Microfluidic דימות זרימת cytometry ידי אסימטרית איתור זמן למתוח אופטי מיקרוסקופית (ATOM)
28 ביוני 2017
פרוטוקול זה מתאר את היישום של זמן א-סימטרי איתור למתוח מערכת מיקרוסקופית אופטית עבור הדמיה תא בודד זרימה microfluidic מהירים ויישומים שלה cytometry זרימת הדמיה.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להכין ולהשתמש במערכת מיקרוסקופיה אופטית למתיחת זמן זיהוי אסימטרית להדמיית תא יחיד ללא תוויות בניגודיות גבוהה בזרימה מיקרופלואידית מהירה במיוחד. היתרון העיקרי של ATOM הוא שהוא מאפשר לכידת תמונה מהירה במיוחד עם קצבי סריקת קו של עד עשרות מגה-הרץ תוך שיפור ניגודיות התמונה בתאים ללא תווית. ATOM מאפשר ניתוח מורפולוגי מורכב של מבנים תאיים ותת-תאיים עם מבחנים מבוססי תאים לא נכנסים במהירות של עד 100,000 תאים לשנייה, דבר שאינו אפשרי עם ציטומטריית זרימה סטנדרטית.
כדי להתחיל בהגדרת המערכת השתמש בקולימטור סיבים כדי לחבר פס רחב Femto או Pico שנייה ליד לייזר פועם IR לסיב אופטי מפזר במצב יחיד המחובר למגבר אופטי. האר דירוג עקיפה של שידור עם הלייזר כדי לייצר מקלחת ספקטרלית. כוון את הדירוג קרוב לתצורת ה-littrow כדי למקסם את יעילות העקיפה.
הגדר מכלול עדשות ממסר טלסקופי במערכת הדמיה 4f כדי לכוון את המקלחת הספקטרלית למישור המוקד האחורי של עדשת אובייקט מתחת לפלטפורמת דגימה. ודא שהמקלחת הספקטרלית ממלאת את הצמצם האחורי של עדשת האובייקטיב. הנח עדשת אובייקט נוספת עם מראת מישור בצמצם האחורי שלה מעל פלטפורמת הדגימה.
כוונן את עדשות האובייקט עד שמישורי המוקד שלהן חופפים. ודא שהמטר הספקטרלי עובר את מישור התמונה ועוקב אחר אותו נתיב בחזרה לדירוג. הנח שבב מיקרופלואידי על פלטפורמת הדגימה וודא שהמקלחת הספקטרלית נופלת על פני התעלה המיקרופלואידית.
כוון מחדש את האור המוחזר עם מפצל אלומה לאחר שהוא עובר דרך הדירוג. הפרד את האור המוחזר לשתי אלומות עם מפצל אלומה נוסף. השתמש בקולימטורים של סיבים כדי לחבר את הקורות לסיבים במצב יחיד באורכים שונים כדי להציג עיכוב זמן בין הקורות.
חבר את הסיבים לאוסילוסקופ בזמן אמת באמצעות מצמד סיבים וגלאי פוטו. כוונן את רווח המגבר האופטי עד שיחס האות לרעש של האות האופטי גדול מ-10 דציבלים. לאחר מכן חסום כמחצית מכל קורה שהוחזרה עם בלוקים של קורות קצה סכין.
כוונן את גושי האלומה עד שההספק האופטי הנמדד בכל סיב יהיה כמחצית מההספק לפני החסימה. ודא שרוחב הפס וקצב הדגימה של האוסילוסקופ גבוהים מספיק כדי לא להשפיע על רזולוציית התמונה. כדי להתחיל בניסוי, יש לדלל דגימות תאים בין 10 ל-5 ו-10 עד 6 תאים למיליליטר עם מי מלח או מי מעיין חוצצים פוספט.
לאחר מכן טען את תמיסת התא למזרק של 10 מיליליטר. חבר את המזרק לכניסת התעלה המיקרופלואידית. כוון את יציאת התעלה המיקרופלואידית לצינור צנטריפוגה.
אבטח את המזרק במשאבת מזרק והגדר את קצב הזרימה בהתאם לרוחב התעלה. בחר את מספר נקודות הנתונים שיישמרו עבור הניסוי. לאחר מכן רכוש ושמור את נתוני האות האופטי.
דיגיטציה וייצוא של הנתונים מהאוסצילוסקופ למחשב. עבד את הנתונים לתמונות דו-ממדיות וחלץ ספריית פרמטרים מהתמונות. ייבא את התמונות בספריית הפרמטרים לתוכנית הדמיה.
הקצה פרמטר מעניין לכל ציר ובחר את מערך הנתונים שיוצג כתרשים פיזור. בדוק את תמונות התאים המשויכות לכל קבוצה בתרשים כדי לזהות מגמות. השתמש בשער ידני או הצג מערכי נתונים נוספים לניתוח נוסף לפי הצורך.
ATOM שימש לרכישת תמונות חד-תאיות בניגודיות גבוהה של תאים אנושיים ופיטופלנקטון. מבני תאים אופייניים כמו ואקולים, פירנואידים ודגלים, נראים בתמונות הפיטופלנקטון. פרמטרים כמו גודל התא ומעגליות נקבעו מתמונות ה-ATOM כדי לסווג תאים לניתוח ציטומטרי.
ניתן להציג את תוצאות הסיווג כעלילות פיזור דו-ממדיות. כאן תוכנן נפח לעומת מעגליות עבור MCF7 המוצג בצהוב ו-PBMC מוצג באדום. שני אשכולות נצפו עבור MCF7.
על ידי זיהוי התמונות בניגודיות גבוהה המתאימות לנקודות נתונים בודדות, נמצא כי האשכול התחתון תואם לשברי תאים ופסולת. לאחר השליטה ניתן להגדיר את מערכת ההדמיה תוך שעתיים-שלוש אם היא מבוצעת כראוי. ניתן לבצע את הליכי ההדמיה תוך שעה.
אל תשכח להקדיש תשומת לב מיוחדת לבטיחות העיניים בזמן העבודה עם מקור הלייזר ויישור קרן הלייזר. תמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון הרכבת משקפי מגן בעת ביצוע הליכים אלה. בעת ניסיון הליך זה, זכור לנטר את יישור האלומה האופטית לאורך כל תהליך הגדרת מערכת ההדמיה כדי להבטיח איכות הדמיה אופטימלית.
בעוד שטכניקה זו יכולה להעניק תובנה לגבי זיהוי וכימות של תאים נדירים או לכאורה במהלך תהליך המחלה, ניתן ליישם אותה גם על סיווג סוגי תאים, בתוך אוכלוסיות תאים גדולות והטרוגניות. טכניקה זו מועילה במיוחד כאשר מחפשים להתגבר על מגבלת התפוקה של ציטומטריית הדמיה, תוך שמירה על איכות התמונה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליישם ATOM מהגדרת המערכת ועד להליכי ההדמיה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר את היישום של מערכת מיקרוסקופיה אופטית במתיחת-זמן עם גילוי אסימטרי (ATOM) עבור דימיוג של תאים בודדים בניגודיות גבוהה ללא סימון בזרימה מיקרופלואידית אולטרה-מהירה. מערכת ה-ATOM מאפשרת לכידת תמונות מהירה במיוחד ומשפרת את ניגודיות התמונה בתאים שאינם מסומנים, ובכך מאפשרת ניתוח מורפולוגי מורכב.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מיקרוסקופיה אופטית
- דימוי של תא בודד
- מיקרופלואידיקה
רקע
- ATOM מאפשרת הדמיה בקצבי סריקה של שורות המגיעים לעשרות מגה-הרץ.
- היא משפרת את ניגודיות התמונה עבור תאים שאינם מסומנים.
- מאפשרת ניתוח של מבנים תאיים ותתי-תאיים.
- תומכת בבדיקות מבוססות תאים ללא מרכז בקיבולת גבוהה.
מטרת המחקר
- להכין ולהשתמש במערכת מיקרוסקופיה אופטית בעלת מתיחת זמן (time-stretch) עם זיהוי אסימטרי.
- להשיג דימוי בניגודיות גבוהה ללא סימון (label-free) של תאים בודדים.
- לאפשר דימוי בזרימה מיקרופלואידית אולטרה-מהירה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ההתקנה כוללת שימוש בקולימטור סיב אופטי ולייזר פולסני בטווח ה-IR הקרוב.
- צימוד הלייזר לסיב אופטי מפיזר בעל תבנית גל אחת (single mode).
- שימוש במגבר אופטי להגברת האות.
- הארה של סבב עקיפה בשידור (transmission diffraction grating) ליצירת מטר של ספקטרום.
תוצאות עיקריות
- השיגה דימוי של עד 100,000 תאים לשנייה.
- הדגימה ניגודיות משופרת עבור תאים לא מסומנים.
- אפשרה ניתוח מורפולוגי מורכב שאינו אפשרי באמצעות ציטומטריה של זרימה סטנדרטית.
- סיפקה גישה חדשה לדימוי בתפוקה גבוהה.
מסקנות
- ATOM מייצגת התקדמות משמעותית בטכנולוגיית דימיון של תאים בודדים.
- היא מאפשרת ניתוח מהיר ומפורט של מבנים תאיים.
- שיטה זו יכולה לשנות גישות בציטומטריה של זרימה ובתחומים קשורים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
טכנולוגיית ATOM פותרת את מגבלת הספיקה של ציטומטריית זרימה עם דימוי (imaging flow cytometry) בכך שהיא מאפשרת דימוי של תאים בודדים במהירות גבוהה וללא סימון, בקצב של עד 100,000 תאים לשנייה, תוך שמירה על רזולוציה תת-תאית וניגודיות תמונה. יכולת זו תומכת בניתוח סטטיסטי ברמת ביטחון גבוהה באמצעות נתונים מורפולוגיים רב-ממדיים, ובכך משפרת ישירות את תיקוף המטרה (target validation) וסריקה פנוטיפית בשלבים מוקדמים של הגילוי. על ידי אספקת פנוטיפ ביופיזיקלי ללא סימון, ATOM משלימה בדיקות ביוכימיות ומשפרת את הביטחון החוזאי בסיווג תאי בתוך אוכלוסיות הטרוגניות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות ניתוח מורפולוגי ללא סימון של מבנים תאיים ותתי-תאיים.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי הפחתת עמימות מכניסטית באמצעות פנוטיפ תווים ביופיזיקלי בקיבולת גבוהה.
- ערך ניבוי: משפר את תעדוף הפורטפוליו על ידי יצירת פרמטרים מורפולוגיים כמותיים (למשל, גודל, עגוליות) לצורך סיווג ציטומטרי של מצבי תאים ותפקודים.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay Development)
- ערך מדעי: מכין מערכות ביולוגיות עוברי-תיקוף עבור תהליכי עבודה המשכיים (downstream) על ידי אספקת תמונות ברזולוציה סוב-סלולרית ובניגודיות גבוהה, ללא שימוש בתוויות או בצבעים.
- ערך תפעולי: נותן מענה לסטנדרטיזציה ושחזוריות של הבדיקה באמצעות קצבי סריקה מהירים במיוחד של קווים ועיבוד עקבי של אותות אופטיים.
- מדרגיות (Scalability): מדגיש את המוכנות לסריקה ואת היכולת להשתמש בפלטפורמה שוב על ידי אפשור ציטומטריה של זרימה עם דימוי (imaging flow cytometry) בקצב של 100,000 cells/s, ובכך פותר צווארי בקבוק מסורתיים של תפוקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: תומך במערכות הרלוונטיות למחלה על ידי זיהוי תאים נדירים או חריגים באוכלוסיות הטרוגניות, כפי שהודגם עם שורות תאים אנושיות ומיקרו-אצות.
- הלימה פרה-קלינית: מקל על ההמשכיות משלב הגילוי ועד לאימות פרה-קליני באמצעות דימיון ללא סימון (label-free imaging) המשלים בדיקות המבוססות על סמנים ביולוגים.
- החלטות מותאמות סיכון: מאפשר קידום מבוסס נתונים על ידי קישור מגמות מורפולוגיות לתוצאות תפקודיות באמצעות ניתוח תרשימי פיזור (scatter plot) ובחירת תאים ידנית (manual gating).
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
ATOM משתלב ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזות בשלבי הגילוי המוקדמים ועד לזיהוי מובילים (lead identification) ותיקוף פרה-קליני, ומספק דימות ללא סימון (label-free imaging) התומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים ובאנליטיקה חזואית.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי מתן אפשרות לניתוח מורפולוגי מורכב של מבנים תאיים בזרימה במיקרופלואידיקה.
- סריקה: מספקת מוכנות ושחזוריות של בדיקות באמצעות לכידה מהירה של תמונות והפקת פרמטרים כמותיים מתמונות של תאים בודדים.
- אנליזה: מספקת פלטים מדידים כגון גודל תא, עיגוליות ומרקם לצורך ניתוח השוואתי וסיווג בתרשימי פיזור.
- מחקר תרגומי: מקשרת לרצף פרה-קליני על ידי מתן אפשרות לדימות ללא סימון של אוכלוסיות תאים הטרוגניות, ובכך תומכת בסריקה פנוטיפית שאינה תלויה בסמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כפלטפורמה לשימוש חוזר לדימות בתפוקה גבוהה על פני מערכות מודלים שונות, ובכך מפחיתה את התלות בפרוטוקולי צביעה ומאיצה את מחזורי פיתוח הבדיקות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי באמצעות הפחתת סיכונים מורפולוגית ללא סימון (label-free) וצמצום העמימות בסיווג תאי.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה באמצעות דימוג מהיר במיוחד ובקרה עקבית של יחס אות לרעש (>10 dB).
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות "המשך/עצור" (go/no-go) טובה יותר, יעילות הונית והפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים על ידי מתן אפשרות לגילוי מוקדם של תאים נדירים או חריגים.
- השפעה על תיק הפיתוח: תיעדוף והחלטות קידום מותאמות סיכון, המבוססות על נתונים מורפולוגיים כמותיים מדימוג בספיקות גבוהה (high-throughput).
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיה אופטית, מערכות לייזר אולטרה-מהירות ובקרה של זרימה במיקרופלואידיקה.
- נדרש לייזר פולסי בטווח ה-near-IR ברוחב פס רחב בשיעור פמטושנייה/פיקושנייה, מגבר אופטי, סבב עקיפה (diffraction grating) ואוסילוסקופ בעל רוחב פס גבוה.
- נדרש סטנדרט רב-צוותי ליישור קרן, חסימה בשיטת knife-edge וכיול אורך סיב כדי לשמור על ניגודיות התמונה והתזמון.
- כולל שיקולי התאמה עבור סוגי תאים שונים וממדי ערוצי מיקרופלואידיקה כדי להבטיח כיסוי אופטימלי של המקלחת הספקטרלית.
- כולל מגבלות מעשיות כגון דרישות בטיחות לייזר והצורך ביישור מדויק של הנתיב האופטי כדי למנוע פגיעה ברזולוציה.
