הרומן כיתה קלינית שיטת בידוד תאי סטרומה Perivascular כליה אנושית
7 באוגוסט 2017
כאן אנו מציגים כיתה קליניים הרומן בידוד ותרבות שיטה כליות Perivascular סטרומה תאים (kPSCs) המבוסס על כל האיבר זלוף עם אנזימי עיכול והעשרה תא NG2. בשיטה זו, אפשרי לרכוש מספרי הטלפון הנייד מספיק לתרפיה תאית.
המטרה הכוללת של שיטת בידוד זו בדרגה קלינית היא לבודד תאי סטרומה פרי-וסקולריים מהכליה האנושית, או kPSC, לצורך טיפול תאי במגוון מחלות כליה. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הרפואה הרגנרטיבית, כגון זיהוי תאי kPSCs אנושיים המתאימים לטיפול תאי במחלות כליה ולהשתלה. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם היותה קלינית, והיכולת להשתמש בה כדי להפיק מספר מספיק של תאי kPSCs למטרות טיפול תאי.
אלן ליברס, טכנאית במעבדתנו, תדגים את הבדיקה התפקודית של kPSCs. לפני תחילת הליך בידוד תאי הכליה, חברו מגש פרפוזיה סטרילי למקלח מים במצב אנכי. כאשר מגש הפרפוזיה יחומם על ידי המים, העבירו את המגש למצב אופקי, תוך שהיא עדיין מחוברת למקלח המים, ולאחר מכן הכניסו צינור L/S 25 למשאבה.
הנח את פינצטת התרביות בקצה אחד של הצינור ואפשר לצינור להישען על תחתית המגש. הנח גזה סטרילית על גבי הצינור כדי למנוע חסימה, וחבר מחבר luer לקצה השני של הצינור, לאחר מכן הוסף כ-100 milliliters של מצע למגש והתחל בשטיפת צינור L/S 25 במהירות משאבה של 100 milliliters לדקה. כדי לבודד את תאי הכליה, העבר את הכליה מהשקיות הסטריליות הכפולות אל מגש הפרפוזיה הסטרילי, והסר את רקמת השומן הפרי-רנלית ואת קפסולת הכליה באמצעות מספריים וקריעה עדינה.
לאחר איתור העורק הכליתי בטלאי האורטי, השתמש במסמר העזר כדי לבצע קניולציה לעורק הכליתי, ואבטח את המסמר באמצעות אזיק sterilized tie wrap. כאשר המשאבה פועלת, חבר את קצה צינור המשאבה למחבר הלור (luer connector). שטוף את הכליה עם המצע הנמצא במגש בקצב זרימה של 100 milliliter per minute.
בשלב הבא, הוסיפו 20 milliliters של collagenase ו-2.5 milliliters של DNAse למגש הפרפוזיה, ואפשרו לאנזימים לעיכל את הכליה, תוך סיבוב עדין של האיבר ביד מדי פעם עד שיהיה רך ונוזל הפרפוזיה יתחיל להפוך למעכיר. משך העיכול על ידי ה-collagenase הוא קריטי; זמן קצר מדי יוביל להיווצרות גושי תאים, בעוד שזמן ארוך מדי יוביל למות תאים. בסיום הפרפוזיה האנזימטית, עסו בעדינות את הכליה עד לקבלת תגסוס תאים, והסִירו את החומר שלא עובד עיכול ואת ה-spike.
הוסיפו 50 milliliters של סרום אנושי נורמלי לתליה התאית, ולאחר מכן, כאשר המשאבה פועלת בקצב זרימה נמוך, מקמו את הפחית המחוברת לכליה מעל מספר פחיות איסוף של 50 milliliters כדי לאפשר לתליה התאית להתנקז מתוך מגש הפרפוזיה אל פחיות האיסוף. כאשר כל התאים נאספו, סובבו את התלייות התאיות בצנטריפוגה, ושטפו את המשקעים פעמיים עם תוכה לשטיפה, המועשר ב-10% סרום אנושי נורמלי. לאחר השטיפה השנייה, השביו את המשקעים בנפח של תוך גידול תאים השווה לנפח המשקעים התאיים.
כדי לגדל את תאי הכליה הגולמיים, הוסיפו כ-1 milliliters של תרחיף תאים ל-24 milliliters של מצע גידול תאים alpha-MEM עם 5% platelet lysate לכל בקבוק תרבית T 175, והדגירו את הבקבוקים בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide. לאחר יומיים הסירו את הנוזל העליון (supernatant) ואת שאריות התאים, והזינו את התאים ב-25 milliliters של מצע גידול תאים טרי. כאשר התאים מגיעים למצב של התמסגרות (confluence), בודדו את הפראקציה החיובית ל-NG2 באמצעות הפרדה מגנטית של תאים, בהתאם לפרוטוקולים סטנדרטיים.
לאחר מכן, זרע 4×10³ תאים חיוביים ל-NG2 לסמ"ר בבבקבוק תרבית תאים בגודל מתאים, והנח את הבבקבוק באינקובטור לתרבית תאים. כאשר התאים מגיעים ל-90% עד 100% התלכדות (confluency), אסוף את העליון (supernatant) ושטוף את התאים הדבקים פעמיים ב-PBS.נתק את התאים באמצעות נפח מתאים של trypsin בהתאם לגודל הבבקבוק, ועצור את התגובה באמצעות העליון ששומר בצד לאחר חמש דקות.
שחזרו בעדינות את התאים, לאחר מכן העבירו את תגסוס התאים למבחנה קונית בגודל מתאים לצנטריפוגה, וזרעו את התאים מחדש בצפיפות של 4 × 10³ תאים לסמ"ר. לעיתים, לאחר העשרה של NG2, התאים מפסיקים להתרבות או מתחילים לגדול במבנים תלת-ממדיים. ניתן לפתור זאת על ידי ביצוע טריפסינציה לתאים וזריעתם מחדש.
לאחר ארבעה עד חמישה מעברים, זרעו את ה-kPSCs בצלחת שש-בארות בריכוז של 2×10⁵ תאים ל-2 milliliters של מצע לכל בארה, וזרעו 5×10⁵ תאי אפיתל תעלתיים פרוקסימליים ב-2 milliliters של מצע תאי אפיתל תעלתיים פרוקסימליים לכל בארה בצלחת שש-בארות נפרדת. הניחו את שתי הצלחות באינקובטור לתרביות תאים למשך 48 שעות, וגבו את העליון (supernatant) של תאי ה-kPSC בסיום הדגירה; לאחר מכן, הסירו את העליון של תאי האפיתל התעלתיים הפרוקסימליים והשתמשו בקצה פיפטה צהוב כדי ליצור שריטה בשכבת התאים החד-שכבתיים בתחתית כל בארה. שטפו את התאים שנשרטו ב-PBS, והוסיפו את המצע המותנה (conditioned medium) מתרביות תאי הסטרומה הווסקולריים של הכליה.
לאחר מכן, דמיינו את השריטה לאחר ארבע, שמונה, 12 ו-24 שעות באותה נקודה מסומנת באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר (brightfield) הפוך, כדי להעריך את אחוז הסגירה לאורך זמן. תאי סטרומה פרי-וסקולריים של הכליה הם תאים בעלי צורת כישור הנצמדים לפלסטיק, שהם חיוביים לסממנים של תאי סטרומה ותאים פרי-וסקולריים, ושליליים לסממנים CD31, CD34, CD45 ו-HLA-DR. בדרך כלל ניתן להגיע לאוכלוסייה הומוגנית של תאי סטרומה פרי-וסקולריים של הכליה במעבר (passage) רביעי, כאשר התאים מגיעים לשלב של סנסנציה (הזדקנות תאית) סביב מעבר 9 עד 10.
בבדיקת שריטת פצע מייצגת זו, להערכת היכולת התפקודית של ה-kPSCs, כאשר הוסף מדיום מותנה מתרבית של תאי סטרומה פרי-וסקולריים של הכליה, הפצע נסגר באופן משמעותי מהר יותר מאשר בבארים שגודלו עם מדיום ביקורת. לאחר השליטה בטכניקת הבידוד הראשוני, שתארך כשעתיים, יידרשו חודש עד חודשיים כדי להפיק אוכלוסיית kPSC הומוגנית. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להפסיק את הטיפול ב-collagenase ברגע שהכליה הופכת לרכה והנוזלים הופכים לפחות שקופים.
בנוסף לנהלים המוצגים כאן, ניתן להשתמש בטכניקות אלו גם לבידוד תאי סטרומה פרי-וסקולריים מאיברים מוצקים אחרים. ניתן להשתמש ב-kPSCs שבודדו בטכניקה זו כדי לחקור את הפוטנציאל הרגנרטיבי של תאים אלו במספר מודלים שונים של מחלות כליות והשתלות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להיות מסוגלים לבודד ולתרבת kPSCs בסטנדרט קליני.
אל תשכחו שעבודה עם חומרים אנושיים טומנת בחובה סיכון להעברת נגיפים; יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון בדיקה ל-HIV, הפטיטיס B והפטיטיס C, בעת ביצוע פרוצדורה זו.
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה בדרגה קלינית לבידוד וגידול של תאי סטרומה פרי-וסקולריים של הכליה (kPSCs) באמצעות פרפוזיה של איבר שלם והעשרה של תאי NG2. הטכניקה מאפשרת הפקת כמות מספקת של kPSCs עבור טיפולים תאיים פוטנציאליים במחלות כליה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- רפואה רגנרטיבית
- טיפול תאי
- טיפול במחלות כליות
רקע
- תאים סטרומליים פריווסקולריים של הכליה (kPSCs) ממלאים תפקיד בבריאות ובמחלות של הכליה.
- בידוד של kPSCs הוא חיוני לפיתוח טיפולים תאיים.
- ייתכן ששיטות נוכחיות אינן מניבות כמויות תאים מספיקות לשימוש טיפולי.
- מחקר זה מציג טכניקת בידוד חדשנית כדי לגשר על פער זה.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהימנה לבידוד kPSCs מכליות אנוש.
- סיוע למחקר ברפואה רגנרטיבית ובטיפולים למחלות כליות.
- הבטחה כי השיטה ניתנת ליישום קליני לשימוש טיפולי עתידי.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- פרופוזיה של איבר שלם עם אנזימים מעכלים.
- העשרה של תאי NG2 לצורך בידוד אוכלוסיות תאים ספציפיות.
- בדיקה תפקודית של kPSCs מבודדים.
- הערכת שגשוג תאים ויכולת תפקודית באמצעות בדיקות שריטה (scratch assays).
תוצאות עיקריות
- שיטת הבידוד מייצרת בהצלחה אוכלוסייה הומוגנית של kPSCs.
- kPSCs מראים קיבולת תפקודית משמעותית במבחני ריפוי פצעים.
- נקבעו תנאים אופטימליים לעיכול באמצעות קולגנז.
- התאים הגיעו למצב של סנסינסס (הזדקנות תאית) סביב מעבר תשע עד עשרה.
מסקנות
- שיטת הבידוד החדשנית יעילה להשגת kPSCs.
- טכניקה זו יכולה לתמוך במחקרים ובטיפולים עתידיים למחלות כליה.
- נדרשים מחקרים נוספים כדי לבחון את מלוא הפוטנציאל הטיפולי של kPSCs.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו לבידוד ברמה קלינית מאפשרת ייצור בר-הרחבה של תאי סטרומה פרי-וסקולריים של כליה אנושית (kPSCs) עבור יישומים ברפואה רגנרטיבית. הגישה נותנת מענה לבחורי צוואר קריטיים בפיתוח טיפולים תאיים על ידי אספקת זרימת עבודה הניתנת לשחזור להשגת כמויות תאים רלוונטיות טיפולית מכליות אנושיות בדרגת השתלה. באמצעות הקמת תהליך עבודה החל מעיבוד הרקמה ועד לתיקוף פונקציונלי, השיטה תומכת בהפחתת סיכונים בשלבים הפרה-קליניים ובהמשכיות תרגומית עבור התערבויות במחלות כליה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של השתייכות (crosstalk) בין תאי סטרומה לתאי אפיתל בהומאוסטזיס של רקמת הכליה ובמנגנוני תיקון.
- ערך תפעולי: מספק מקור סטנדרטי של MSCs ספציפיים לרקמה לצורך תיקוף מטרות במודלים של פתופיזיולוגיה כלייתית.
- ערך חיזוי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי בידוד אוכלוסיית תאים בעלת פעילות מוכחת של ריפוי פצעים אפיתליאליים, העולה על זו של MSCs ממחול השומן.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: ייצור של kPSCs עשירים ב-NG2 המתאימים לבדיקות תפקודיות סטנדרטיות למדידת השפעות רגנרטיביות פראקריניות.
- ערך תפעולי: ביסוס פרוטוקול בידוד ניתן להרחבה המספק מספר תאים מספיק לסריקה בסביבה של תפוקה גבוהה של מודולטורים טיפוליים.
- מוכנות לבדיקה: ייצור של תאים בעלי צורה כישכית והנצמדים לפלסטיק, עם פרופילי סמנים מוגדרים (CD31-/CD34-/CD45-/HLA-DR-) עבור קלטים עקביים לבדיקה.
מחקר תרגומי וטרום-קליני
- רלוונטיות למחלה: מספק kPSCs שהוכח כי הם משפרים פגיעות בכליות in vivo לצורך בדיקת יעילות פרה-קלינית.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין תובנות מכניסטיות משלב הגילוי למודלים פרה-קליניים באמצעות מקור תאים רלוונטי מבחינה קלינית.
- קידום מותאם סיכון: מאפשר הערכה של גורמים פראקריניים של kPSC במבחני ריפוי פצעים כסמן ביולוגי חזוי לפוטנציאל של תיקון רקמה.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מעיבוד רקמה ראשוני, דרך זיהוי מועמדים של מתווכים פאראקריניים, ועד לאימות פרה-קליני של יעילות טיפולית במודלים של מחלות כליות.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות לגבי תפקידם של תאי סטרומה פרי-וסקולריים ברגנרציה של הכליה באמצעות העשרה מבוססת NG2.
- סריקה: מספקת תכשירים סטנדרטיים של kPSC להערכה כמותית של השפעות מדיום מותנה על נדידה של תאים אפיתליאליים.
- אנליטיקה: מאפשרת כימות של אחוזי סגירת פצע בשיטת time-lapse כמדד תפקודי לעוצמה טיפולית.
- מחקר תרגומי: מקשר בין kPSCs מבודדים למודלים פרה-קליניים באמצעות הדגמה של שיפור פגיעות בכליה in vivo.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה של פרפוזיה והעשרה הניתנת להתאמה לבידוד תאי סטרומה פרי-וסקולריים מאיברים מוצקים אחרים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק תובנות מכניסטיות לגבי תפקודי תאי סטרומה ספציפיים לרקמה, תוך הפחתת העמימות הנובעת מאוכלוסיות MSC הטרוגניות.
- ערך תפעולי: מספק תהליך בר-שחזור ובדרגה קלינית ליצירת כמויות של kPSC בקנה מידה טיפולי מאיברי תורמים אנושיים.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) על ידי מתן אפשרות להערכה מוקדמת של העליונות התפקודית של kPSC על פני מקורות תאי סטרומה חלופיים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון של טיפולים תאיים המכוונים לכליה, באמצעות בידוד מאושר ואפיון תפקודי.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות של פירפוזיה של איבר שלם ואופטימיזציה של עיכול אנזימטי של רקמות.
- תלוי בגישה למערכות פירפוזיה סטריליות, ריאגנטים של collagenase/DNase ותשתיות להפרדה מגנטית של תאים.
- מחייב פרוטוקולים סטנדרטיים לבידוד והרחבה של תאים חיוביים ל-NG2 כדי למנוע כשל בתרבית בשל הזדקנות תאית.
- כולל שיקולי התאמה לשמירה על יציבות פנוטיפית של kPSC לאורך מעברים ושונות בין תורמים.
- כולל מגבלות מעשיות כגון רגישות לעיתוי עיכול ה-collagenase כדי למנוע התגבשות או מוות של תאים.
