28 ביוני 2017
פרוטוקול זה מתאר את היישום של זמן א-סימטרי איתור למתוח מערכת מיקרוסקופית אופטית עבור הדמיה תא בודד זרימה microfluidic מהירים ויישומים שלה cytometry זרימת הדמיה.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להכין ולהשתמש במערכת מיקרוסקופיה אופטית למתיחת זמן זיהוי אסימטרית להדמיית תא יחיד ללא תוויות בניגודיות גבוהה בזרימה מיקרופלואידית מהירה במיוחד. היתרון העיקרי של ATOM הוא שהוא מאפשר לכידת תמונה מהירה במיוחד עם קצבי סריקת קו של עד עשרות מגה-הרץ תוך שיפור ניגודיות התמונה בתאים ללא תווית. ATOM מאפשר ניתוח מורפולוגי מורכב של מבנים תאיים ותת-תאיים עם מבחנים מבוססי תאים לא נכנסים במהירות של עד 100,000 תאים לשנייה, דבר שאינו אפשרי עם ציטומטריית זרימה סטנדרטית.
כדי להתחיל בהגדרת המערכת השתמש בקולימטור סיבים כדי לחבר פס רחב Femto או Pico שנייה ליד לייזר פועם IR לסיב אופטי מפזר במצב יחיד המחובר למגבר אופטי. האר דירוג עקיפה של שידור עם הלייזר כדי לייצר מקלחת ספקטרלית. כוון את הדירוג קרוב לתצורת ה-littrow כדי למקסם את יעילות העקיפה.
הגדר מכלול עדשות ממסר טלסקופי במערכת הדמיה 4f כדי לכוון את המקלחת הספקטרלית למישור המוקד האחורי של עדשת אובייקט מתחת לפלטפורמת דגימה. ודא שהמקלחת הספקטרלית ממלאת את הצמצם האחורי של עדשת האובייקטיב. הנח עדשת אובייקט נוספת עם מראת מישור בצמצם האחורי שלה מעל פלטפורמת הדגימה.
כוונן את עדשות האובייקט עד שמישורי המוקד שלהן חופפים. ודא שהמטר הספקטרלי עובר את מישור התמונה ועוקב אחר אותו נתיב בחזרה לדירוג. הנח שבב מיקרופלואידי על פלטפורמת הדגימה וודא שהמקלחת הספקטרלית נופלת על פני התעלה המיקרופלואידית.
כוון מחדש את האור המוחזר עם מפצל אלומה לאחר שהוא עובר דרך הדירוג. הפרד את האור המוחזר לשתי אלומות עם מפצל אלומה נוסף. השתמש בקולימטורים של סיבים כדי לחבר את הקורות לסיבים במצב יחיד באורכים שונים כדי להציג עיכוב זמן בין הקורות.
חבר את הסיבים לאוסילוסקופ בזמן אמת באמצעות מצמד סיבים וגלאי פוטו. כוונן את רווח המגבר האופטי עד שיחס האות לרעש של האות האופטי גדול מ-10 דציבלים. לאחר מכן חסום כמחצית מכל קורה שהוחזרה עם בלוקים של קורות קצה סכין.
כוונן את גושי האלומה עד שההספק האופטי הנמדד בכל סיב יהיה כמחצית מההספק לפני החסימה. ודא שרוחב הפס וקצב הדגימה של האוסילוסקופ גבוהים מספיק כדי לא להשפיע על רזולוציית התמונה. כדי להתחיל בניסוי, יש לדלל דגימות תאים בין 10 ל-5 ו-10 עד 6 תאים למיליליטר עם מי מלח או מי מעיין חוצצים פוספט.
לאחר מכן טען את תמיסת התא למזרק של 10 מיליליטר. חבר את המזרק לכניסת התעלה המיקרופלואידית. כוון את יציאת התעלה המיקרופלואידית לצינור צנטריפוגה.
אבטח את המזרק במשאבת מזרק והגדר את קצב הזרימה בהתאם לרוחב התעלה. בחר את מספר נקודות הנתונים שיישמרו עבור הניסוי. לאחר מכן רכוש ושמור את נתוני האות האופטי.
דיגיטציה וייצוא של הנתונים מהאוסצילוסקופ למחשב. עבד את הנתונים לתמונות דו-ממדיות וחלץ ספריית פרמטרים מהתמונות. ייבא את התמונות בספריית הפרמטרים לתוכנית הדמיה.
הקצה פרמטר מעניין לכל ציר ובחר את מערך הנתונים שיוצג כתרשים פיזור. בדוק את תמונות התאים המשויכות לכל קבוצה בתרשים כדי לזהות מגמות. השתמש בשער ידני או הצג מערכי נתונים נוספים לניתוח נוסף לפי הצורך.
ATOM שימש לרכישת תמונות חד-תאיות בניגודיות גבוהה של תאים אנושיים ופיטופלנקטון. מבני תאים אופייניים כמו ואקולים, פירנואידים ודגלים, נראים בתמונות הפיטופלנקטון. פרמטרים כמו גודל התא ומעגליות נקבעו מתמונות ה-ATOM כדי לסווג תאים לניתוח ציטומטרי.
ניתן להציג את תוצאות הסיווג כעלילות פיזור דו-ממדיות. כאן תוכנן נפח לעומת מעגליות עבור MCF7 המוצג בצהוב ו-PBMC מוצג באדום. שני אשכולות נצפו עבור MCF7.
על ידי זיהוי התמונות בניגודיות גבוהה המתאימות לנקודות נתונים בודדות, נמצא כי האשכול התחתון תואם לשברי תאים ופסולת. לאחר השליטה ניתן להגדיר את מערכת ההדמיה תוך שעתיים-שלוש אם היא מבוצעת כראוי. ניתן לבצע את הליכי ההדמיה תוך שעה.
אל תשכח להקדיש תשומת לב מיוחדת לבטיחות העיניים בזמן העבודה עם מקור הלייזר ויישור קרן הלייזר. תמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון הרכבת משקפי מגן בעת ביצוע הליכים אלה. בעת ניסיון הליך זה, זכור לנטר את יישור האלומה האופטית לאורך כל תהליך הגדרת מערכת ההדמיה כדי להבטיח איכות הדמיה אופטימלית.
בעוד שטכניקה זו יכולה להעניק תובנה לגבי זיהוי וכימות של תאים נדירים או לכאורה במהלך תהליך המחלה, ניתן ליישם אותה גם על סיווג סוגי תאים, בתוך אוכלוסיות תאים גדולות והטרוגניות. טכניקה זו מועילה במיוחד כאשר מחפשים להתגבר על מגבלת התפוקה של ציטומטריית הדמיה, תוך שמירה על איכות התמונה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליישם ATOM מהגדרת המערכת ועד להליכי ההדמיה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
פרוטוקול זה מתאר את יישום מערכת מיקרוסקופיה אופטית למתיחת זמן בעלת זיהוי אסימטרי עבור הדמיה של תאים בודדים בעלי ניגודיות גבוהה ללא תווית בזרימה מיקרו-נוזלית אולטרה-מהירה. מערכת ה-ATOM מאפשרת לכידת תמונות אולטרה-מהירה ומשפרת את ניגודיות התמונה על תאים ללא תווית, ומאפשרת ניתוח מורפולוגי מורכב.
ATOM addresses the throughput limitation of imaging flow cytometry by enabling high-speed, label-free single-cell imaging at up to 100,000 cells per second while preserving sub-cellular resolution and image contrast. This capability supports high-confidence statistical analysis through multidimensional morphological data, directly enhancing target validation and phenotypic screening in early discovery. By providing label-free biophysical phenotyping, ATOM complements biochemical assays and improves predictive confidence in cellular classification within heterogeneous populations.
ATOM integrates into the discovery continuum from hypothesis testing in early discovery to lead identification and preclinical validation, providing label-free imaging that supports mechanistic de-risking and predictive analytics.