR באמצעות קיסם קיסרי או קצה pipet. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוגל המושבות הרים ב כוח גבוה במשך 1 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μL של תערובת PCR ( טבלה 4 ) לכל מושבה microwaved ו pipet מעלה ומטה כדי לערבב. בצע את ה- PCR באמצעות תנאי האופניים שצוין ( טבלה 5 ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את μL 50 של תגובה PCR ו 10 μL של 6X DNA לטעון צבע ישירות בצינור כל PCR. הפעל 10 μL של כל מדגם על ג&#39;ל agarose 1% ב 120 V במשך 40 דקות. גודל המוצר הצפוי הוא ~ 700 bp. הערה: אם תרצה, לאמת ביטוי מתאים של חלבון היתוך MNase באמצעות סופג המערבי. A ~ 20.6 קילודלטון שינוי המשקל המולקולרי של חלבון מתויג צפוי. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת זן MNase חינם על ידי שיבוט מבוסס הומולוגיה של היזם של הגן של עניין לתוך pGZ136 (טבלה 1) ואת השינוי ואת הבחירה כמו בשלב 1.1.2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלטרנטיביVely, להרכיב את היזם של הגן של עניין ו 3xFLAG-MNase-SV40 NLS לתוך וקטור פלסמיד, להפוך ולבחור כמו בשלב 1.1.2, ולהגדיל את הלחץ במצב סלקטיבי המתאים לתחזוקה של הפלסמיד. </li></ol></li></ol> 2. ChEC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצהריים / ערב של היום לפני הניסוי ChEC, לחסן 3 מ&quot;ל שמרים- peptone-dextrose (YPD) או בינוני סלקטיבי המתאים עם מושבה אחת של זן הנושא את MNase- מתויג גורם. דגירה זו תרבות לילה (180 סל&quot;ד רועד, 30 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בבוקר של יום הניסוי ChEC, לדלל את התרבות לילה לתוך 50 מ&quot;ל של מדיום לצפיפות אופטית ב 600 ננומטר (OD 600 ) של 0.2-0.3. דגירה זו תרבות (180 סל&quot;ד רועד, 30 מעלות צלזיוס) עד שהוא מגיע OD 600 של 0.5-0.7. כאשר התרבות מתקרב OD 600 מתאים, להגדיר בלוק חום או אמבט מים ל 30 מעלות צלזיוס ולהתחיל להפשיר המאגר תוספים ( Ta6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 5 מ&quot;ל של המאגר תוספים פלוס ( טבלה 6 ) לכל תרבות. שמור על המאגר ב RT במהלך ההליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צינורות microfuge המכיל 90 μL של פתרון להפסיק ( טבלה 7 ) ו 10 μL של 10% SDS עבור כל נקודת זמן כדי לאסוף. עבור כל גורם חדש ניתח, לקחת דוגמאות ב 0 s, 30 s, 1 דקות, 2.5 דקות, 5 דקות, ו 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות למזוג לתוך צינור חרוטי 50 מ&quot;ל ו צנטריפוגות ב 1500 xg וטמפרטורת החדר (RT) במשך 1 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים resuspend ביסודיות 1 מ&quot;ל של מאגר A ולהעביר את התאים resuspended לצינור microfuge. גלולה resuspended תאים microfuge ב 1500 xg ו RT במשך 30 s. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant ו resuspend ביסודיות תאים 1 מ&quot;ל של הצפת על ידי pipetting למעלה ולמטה. גלולה resuspended תאים microfuge ב 1500 xg ו RT במשך 30 s. חזור על שלב זה פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים resuspend ביסודיות μL 570 של מאגר א הוסף 30 μL של digitonin 2%(0.1% ריכוז סופי) כדי לאפשר permeabilization של התאים, וכן להפוך לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Permeabilize בלוק חום או אמבט מים ב 30 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet התגובה למעלה ולמטה כדי להבטיח הפצה אפילו של תאים. הסר aliquot 100 μL של תאים permeabilized כמו שליטה שלילית לצינור microfuge המכיל פתרון להפסיק ו SDS (שלב 2.4) ו מערבולת בקצרה לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1.1 μL של 1 M CaCl 2 (2 מ&quot;מ ריכוז סופי) לתאים permeabilized להפעיל MNase ולהפוך כמה פעמים במהירות או מערבולת בקצרה לערבב. מיד להחזיר את התגובה המעורבת ב 30 מעלות צלזיוס ולהתחיל טיימר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכל נקודת זמן כדי לאסוף, pipet התגובה מעלה ומטה כדי להבטיח הפצה אפילו של תאים, ולאחר מכן להסיר aliquot 100 μL של תאים permeabilized לצינור microfuge המכיל פתרון לעצור SDS ו מערבולת בקצרה לערבב. עבור כל גורם חדש ניתח, לקחת 0 (לא הוסיף CaCl 2 ), 30 s, 1 דקות, 2.5 דקות, 5 דקות ו 10 דקות נקודות זמן. הערה: ניסויים ChEC עם גורמים לדקלם במהירות DNA ב 30 מעלות צלזיוס יכול להתבצע בטמפרטורות נמוכות יותר להאט MNase מחשוף קינטיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כל נקודות הזמן נאספו, להוסיף 4 μL של 20 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​proteinase K לכל מדגם, מערבולת בקצרה לערבב, ו דגירה על 55 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μL של 25: 24: 1 פנול: כלורופורם: אלכוהול isoamyl על כל מדגם, מערבולת במרץ לערבב, צנטריפוגה במהירות מקסימלית RT ב microfuge למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר כל שלב מימית (~ 150 μL) לצינור חדש. הוסף 30 מיקרוגרם של גליקוגן 500 μL של אתנול 100%. וורטקס במרץ לערבב ו להאיץ על קרח יבש במשך 10 דקות או עד הפתרון הוא צמיג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה דנ&quot;א זירז במהירות מקסימלית ו 4 מעלות צלזיוס microfuge למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Supernatants למזוג ולשטוף כדורי עם 1 מ&quot;ל של אתנול RT 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוריד אתנול, הסרת שאר על ידי הפיכת אדבק בעדינות בצינורות על מגבת נייר. דגימות ספין בקצרה באמצעות צנטריפוגה benchtop ולהשתמש פיפטה כדי להסיר אתנול שיורית, נזהר לא להפריע גלולה. אוויר יבש כדורי עבור ב RT במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד כדורי ייבוש, לעשות תערובת אב resuspend כדורי מיובשים ב 29 μL של Tris, pH 8.0 + 1 μL של 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​RNase כל אחד. Digest RNA ב 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 1 μL של 6X DNA לטעון צבע עם 5 μL של כל מדגם ולהפעיל על ג&#39;ל agarose 1.5% ב 120 V במשך 40 דקות. </li></ol> 3. בחירת גודל הערה: המטרה של בחירת גודל היא להסיר שברי multobase של DNA גנומי מן המדגם להיות רצף ולהעשיר שברי ~ 150 bp (בערך בגודל של DNA גרעיני) או קטן יותר. ב נתונים רצף, שברי &lt;400 BP מועשרים, עם שיא ראוי לציון סביב בגודל של DNA נוקלאוזומלי (~ 150 BP) ו שיא או הפצה רחבה של שברי subnucleosalal. &lt;Ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל מדגם, להוסיף 75 μL של שלב מוצק immobilization (SPRI) חרוזים ב פוליאתילן גליקול (PEG) פתרון 23 ו pipet למעלה ולמטה 10 פעמים לערבב. דגירה החרוז: תערובת DNA ב RT במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדגירה חרוז SPRI, להכין צינורות microfuge המכיל 96 μL של 10 מ&quot;מ טריס, pH 8.0 ו 4 μL של 5 Na NaCl עבור כל מדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צינורות במעמד מגנטי לאסוף חרוזים בצד הצינור. אפשר את החרוזים לאסוף בצד של הצינור במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים כל supernatant לצינור חדש המכיל Tris ו NaCl (שלב 3.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μL של 25: 24: 1 פנול: כלורופורם: אלכוהול isoamyl על כל מדגם, מערבולת לערבב, ו צנטריפוגה במהירות מקסימלית RT ב microfuge למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר כל שלב מימית צינור חדש. הוסף 30 מיקרוגרם של גליקוגן 500 μL של אתנול 100%. לזרז DNA על קרח יבש במשך 10 דקות או עד הפתרון הוא צמיג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pellet preciדנ&quot;א pitated במהירות מקסימלית ו 4 מעלות צלזיוס microfuge למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Supernatants למזוג ולשטוף כדורי עם 1 מ&quot;ל של 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתנול למזוג, להסיר את שארית ידי היפוך בעדינות הקשה על צינורות על מגבת נייר. דגימות ספין בקצרה באמצעות צנטריפוגה benchtop ולהשתמש פיפטה כדי להסיר אתנול שיורית, נזהר לא להפריע גלולה. אוויר יבש כדורי עבור ב RT במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולות מיובשות μL 25 של Tris, pH 8.0. קביעת ריכוז המדגם באמצעות assay רגישות גבוהה. עבור ניסויים TF CHEC, 10-100 ng DNA הוא שגרתי התאושש לאחר בחירת גודל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ספריות רצף. פרוטוקולי הכנה לספריה שאינם מסתמכים על בחירת גודל, כפי שתואר לעיל 24 , רצוי לאפשר רצף של מגוון גדול של גדלים שבר (25-500 bp). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספריות רצף במצב משויך סוף. מינימום של 25 בסיסים של רצף על כל קצה נדרש קריאה באיכות גבוההמיפוי. בין 1 ל 2 מיליון קורא מספק כיסוי מספיק עבור מדגם ChEC. הערה: ניתוח נתונים ChEC-seq הוא הליך מורכב מעבר להיקף של מאמר זה. מידע מפורט על ניתוח נתונים ניתן למצוא בפרסומים קודמים 1 , 21 , ואת סקריפטים מותאמים אישית המשמשים לניתוח זמינים ב GitHub (https://github.com/zentnerlab/chec-seq). HOMER 25 (http://homer.salk.edu) יכול לשמש גם עבור ניתוח שורת הפקודה של נתונים ChEC-seq. </li></ol>

<ol><li>Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChEC-seq+kinetics+discriminates+transcription+factor+binding+sites+by+DNA+sequence+and+shape+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo.</a> Nat Commun. 6, 8733(2015).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Dynamics+of+Enhanceosome+Assembly+in+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Dynamics of Enhanceosome Assembly in Embryonic Stem Cells.</a> Cell. 156 (6), 1274-1285 (2014).</li>
<li>Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+expressed+loci+are+vulnerable+to+misleading+ChIP+localization+of+multiple+unrelated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110 (46), 18602-18607 (2013).</li>
<li>Park, D., Lee, Y., Bhupindersingh, G., Iyer, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+Misinterpretable+ChIP-seq+Bias+in+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Widespread Misinterpretable ChIP-seq Bias in Yeast.</a> PLoS ONE. 8 (12), 83506(2013).</li>
<li>Jain, D., Baldi, S., Zabel, A., Straub, T., Becker, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+promoters+give+rise+to+false+positive+%27Phantom+Peaks%27+in+ChIP-seq+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Active promoters give rise to false positive 'Phantom Peaks' in ChIP-seq experiments.</a> Nucleic Acids Res. , (2015).</li>
<li>Krebs, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+transcription+factor+binding+map+accuracy+utilizing+knockout-mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Optimization of transcription factor binding map accuracy utilizing knockout-mouse models.</a> Nucleic Acids Res. 42 (21), 13051-13060 (2014).</li>
<li>Paul, E., Zhu, Z. I., Landsman, D., Morse, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Association+of+Mediator+and+RNA+Polymerase+II+in+Wild-Type+and+Mediator+Mutant+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Association of Mediator and RNA Polymerase II in Wild-Type and Mediator Mutant Yeast.</a> Mol Cell Biol. 35 (1), 331-342 (2015).</li>
<li>Worsley Hunt, R., Wasserman, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-targeted+transcription+factors+motifs+are+a+systemic+component+of+ChIP-seq+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Non-targeted transcription factors motifs are a systemic component of ChIP-seq datasets.</a> Genome Biol. 15 (7), 412(2014).</li>
<li>Vega, V. B., Cheung, E., Palanisamy, N., Sung, W. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inherent+Signals+in+Sequencing-Based+Chromatin-ImmunoPrecipitation+Control+Libraries%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Inherent Signals in Sequencing-Based Chromatin-ImmunoPrecipitation Control Libraries.</a> PLoS ONE. 4 (4), 5241(2009).</li>
<li>Teytelman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Chromatin+Structures+on+DNA+Processing+for+Genomic+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Impact of Chromatin Structures on DNA Processing for Genomic Analyses.</a> PLoS ONE. 4 (8), 6700(2009).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Genome-wide+Protein-DNA+Interactions+Detected+at+Single-Nucleotide+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Genome-wide Protein-DNA Interactions Detected at Single-Nucleotide Resolution.</a> Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).</li>
<li>He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-nexus+enables+improved+detection+of+in+vivo+transcription+factor+binding+footprints%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints.</a> Nat Biotech. 33 (4), 395-401 (2015).</li>
<li>Kasinathan, S., Orsi, G. A., Zentner, G. E., Ahmad, K., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+mapping+of+transcription+factor+binding+sites+on+native+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-resolution mapping of transcription factor binding sites on native chromatin.</a> Nat Methods. 11 (2), 203-209 (2014).</li>
<li>Skene, P. J., Hernandez, A. E., Groudine, M., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleosomal+barrier+to+promoter+escape+by+RNA+polymerase+II+is+overcome+by+the+chromatin+remodeler+Chd1%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">The nucleosomal barrier to promoter escape by RNA polymerase II is overcome by the chromatin remodeler Chd1.</a> eLife. 3, 02042(2014).</li>
<li>Aughey, G. N., Southall, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dam+it%27s+good%21+DamID+profiling+of+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Dam it's good! DamID profiling of protein-DNA interactions.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 5 (1), 25-37 (2016).</li>
<li>Wang, H., Mayhew, D., Chen, X., Johnston, M., Mitra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calling+Cards+enable+multiplexed+identification+of+the+genomic+targets+of+DNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Calling Cards enable multiplexed identification of the genomic targets of DNA-binding proteins.</a> Genome Res. 21 (5), 748-755 (2011).</li>
<li>Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIC+and+ChEC%3A+Genomic+Mapping+of+Chromatin+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">ChIC and ChEC: Genomic Mapping of Chromatin Proteins.</a> Mol Cell. 16 (1), 147-157 (2004).</li>
<li>Merz, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actively+transcribed+rRNA+genes+in+S.+cerevisiae+are+organized+in+a+specialized+chromatin+associated+with+the+high-mobility+group+protein+Hmo1+and+are+largely+devoid+of+histone+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Actively transcribed rRNA genes in S. cerevisiae are organized in a specialized chromatin associated with the high-mobility group protein Hmo1 and are largely devoid of histone molecules.</a> Genes Dev. 22 (9), 1190-1204 (2008).</li>
<li>Schmid, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nup-PI%3A+The+Nucleopore-Promoter+Interaction+of+Genes+in+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Nup-PI: The Nucleopore-Promoter Interaction of Genes in Yeast.</a> Mol Cell. 21 (3), 379-391 (2006).</li>
<li>Dunn, T., Gable, K., Beeler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cellular+Ca2%2B+by+yeast+vacuoles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of cellular Ca2+ by yeast vacuoles.</a> J Biol Chem. 269 (10), 7273-7278 (1994).</li>
<li>Grünberg, S., Henikoff, S., Hahn, S., Zentner, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mediator+binding+to+UASs+is+broadly+uncoupled+from+transcription+and+cooperative+with+TFIID+recruitment+to+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Mediator binding to UASs is broadly uncoupled from transcription and cooperative with TFIID recruitment to promoters.</a> The EMBO Journal. 35 (22), 2435-2446 (2016).</li>
<li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+yeast+transformation+using+the+LiAc%2FSS+carrier+DNA%2FPEG+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).</li>
<li>Rohland, N., Reich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost-effective%2C+high-throughput+DNA+sequencing+libraries+for+multiplexed+target+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Cost-effective, high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture.</a> Genome Res. 22 (5), 939-946 (2012).</li>
<li>Orsi, G. A., Kasinathan, S., Zentner, G. E., Henikoff, S., Ahmad, K. Mapping regulatory factors by immunoprecipitation from native chromatin. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOrsi%2C+GA+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22">Current protocols in molecular biology</a>. Ausubel, F. M., et al. 110, 21-25 (2015).</li>
<li>Heinz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+Combinations+of+Lineage-Determining+Transcription+Factors+Prime+cis-Regulatory+Elements+Required+for+Macrophage+and+B+Cell+Identities%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Simple Combinations of Lineage-Determining Transcription Factors Prime cis-Regulatory Elements Required for Macrophage and B Cell Identities.</a> Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).</li>
<li>Kungulovski, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+histone+modification-specific+interaction+domains+as+an+alternative+to+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Application of histone modification-specific interaction domains as an alternative to antibodies.</a> Genome Res. 24 (11), 1842-1853 (2014).</li>
<li>Vogel, M. J., Peric-Hupkes, D., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+in+vivo+protein-DNA+interactions+using+DamID+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Detection of in vivo protein-DNA interactions using DamID in mammalian cells.</a> Nat. Protocols. 2 (6), 1467-1478 (2007).</li>
<li>Feeser, E. A., Wolberger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+Functional+Studies+of+the+Rap1+C-Terminus+Reveal+Novel+Separation-of-Function+Mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural and Functional Studies of the Rap1 C-Terminus Reveal Novel Separation-of-Function Mutants.</a> J Mol Biol. 380 (3), 520-531 (2008).</li>
<li>Neph, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+expansive+human+regulatory+lexicon+encoded+in+transcription+factor+footprints%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An expansive human regulatory lexicon encoded in transcription factor footprints.</a> Nature. 489 (7414), 83-90 (2012).</li>
<li>Mountjoy, K. G., Kong, P. L., Taylor, J. A., Willard, D. H., Wilkison, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanocortin+receptor-mediated+mobilization+of+intracellular+free+calcium+in+HEK293+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">Melanocortin receptor-mediated mobilization of intracellular free calcium in HEK293 cells.</a> Physiol Genomics. 5 (1), 11-19 (2001).</li>
<li>Seurin, D., Lombet, A., Babajko, S., Godeau, F., Ricort, J. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-Like+Growth+Factor+Binding+Proteins+Increase+Intracellular+Calcium+Levels+in+Two+Different+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Insulin-Like Growth Factor Binding Proteins Increase Intracellular Calcium Levels in Two Different Cell Lines.</a> PLoS ONE. 8 (3), e59323(2013).</li>
<li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Calcium+in+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging Calcium in Neurons.</a> Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).</li>
<li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+for+editing%2C+regulating+and+targeting+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotech. 32 (4), 347-355 (2014).</li>
<li>Filion, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Protein+Location+Mapping+Reveals+Five+Principal+Chromatin+Types+in+Drosophila+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic Protein Location Mapping Reveals Five Principal Chromatin Types in Drosophila Cells.</a> Cell. 143 (2), 212-224 (2010).</li>
<li>van Bemmel, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Network+Model+of+the+Molecular+Organization+of+Chromatin+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A Network Model of the Molecular Organization of Chromatin in Drosophila.</a> Mol Cell. 49 (4), 759-771 (2013).</li>
<li>Izzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genomic+Landscape+of+the+Somatic+Linker+Histone+Subtypes+H1.1+to+H1.5+in+Human+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">The Genomic Landscape of the Somatic Linker Histone Subtypes H1.1 to H1.5 in Human Cells.</a> Cell Rep. 3 (6), 2142-2154 (2013).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הראינו כי ChEC יכול למפות שיעורים שונים של חלבונים שמרים על הכרומטין, ולצפות כי יהיה זה ישים באופן רחב על משפחות שונות של TFs אחרים הכרומטין מחייב גורמים בשמרים. CHEC-seq הוא יתרון בכך שהוא אינו דורש crosslinking, solobilization הכרומטין, או נוגדנים. לפיכך, ChEC נמנע חפצים עשויים להיות נוכח X- שבב- seq, כגון חפץ היפר ChIPable 3 , 4 , ו CHIP יליד, כגון שליליות שווא בשל solobilization חלבון שלם 14 . ה...

מיפוי של אתרי קשירה של גורמי שעתוק (TFs), remodelers הכרומטין, ושאר גורמים הקשורים הרגולציה הכרומטין הוא המפתח להבנת כל התהליכים מבוססי הכרומטין. בעוד הכרומטין immunoprecipitation ו-תפוקה גבוהה רצף (שבב- seq) גישות שימשו כדי לקבל תובנות חשובות רבות בביולוגיה הגנום, יש להם מגבלות בולטות. אנחנו לאחרונה הציג שיטה חלופית, כינה מחשוב אנדוגני הכרומטין תפוקה גבוהה רצף (CHEC-seq) 1 , כדי לעקוף את החסרונות. שבב- seq מבוצע לרוב עם צעד פורמלין מראש crosslinking (X-CHIP-seq) כדי לשמר אינטראקציות DNA- חלבון. עם זאת, מספר מחקרים שנעשו לאחרונה הצביעו על כך ש- X-CHIP-seq לוכד אינטראקציות דנ&quot;א חולפות או בלתי ספציפיות ל- DNA , 2 , 3 , 4 , 5 &lt;Sup&gt;, 6 , 7 , 8 , והוליד אתרי חיוב חיוביים כוזבים. בנוסף, sonication, נפוץ לשבר הכרומטין בניסויים X- שבב seq, מועדף מזמרה אזורים של הכרומטין פתוח, המוביל התאוששות מוטה של ​​שברי אלה אזורים 9 , 10 . Sonication גם מניב תערובת הטרוגנית של אורכי שבר, בסופו של דבר הגבלת רזולוציה האתר מחייב, אם כי תוספת של צעד עיכול exonuclease יכול לשפר באופן משמעותי את ההחלטה 11 , 12 . שיטות צ&#39;יפ מקוריות כגון אזורים כבושים של גנומים מזיקה מטוהרים באופן טבעי בכרומטין (ORGANIC) 13 אינם משתמשים ב- crosslinking וברומטית של כרומטין עם noclease microococcal (MNase), המקלים על הטיות אפשריות הקשורות עם crosslinking פורמלדהיד ו sonication. למרות זאת,מסיסותם של חלבונים רבים הקשורים בכרומטין בתנאים הקלים יחסית הנדרשים להפקת הכרומטין היא גרועה, דבר שעלול להוביל למגוון דינמי מופחת ו / או לתשלילי שווא 14 . בעוד שחידושים שונים של שבב- seq משמשים בדרך כלל למיפוי גנומי רחב של אינטראקציות DNA-חלבון, מספר טכניקות מיפוי המבוססות על היתוך של חלבונים בעלי עניין באנזימים שונים לשינוי דנ&quot;א יושמו גם הם. גישה אחת כזו היא DNA adenine methyltransferase זיהוי (Damid) 15 , שבו חלבון מחייב הכרומטין של עניין הוא התמזגו גנטית לסכר ואת היתוך זה בא לידי ביטוי בתאים או בבעלי חיים, וכתוצאה מכך מתילציה של רצפים GATC הפרוקסימלי לאתרים מחייב עבור החלבון. Damid הוא יתרון בכך שהוא אינו מסתמך על immunoprecipitation ולכן נמנע crosslinking, נוגדנים, או solubilization הכרומטין. זה מתבצע גם in vivo . למרות זאת, את הרזולוציה של Damid מוגבל סולם קילובז ואת פעילות methylating של חלבון היתוך דאם הוא מכונן. שיטה שנייה המבוססת על היתוך אנזימטי היא קריאה כרטיס 16q, אשר מעסיקה היתוך של גורם של עניין טרנספוזיס, בימוי אינטגרציה ספציפית לאתר של טרנספוזונים. כמו Damid, קורא כרטיס seq אינו מבוסס על immunoprecipitation ולכן יש יתרונות דומים, עם יתרון נוסף של רזולוציה מוגברת. עם זאת, קורא כרטיס- Seq עשוי להיות מוגבל על ידי רצף הטיות של transposases והוא גם סומך על נוכחות של אתרי הגבלה קרוב אתרי ההכנסה טרנספוסון. שיטה שלישית היתוך אנזימטית, שפותחה במעבדה Laemmli, הוא chromatin אנדוגני מחשוף (CHEC) 17 . ב CHEC, היתוך בין חלבון הקשורים הכרומטין MNase מתבטא בתאים, ועל תוספת סידן כדי להפעיל MNase, DNA הוא ביקע הפרוקסימלי לאתרים מחייב עבור מתויגגורם ( איור 1 ). בשילוב עם דרום סופג, ChEC שימש לאפיין מבנה הכרומטין וחלבון מחייב במספר loci הפרט בשמרים 17 , 18 , ו כבר בשילוב עם ניתוח microarray ברזולוציה נמוכה כדי לחקור את האינטראקציה של רכיבים נקבובית גרעינית עם שמרים הגנום 19 . ChEC מציעה הטבות דומות כמו DUMID ו Calling כרטיס SEQ, ואת הפתרון שלה הוא כמעט בסיס בסיס זוג כאשר ניתח על ידי הרחבה פריימר 19 . ChEC הוא גם controllable: חצץ DNA חזק על ידי MNase תלוי תוספת של סידן millimolar, להבטיח כי MNase אינו פעיל בריכוז סידן חינם חינם שנצפה בתאים שמרים חיים 20 . בעבר, אנו presulated כי שילוב של CHEC עם תפוקה גבוהה רצף (ChEC-seq) יספק מפות ברזולוציה גבוהה של אתרי הקישור TF. ואכן, ChEC-seq שנוצר מפות ברזולוציה גבוהה של שמרים ניצני כללי כללי הרגולציה (GRFs) Abf1, Rap1, ו Reb1 על פני הגנום 1 . יש לנו גם ליישם בהצלחה ChEC-seq אל המתווך מודולרי מודולרי, משומר, תמלול תמלילי גלובלי חיוני 21 , להרחיב את תחולתם של CHEC-seq כדי מתחמי בגודל megadalton שאינם ישירות ליצור קשר עם ה- DNA עשוי להיות קשה למפות על ידי שבב- שיטות מבוססות. CHEC-seq היא שיטה רבת עוצמה הן עבור אימות עצמאי של תוצאות שבב- seq ו הדור של תובנות חדשות לתוך הרגולציה של תושבי הכרומטין תהליכים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול צעד אחר צעד ליישום שיטה זו בשמרים ניצני.

<table><tbody><tr><td>dNTPs</td><td>NEB</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>Q5 DNA פולימראז בנאמנות גבוהה</td><td>NEB</td><td>M0491L</td><td>פולימראזות DNA אחרות בנאמנות גבוהה, כגון Phusion, עשויות לשמש להגברת קלטות.</td></tr><tr><td>TrackIt 1 Kb Plus סולם DNA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10488085</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA פולימראז</td><td>NEB</td><td>M0273L</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete מיני קוקטייל מעכב פרוטאז ללא EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11836170001</td><td>חשוב להשתמש בתערובת מעכבי פרוטאז ללא EDTA, כדי לא לעכב את מחשוף MNase על ידי כלציה של Ca2+.</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>ACROS Organics</td><td>AC215740010</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin, טוהר גבוה</td><td>EMD Millipore</td><td>300410-250MG</td><td>צור מלאי של 2% על ידי המסת 20 מ"ג דיגיטונין ב-1 מ"ל DMSO עם מערבולת נמרצת.</td></tr><tr><td>Proteinase K, 20 מ"ג/מ"ל</td><td>Invitrogen</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>RNase A, 10 מ"ג/מ"ל</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Ampure XP חרוזים</td> דמויי אמפור <td>בקמן קולטר</td><td>A63880</td><td>ניתן ליצור באמצעות פרוטוקול שפורסם (הפניה 24).</td></tr><tr><td>מתלה מגנטי MagneSphere</td><td>Promega</td><td>Z5342</td><td></td></tr></tbody></table>

מיפוי רחב של הגנום של אינטראקציות dna-חלבון עם chec-seq ב<em&gt; saccharomyces cerevisiae</em

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

מיפוי רחב של גנום של אינטראקציות DNA- חלבון הוא קריטי להבנת רגולציה גנטית, שיפוץ הכרומטין, ותהליכים אחרים הכרומטין תושב. פורמלדהיד crosslinking ואחריו immunoprecipitation הכרומטין ותפוקה גבוהה רצף (X-CHIP-Seq) שימש כדי לקבל תובנות רבות ערך לתוך ביולוגיה הגנום. עם זאת, X-Chip-seq יש מגבלות בולטות הקשורות crosslinking ו sonication. NIP צ&#39;יפ ימנע את החסרונות הללו על ידי השמטת crosslinking, אבל לעתים קרובות התוצאות התאוששות לקויה של חלבונים הקשורים הכרומטין. בנוסף, כל השיטות מבוססות שבב כפופות לשיקולי איכות נוגדנים. שיטות אנזימטיות למיפוי אינטראקציות דנ&quot;א של חלבון, הכוללות היתוך של חלבון בעל עניין לאנזים המשנה-דנ&quot;א, שימשו גם למיקוד אינטראקציות DNA-חלבון. לאחרונה שילבנו שיטה כזו, מחשוב אנדוגני הכרומטין (ChEC), עם רצף תפוקה גבוהה כמו CHEC-seq. ChEC-seq מסתמך על היתוך של הכרומטין- AssocIated חלבון של עניין micrococcal nuclease (MNase) כדי ליצור מחשוף DNA ממוקד בנוכחות סידן בתאים חיים. CHEC-seq אינו מבוסס על immunoprecipitation ולכן עוקף חששות פוטנציאליים עם crosslinking, sonication, solobilization הכרומטין, איכות נוגדנים תוך מתן מיפוי ברזולוציה גבוהה עם אותות רקע מינימלי. אנו מאמינים כי ChEC-seq יהיה עמית חזק ל- CHIP, ויספק אמצעי עצמאי שבאמצעותו יאמת את ממצאי ה- CHIP-seq ויגלה תובנות חדשות לגבי הרגולציה הגנומית.

<html> במקרה של ניסוי מוצלח של ה- CHEC, אנליזה של דנ&quot;א על-ידי אלקטרופורזה agarose ג&#39;ל יגלה גידול תלוי סידן ב-שבר עודף DNA, כפי שצוין על ידי מריחה ו בסופו של דבר העיכול המלא של DNA גנומי. במקרים מסוימים, סולם של להקות דומות לזה שנראה עם עיכול MNase המסורתית הוא ציין לאחר העיכול המורחבת. זה המקרה של ניתוח CHEC של Reb1, גורם רגולציה כללי שקושר נוקלאוזום, מדולדל אזורים (NDRs) ( איור 2 ). מצאנו, במקרה של GRFs, העיכו...

אנו מתארים את המחשוף אנדוגני הכרומטית יחד עם רצף תפוקה גבוהה (ChEC-seq), chromatin immunoprecipitation (שבב) שיטה horogonal עבור מיפוי חלבון מחייב אתרים גנום רחב עם חלבונים היתוך microococcal nuclease (MNase).

מיפוי רחב של הגנום של אינטראקציות DNA-חלבון עם CHEC-Seq ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להפיק מפות של אינטראקציות חלבון-DNA ברחבי הגנום in situ ברזולוציה גבוהה ועם רקע נמוך, ללא צורך בקישור צולב (crosslinking) באמצעות פורמלהיד, המסה של כרומטין או נוגדנים. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום השעתוק, כגון היכן גורמים רגולטוריים שונים נקשרים לכרומטין ביחס לאזורי בקרה גנתיים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת מפות קישור גנומיות ברזולוציה גבוהה עם רקע מזערי, ונמנעת ממגבלות הקשורות לפרוטוקולי ChEC-seq סטנדרטיים.את הפרוצדורה ידגים סבסטיאן גרונברג, עמיתי ממרכז פרד הטיצ'ינסון למחקר הסרטן. אחר הצהריים או בערב של היום שלפני הניסוי, התחילו תרבית מקדימה של הזן המיועד לניסוי. זרקו מושבה בודדת של הזן, הנושא את הגורם המסומן ב-MNase, לתוך שלושה מיליליטר של peptone dextrose משומש, או למצע סלקטיבי מתאים.דגרו תרבית זו למשך לילה במקטרן עם ניעור בטמפרטורה של 30 degrees Celsius. למחרת בבוקר, דללו את תרבית הלילה לתוך 50 milliliters של מצע עד לצפיפות אופטית ב-600 nanometers של 0.2 עד 0.3. דגרו את התרבית במקטרן עם ניעור עד שהיא תגיע לצפיפות אופטית ב-600 nanometers של 0.5 עד 0.7.הכינו את הכמות הדרושה של Buffer A בתוספת המרכיבים הנלווים, ושמרו אותה בטמפרטורת החדר במהלך הפרוצדורה. הכינו מבחנות מיקרו-צנטריפוגה לאיסוף דגימות. עבור כל גורם חדש המנותח, אספו דגימות ללא הוספת סידן, והוסיפו דגימות לאחר 30 שניות, דקה אחת, 2.5 דקות, 5 דקות ו-10 דקות מהוספת הסידן.לכל מבחנה הוסף 90 µL של תמיסת עצירה (stop solution), ו-10 µL של 10% SDS. כאשר התרבית הגיעה לצפיפות אופטית ב-600 nm של 0.5 עד 0.7, העבר את התרבית למבחנה קונית של 50 mL, וסבב במצב צנטריפוגה ב-1,500 ×g למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. הסר את העלייה (supernatant), השהה מחדש את התאים באופן יסודי ב-1 mL של Buffer A, והעבר את התאים שהושהו למבחנה של מיקרוצנטריפוגה.שקע את התאים שסוספנדו מחדש במיקרו-צנטריפוגה במהירות של 1, 500 times g למשך 30 שניות בטמפרטורת החדר. שאב את העל-משקע, וסספנד מחדש את התאים ביסודיות במיליליטר אחד של Buffer A באמצעות פיפוט מעלה ומטה. שקע את התאים שסוספנדו מחדש במהירות של 1, 500 times g למשך 30 שניות בטמפרטורת החדר.הסיר את העליון (supernatant), השהה מחדש את התאים במיליליטר אחד של Buffer A, וצנטריפוגה שוב. לאחר הסרת העליון, השהה את התאים באופן יסודי ב-570 microliters של Buffer A. הוסף 30 microliters של 2% digitonin כדי להקל על פרמבליזציה של התאים, והפוך את המבחנה כדי לערבב. בצע פרמבליזציה לתאים בבלוק חימום בטמפרטורה של 30 degrees Celsius למשך חמש דקות.בצעו פיפוט של התגובה למעלה ולמטה כדי להבטיח פיזור אחיד של התאים. כביקורת שלילית, העבירו מנה של 100 microliter של תאים חדירים (permeabilized cells) למסורת מיקרו-צנטריפוגה המכילה תמיסת עצירה ו-SDS, ובצעו ערבוב קצר באמצעות וורטקס. לפני תחילת סדרת זמני התגובה, קריטי ששפופרות תמיסת העצירה, הפיפטה, טיפי הפיפטה והטיימר יהיו ממוקמים לצד גושי החימום, כדי שניתן יהיה לאסוף את נקודות הזמן המוקדמות ביעילות.כדי להתחיל את סדרת המדידות לאורך זמן, הוסף 1.1 µL של סידן כלוריד בריכוז 1M לתאים המעובדים (permeabilized) כדי להפעיל את ה-MNase, והפוך את המבחנה מספר פעמים במהירות לערבוב. החזר מיד את התגובה המעורבבת ל-30 °C והפעל טיימר. בכל נקודת זמן לדגימה, בצע פיפטינג של התגובה למעלה ולמטה כדי להבטיח התפלגות אחידה של התאים, ולאחר מכן העבר מנה (aliquot) של 100 µL של תאים מעובדים למבחורת מיקרופוגה המכילה תמיסת עצירה ו-SDS.ערבב באמצעות וורטקס (Vortex) לזמן קצר. לאחר איסוף כל נקודות הזמן, הוסף ארבעה µL של proteinase K בריכוז 20 mg/mL לכל דגימה. ערבב באמצעות וורטקס לזמן קצר, והדגר בטמפרטורה של 55 °C למשך 30 דקות.הוסיפו 200 µL של phenol:chloroform:isoamyl alcohol לכל דגימה, ערבבו בעזרת vortex בעוצמה, וסבבו בצנטריפוגה במהירות מקסימלית למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. העבירו את הפאזה המימית למבחנה חדשה. הוסיפו 30 µg של glycogen ו-500 mL של 100% ethanol.ערבבו בחוזקה באמצעות וורטקס, והשקיעו על קרח יבש למשך 10 דקות, או עד שהתמיסה תהפוך לצמיגית. השקיעו את ה-DNA המשקע למשקע באמצעות צנטריפוגה במהירות מרבית, בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. שפכו את הנוזל העליון ושטפו כל משקע במיליליטר אחד של 70% ethanol בטמפרטורת החדר.שפכו את האתנול והסירו את השאריות על ידי הפיכת המבחנות והטפה עדינה שלהן על נייר סופג. סובבו את הדגימות לזמן קצר באמצעות צנטריפוגה שולחנית, ולאחר מכן השתמשו בפיפט כדי להסיר את האתנול שנותר, תוך הקפדה שלא להפריע למשקע. ייבשו את המשקעים באוויר בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות.בזמן שהמשקעי DNA מתייבשים, הכינו תערובת מאסטר (master mix) של Tris buffer ו-RNase A לצורך ריסוסף של המשקעים לאחר התייבשותם, וערבבו באמצעות וורטקס. הוסיפו 30 µL של תמיסת RNase A לכל משקע DNA יבש, ערבבו בוורטקס והדגירו בטמפרטורה של 37 °C למשך 20 דקות כדי לעכל את ה-RNA. לאחר 20 דקות, ערבבו 1 µL של 6X DNA loading dye עם 5 µL מכל דגימה, והריצו על ג'ל agarose בריכוז 1.5% במתח של 120 V למשך 40 דקות.התחילו את הליך בחירת הגודל על ידי הוספת 75 µL של חרוזי SPRI בתמיסת polyethylene glycol לכל דגימה. העבירו את התערובת של החרוזים וה-DNA בפיפטה למעלה ולמטה 10 פעמים כדי לערבב, ולאחר מכן הדגרירו בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. במהלך ההדגירה של חרוזי ה-SPRI, הכינו מבחנות מיקרופוג'ה המכילות 96 µL של Tris 10 mM ב-pH 8.0, ו-4 µL של sodium chloride 5 M עבור כל דגימה.הניחו את המבחנות המכילות את תערובת הגבשוביות וה-DNA במעמד מגנטי למשך שתי דקות כדי לרכז את הגבשוביות לדופן המבחנה, ולאחר מכן העבירו כל מ supernat לתוך מבחנה חדשה המכילה Tris ונתרן כלוריד. הוסיפו 200 µL של phenol:chloroform:isoamyl alcohol לכל דגימה, ערבבו באמצעות vortex, וסבבו בצנטריפוגה במהירות מרבית בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. העבירו כל פאזה מימי למבחנה חדשה, והוסיפו 30 µg של גליקוגן ו-500 µL של 100% ethanol.שקיעו את ה-DNA על קרח יבש למשך 10 דקות, או עד שהתמיסה הופכת לצמיגית. רסקו את ה-DNA המשקע באמצעות צנטריפוגה במהירות מרבית ובטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. שפכו את הנוזל העליון ושטפו כל משקע במיליליטר אחד של ethanol 70%.שפכו את האתנול, והסירו את השאריות על ידי הפיכת המבחנות והקשה עליהן בעדינות על נייר סופג. סבבו את הדגימות לזמן קצר באמצעות צנטריפוגה שולחנית, והשתמשו בפיפט להסרת שאריות אתנול, תוך הקפדה לא להפריע למשקע. ייבשו את המשקעים באוויר בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.שחזר כל משקע מיובש ב-25 microliters של Tris pH 8. קבע את הריכוז של כל דגימה באמצעות בדיקה בעלת רגישות גבוהה. אלקטרופורזה של DNA על ג'ל אגרוז, מתוך ניתוח של פיצול אנדוגני של כרומטין עבור Reb1, גורם רגולטורי כללי הנקשר לאזורים דלילי נוקלאוזומים, מגלה עלייה תלוית-סידן בפרגמנטציה של ה-DNA לאורך זמן, כפי שעולה מהמריחה (smearing), ועד לעיכול מלא של ה-DNA הגנומי.ויזואליזציה של קצוות פרגמנטים מניסוי Reb1 chromatin endogenous cleavage sequencing חושפת העשרה חזקה של Reb1 מעל הרקע, שנגזר מזן ה-MNase החופשי לאחר 30 שניות של טיפול בסידן. באופן דומה, נצפתה השגחה משמעותית של DNA על ידי פוזיונ של תת-היחידה Med8 של המתווך (mediator) עם MNase, אך לא על ידי MNase חופשי המונע על ידי פרומוטר Med8 דקה אחת לאחר הוספת סידן. כדי להשוות את נתוני ה-Reb1 chromatin endogenous cleavage sequencing לנתוני שיקוע חיסוני של כרומטין (chromatin immunoprecipitation) וריצוף ברזולוציה גבוהה (high throughput sequencing), 1,992 שיאי Reb1 שנקבעו בשיטה האורגנית מורכזו סביב המוטיב, ונקבע מספר קצוות הפרגמנטים הממוצע בכל מיקום בסיס בחלון של 100 זוגות בסיסים סביב נקודת האמצע של המוטיב.נצפתה אסימטריה ובקיעה בולטות, כאשר רוב קצוות הפסיגמנטים ששוחררו על ידי Reb1-MNase ממופים לצד המעלה (upstream) של המוטיב. לאחר שליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה ביום עבודה מלא אחד, בתנאי שהיא בוצעה כהלכה. בעת ניסוי של הליך זה, חשוב לזכור להגביל את מספר הדגימות הנבדקות במקביל, כדי להבטיח דיוק בפיפטינג ובזמני הטיפול.לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום השעתוק לאפיין, לראשונה ובצורה חד-משמעית, את השיוך הגנומי של קומפלקס חלבונים בגודל מגה-דלטון שאינו נקשר ל-DNA בשמרים. לאחר צפייה בסרטון זה, יהיה לכם מושג טוב כיצד לבצע את שיטת ה-ChEC-Seq למיפוי גנומי רחב של אתרי קישור של חלבונים בגנום של שמרים פורחים.

genome-wide-mapping-protein-dna-interactions-with-chec-seq

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

כאן אנו מתארים טכניקה חדשה proteomics כמותיים לזיהוי מתחמי חלבון cerevisiae Saccharomyces. במחקר הנוכחי, השתמשנו בשיטה SILAC יחד עם טיהור זיקה ואחריו טנדם ספקטרומטריית מסה להזדהות עם סגוליות גבוהה השותפים המחייב של חלבון ER, Scs2p.

זיהוי של קומפלקסים חלבונים עם proteomics כמותיים cerevisiae ס

(גני גן או epistasis) מסכים שיטתיים, בקנה מידה גדול סינטטיים גנטיים אינטראקציה יכולים לשמש כדי לחקור יתירות ומסלול-הצטלבות גנטית. כאן, אנו מתארים טכנולוגית תפוקה גבוהה כמותית סינטתית גנטית מערך הקרנה, כינת eSGA שפתחנו להבהרת יחסי epistatic ולחקור רשתות אינטראקציה גנטיות...

מיפוי רשתות פונקציונליות חיידקיים ומסלולים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות מערכים גנטיים סינטטיים

בסרטון זה, אנו מדגימים את בדיקת השמרים ההיברידית האחת, אשר מזהה חלבונים מרובים המקיימים אינטראקציה עם דנ"א המטרה. תאי השמרים שעברו טרנספורמציה מכילים את רצף דנ"א המטרה במעלה הזרם של הגן המדווח. בנוסף, הם מבטאים חלבונים של פקטור שעתוק. כאשר החלבונים יוצרים קומפלקסים ונקשרים לדנ"א המטרה, הגן המדווח מתבטא וניתן לזהותו באופן אנזימטי.

בדיקה היברידית שונה של שמרים-אחד לזיהוי אינטראקציות קומפלקס חלבונים הטרומריים-DNA

באמצעות מערכי חלבון המכיל כמעט את כל ס proteome cerevisiae הוא חקר לחקירה משוחדת מהירה של אלפי אינטראקציות חלבון-חלבון במקביל. שיטה זו יכולה להיות מנוצלת למולקולת חלבון קטן, שינוי posttranslational, ומבחנים אחרים בתפוקה גבוהה.

חיטוט Microarrays חלבון פונקציונלי בצפיפות גבוהה לזיהוי חלבונים אינטראקציות

חלבונים מתקשרים זה עם זה ואינטראקציות אלה קובעות במידה רבה את תפקודיהם. ניתן לזהות שותפים לאינטראקציה עם חלבונים בתפוקה גבוהה in vivo באמצעות בדיקת כושר שמרים המבוססת על בדיקת השלמת שבר חלבון דיהידרופולאט רדוקטאז (DHFR-PCA).

הקרנת הגנום כל חלבונים אינטראקציה ידי חלבון-בר השלמה Assay (PCA) בתאים חיים

מאמר זה מציג שיטה רגישה הנקראת Circle-Seq לטיהור DNA מעגלי חוץ-כרומוזומלי (eccDNA). השיטה כוללת טיהור עמודות, הסרת ה-DNA הכרומוזומלי הליניארי שנותר, הגברת מעגל מתגלגל ורצף תפוקה גבוהה. Circle-Seq ישים לסינון בקנה מידה גנומי של eccDNA איקריוטי ולחקר חוסר יציבות הגנום ושונות במספר העתק.

טיהור הגנום כולו של DNA המעגל extrachromosomal מתאי איקריוטיים

עיבוד אצווה של שמרים 2-היברידית מסכים מאפשר השוואה ישירה של הפרופילים האינטראקציה של מספר חלבונים הפיתיון עם סט מורכב של חלבונים פיוז'ן טרף. כאן, אנו מתארים שיטות מעודן, ריאגנטים החדש וכיצד ליישם ושימושם עבור מסכי כזה.

מסך 2-היברידית שמרים אצווה כדי להשוות בין אינטראקציות חלבון

רצף עמוק של אוכלוסיות השמרים שנבחר עבור אינטראקציות חיוביות שמרים 2-היברידית פוטנציאל התשואות שפע של מידע אודות אינטראקציה שותף חלבונים. כאן, אנו מתארים את הפעולה של ביואינפורמטיקה ספציפי כלים ותוכנות מעודכן המותאם אישית כדי לנתח נתונים רצף כזה המסכים.

Informatic ניתוח של נתוני רצף אצווה שמרים 2-היברידית המסכים

השפעה הדדית באמצעות רצף (RH-seq) היא שיטה חדשה ורבת עוצמה למפות את הבסיס הגנטי של הבדל תכונה בין מינים. בריכות המייזוליטיס נוצרות על ידי הטרנספורזיס והכושר שלהם מתבצע באמצעות הצמיחה התחרותית באמצעות רצף ברמה גבוהה. ניתוח הנתונים הנובעים מנקודות גנים שבבסיס התכונה.

מיפוי גנטי של הבדלי התרמוסבילות בין מינים של שמרים באמצעות הגנום ההופכי לניתוח המייזוליסיטי

קביעה מדויקת של מיקומים מחייבי חלבון ברחבי הגנום חשובה להבנת ויסות הגנים. כאן אנו מתארים שיטת מיפוי גנומית המטפלת בדנ"א כרומטין-אימונו-חיסוני עם עיכול exonuclease (ChIP-exo) ואחריו רצף תפוקה גבוהה. שיטה זו מזהה אינטראקציות בין חלבון לדנ"א עם רזולוציית מיפוי קרובה של זוג בסיס ויחס אות לרעש גבוה בנוירונים של יונקים.

מיפוי ברזולוציה גבוהה של אינטראקציות חלבון-DNA בתאי גזע עכבר נוירונים באמצעות כרומטין Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

העשרה וריצוף של DNA מתהום המקושר לחלבון (eSPAN) פותחה כדי לזהות את השפע היחסי של חלבון הקשור לכרומטין על שני גדילי DNA משכפלים, ובכך לחשוף תובנות מולקולריות לגבי שכפול הכרומטין ותהליכיו המקושרים. פרוטוקול זה מתאר פרוצדורות eSPAN בתאי גזע עובריים (ES) של שמרים ועכברים.

ניתוח ייחודי לגדיל של חלבונים בשכפול גדילי DNA באמצעות העשרה וריצוף של שיטת DNA מתהווים הקשור לחלבונים

למדו את שיטת ChEC-seq למיפוי אינטראקציות DNA-חלבון ברזולוציה גבוהה ב-Saccharomyces cerevisiae. טכניקה זו מספקת מפות קישור גנומיות עם רקע זניח ללא צלב קפורמלדהיד.

מיפוי רחב של הגנום של אינטראקציות DNA-חלבון עם CHEC-Seq ב

גלה סרטונים נוספים