Neurobehavioral הערכות במודל של עכברים של פגיעה מוחית לפציעה Hypoxic-איסכמי Neonatal

המטרה הכללית של ניתוח פגיעה מוחית נאו నటלית היפוקסית-איסכמית, ולאחריה בדיקות קוגניטיביות ומוטוריות, היא ליצור מודל של עכבר לחקר פגיעות אלו ונזקים מוחיים נלווים. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בנוגע לפגיעה מוחית היפוקסית-איסכמית נאו నటלית, כגון השפעתן של פגיעות אלו על תפקודי מוטוריקה וקוגניציה. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מוכרת ונפוצה בשימוש.

זהו גם מודל פרה-קליני לשיתוק ילדים ולשבץ מוחי ב新生 יילודים. באופן כללי, אנשים שאינם מנוסים בשיטה זו יתקשו, מכיוון שהזיהוי של העורק הקרוטיד הימני החד-צדדי הוא מאתגר. יחד איתי, ידגים את הפרוצדורה יון-קיում שין, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלנו.

לאחר הרדמה של לפחות חמישה גורי עכברים בני שבעה ימים (P7), מקמו גור תחת מיקרוסקופ ניתוח כאשר הבטן פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, נקו את הצוואר עם אלכוהול. כדי להתחיל בניתוח, השתמשו במספריים כדי לבצע חתך של 0.7 מילימטר בצוואר.

לאחר מכן, הסר בזהירות את רקמת השומן, באמצעות פינצטה, עד לחשיפת העורקי הכתף הימני (carotid artery) החד-צדדי. כעת, בעזרת תפר 5-0, קשור את העורקי הכתף הימני החד-צדדי. לסיום, תפר את החתך בצוואר באמצעות ניילון 5-0, וחטא את אזור החתך.

לאחר מכן, אפשרו לגור להתאושש בתא היפוקסי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם מכסה פתוח למשך כשעה. הכניסו עכבר נוסף שעבר מניפולציה כירורגית לתא ההיפוקסי להתאוששות. ברגע שכל הגורים ערים לחלוטין, סגרו את מכסה התא והפחיתו את רמות הגז כדי ליצור תנאי היפוקסיה.

לאחר 90 דקות של היפוקסיה, החזירו את הגורים עם הפגיעה המוחית לכלוביהם. שבוע לאחר מכן, הכינו את הגורים לניתוח, כפי שנעשה קודם לכן, כדי לחפש עדות לפגיעה. בצעו חתך בקרקפת כדי לזהות את הנגע המוחי באזור הפוסטרו-לטרלי (posterolateral) של ההמיספירה הימנית.

הבחנו דרך הגולגולת השקופה למחצה בסימנים לפגיעה קורטיקלית ולפגיעה בהיפוקמפוס. בהתאם לכך, סווגו את הגורים כפגועים או כביקורת לא פגועה. לאחר הבדיקה, סגרו את קרקפת הראש באמצעות תפרים, וחטאו את החתך.

כאשר העכברים בני שישה שבועות, העריכו את הזיכרון שלהם על בסיס למידה והימנעות מגירוי דוחה. השתמשו במכשיר מסחרי להימנעות פסיבית בעל שני תאים למעבר (step-through passive avoidance apparatus) למטרה זו. לתחילת התהליך, מקמו עכבר בתא המואר של התיבה למשך 30 שניות.

לאחר מכן, פתחו את הדלת בין התאים ורשמו את זמן ההמתנה (latency) של בעל החיים עד לכניסתו לתא החשוך. אפשרו עד 300 שניות לביצוע המשימה. כאשר כל ארבעת גפיו של העכבר נמצאות במלואן בתוך התא החשוך, סגרו את הדלת.

לאחר מכן, תנו שוק חשמלי ברגליים בעוצמה של 1/2 milliamp למשך שתי שניות, והחזירו את העכבר לכלובו. לאחר 24 שעות, חזרו על הבדיקה. הפעם, אפשרו לעכבר זמן מלא של 300 שניות כדי לעבור לתא החשכה, ואל תתנו לעכבר שוק חשמלי.

בצעו את מבחן הליכת הסולם בעכברים בני ששה שבועות כדי להבחין בין הפרעות קלות בתפקוד המוטורי, באמצעות ניתוחים איכותניים וכמותיים כאחד. ראשית, הגדירו את מכשיר הסולם, ולאחר מכן הגדירו מצלמת וידאו להקלטת תנועות הגפיים של העכבר על המכשיר. לאחר מכן, הניחו עכבר על לוח ההתחלה והתחילו בהקלטה באמצעות מצלמת הווידאו.

וודאו כי הרגליים מופיעות במיקוד טוב בווידאו. כאשר העכבר נוגע בלוח האחרון של מכשיר הסולם, הפסיקו את ההקלטה. לאחר מכן, העבירו את העכבר חזרה ללוח ההתחלה, והקליטו שוב את העכבר חוצה את המכשיר.

בצעו זאת סך הכל ארבע פעמים לכל עכבר בכל תאריך ניסוי. מאוחר יותר, בעת ניתוח הווידאו, ספרו ידנית את מספר ההחלקות של כל גפה בזמן השמעת הווידאו במהירות של 1/10. כאשר גפה מחליקה בין השבכים, הדבר נחשב כהחלקה.

כאשר העכברים בני שישה שבועות, העריכו את חוזק האחיזה שלהם. השתמשו במד מאמץ לדחיפה/משיכה, המחובר לחוט משולש בעובי שני מילימטרים, כאשר כולם מקובעים ללוח. מקמו את העכבר על הלוח, תוך החזקתו בזנבו.

לאחר מכן, אפשרו לעכבר להגיע עם הגפיים הקדמיות שלו אל תיל המתכת. ברגע שהעכבר יאחז בתיל, משכו בעדינות את זנבו עד שישחרר את האחיזה. המכשיר ירשום את שיא הכוח שהופעל על התיל בגרמים.

חזרו על בדיקה זו חמש פעמים לפני מתן מנוחה לעכבר. במהלך בדיקת כוח האחיזה, קיימות תנועות ניכרות של ביצועים מדויקים. נסו לזהות תנועות אלו לאורך חמישה ניסיונות לפני מתן מנוחה לעכבר, למשך דקה אחת לפחות, על מנת להפחית את העייפות השרירית שלו.

לאחר שהעכבר נח למשך דקה אחת לפחות, חזור על סדרת חמשת הניסיונות פעם נוספת. לאחר מכן, תן לעכבר מנוחה נוספת, ובצע את הסדרה פעם אחרונה עבור אותו יום בדיקה. מהנתונים, השתמש בממוצע של שלושת הציונים הגבוהים ביותר עבור גפה קדמית אחת או עבור שתי הגפיים הקדמיות לצורך הניתוח.

לאחר קצירת המוחות של בעלי חיים בני 14 שבועות שסבלו מפגיעת היפוקסיה-איסכמיה, המוחות הוערכו מורפולוגית כבעלי פגיעה קורטקלית קלה, פגיעה חמורה או ללא פגיעה. אותם בעלי חיים נסרקו באמצעות MRI שבוע קודם לכן, ממצאים שהיו גם הם חושפניים מאוד. אפילו המוח שנראה תקין מורפולוגית הראה פגיעה קלה בהיפוקמפוס.

בגיל ששה שבועות, חמישה שבועות לאחר הפגיעה, העכברים נבחנו באמצעות משימות התנהגותיות שונות. עכברים עם פגיעה של היפוקסיה-איסכמיה סבלו מליקוי קוגניטיבי במטלת ההימנעות הפסיבית של 24 שעות. מכיוון שרק ההמיספרה הימנית הייתה פגועה, העכברים הראו תפקודים מוטוריים המאפיינים חצישיתוק.

דבר זה נחשף על ידי ההבדל באחוז ההחלקות מהשלבים הרוחביים של הסולם עבור כל גפה קדמית. יתרה מכך, מכיוון שכוח האחיזה מערב את קליפת המוח המוטורית במוח, הקבוצות עם הפגיעה הקורטיקלית והקבוצות הנורמליות הראו הבדלים בעוצמת האחיזה. לא נצפה הבדל בין הביקורות הנורמליות לבין עכברים שאינם פגועים באופן קטגורי, אך העכברים הפגועים היו לקויהים בבירור.

לאחר צפייה בסרטון זה, תגמרו עם הבנה טובה של אופן ביצוע ליגציה של עורק התריס הימני החד-צדדי ליצירת מודל של היפוקסיה-איסכמיה בנאונטלים בעכברים, ושל אופן ביצוע ניתוח התנהגותי למעקב. חשוב לציין כי גם כאשר לא נראה נזק גלוי בקליפת המוח שבעה ימים לאחר הפגיעה, בדיקת MRI עשויה לחשוף פגיעה בהיפוקמפוס. כמו כן, חשוב לזכור להתייחס לגורי העכברים בעדינות ולהשלים את הניתוח במהירות המרבית.

גוריים הם בעלי עור דק וחלש מאוד, לכן יש לנהוג בזהירות רבה.