Name: אינדוקציה של דיפרנציאציה נייד תא הדמיה אחת של Vibrio parahaemolyticus שחיין ותאי נחיל (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: למד אינדוקציה של דיפרננציאציה תאית ב-Vibrio parahaemolyticus לתאי נחיל לצורך מיקרוסקופיית פלואורסצנציה של תא בודד. שיטה זו מאפשרת חקר ארגון תוך-תאי במהלך מורפוגנזה בקטריאלית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי מקס פלאנק החברה.

<ol><li>McCarter, L., Hilmen, M., Silverman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flagellar+dynamometer+controls+swarmer+cell+differentiation+of+V.+parahaemolyticus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Flagellar dynamometer controls swarmer cell differentiation of V. parahaemolyticus.</a> Cell. 54 (3), 345-351 (1988).</li>
<li>Kawagishi, I., Imagawa, M., Imae, Y., McCarter, L., Homma, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sodium-driven+polar+flagellar+motor+of+marine+Vibrio+as+the+mechanosensor+that+regulates+lateral+flagellar+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The sodium-driven polar flagellar motor of marine Vibrio as the mechanosensor that regulates lateral flagellar expression.</a> Mol. Microbiol. 20 (4), 693-699 (1996).</li>
<li>Ulitzur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+swarming+in+Vibrio+parahaemolyticus%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Induction of swarming in Vibrio parahaemolyticus.</a> Arch. Microbiol. 101 (4), 357-363 (1974).</li>
<li>Ulitzur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+temperature%2C+salts%2C+pH%2C+and+other+factors+on+the+development+of+peritrichous+flagella+in+Vibrio+alginolyticus%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Effect of temperature, salts, pH, and other factors on the development of peritrichous flagella in Vibrio alginolyticus.</a> Arch. Microbiol. 104 (3), 285-288 (1975).</li>
<li>Ulitzur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+swarming+of+Vibrio+alginolyticus%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The mechanism of swarming of Vibrio alginolyticus.</a> Arch. Microbiol. 104 (1), 67-71 (1975).</li>
<li>Gode-Potratz, C. J., Chodur, D. M., McCarter, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+iron+regulate+swarming+and+type+III+secretion+in+Vibrio+parahaemolyticus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Calcium and iron regulate swarming and type III secretion in Vibrio parahaemolyticus.</a> J. Bacteriol. 192 (22), 6025-6038 (2010).</li>
<li>McCarter, L., Silverman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+regulation+of+swarmer+cell+differentiation+of+Vibrio+parahaemolyticus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Iron regulation of swarmer cell differentiation of Vibrio parahaemolyticus.</a> J. Bacteriol. 171 (2), 731-736 (1989).</li>
<li>Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+sensing+in+Vibrio+parahaemolyticus+triggers+a+programme+of+gene+expression+that+promotes+colonization+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence.</a> Mol. Microbiol. 79 (1), 240-263 (2011).</li>
<li>Heering, J., Ringgaard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Localization+of+Chemotactic+Signaling+Arrays+during+the+Lifecycle+of+Vibrio+parahaemolyticus%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Differential Localization of Chemotactic Signaling Arrays during the Lifecycle of Vibrio parahaemolyticus.</a> Front Microbiol. 7 (November), 1-12 (2016).</li>
<li>Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zupan, J. R., Zik, J. J., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycan+synthesis+machinery+in+Agrobacterium+tumefaciens+during+unipolar+growth+and+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycan synthesis machinery in Agrobacterium tumefaciens during unipolar growth and cell division.</a> mBio. 5 (3), (2014).</li>
<li>Development Core Team, R. F. F. S. C. <a target="_blank" href="https://www.r-project.org/">R: A Language and Environment for Statistical Computing.</a> R Foundation for Statistical Computing. 1, 2673(2008).</li>
<li>Ringgaard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ParP+prevents+dissociation+of+CheA+from+chemotactic+signaling+arrays+and+tethers+them+to+a+polar+anchor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">ParP prevents dissociation of CheA from chemotactic signaling arrays and tethers them to a polar anchor.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (2), E255-E264 (2014).</li>
<li>Ringgaard, S., Schirner, K., Davis, B. M., Waldor, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+family+of+ParA-like+ATPases+promotes+cell+pole+maturation+by+facilitating+polar+localization+of+chemotaxis+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A family of ParA-like ATPases promotes cell pole maturation by facilitating polar localization of chemotaxis proteins.</a> Genes Dev. 25, 1544-1555 (2011).</li>
<li>Vischer, N. O. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+age+dependent+concentration+of+Escherichia+coli+divisome+proteins+analyzed+with+ImageJ+and+ObjectJ%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cell age dependent concentration of Escherichia coli divisome proteins analyzed with ImageJ and ObjectJ.</a> Front Microbiol. 6 (JUN), (2015).</li>
<li>Schneider, C. a, Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput%2C+subpixel+precision+analysis+of+bacterial+morphogenesis+and+intracellular+spatio-temporal+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">High-throughput, subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics.</a> Mol. Microbiol. 80 (3), 612-627 (2011).</li>
<li>Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicrobeJ%2C+a+tool+for+high+throughput+bacterial+cell+detection+and+quantitative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis.</a> Nat. Microbiol. 1, 16077(2016).</li>
<li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7 (10), R100(2006).</li>
<li>Morales-Soto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation%2C+Imaging%2C+and+Quantification+of+Bacterial+Surface+Motility+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays.</a> J. Vis. Exp. (98), e52338(2015).</li>
<li>Paintdakhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oufti%3A+An+integrated+software+package+for+high-accuracy%2C+high-throughput+quantitative+microscopy+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis.</a> Mol. Microbiol. 99 (4), 767-777 (2016).</li>
<li>de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Cell+Imaging+of+Bacillus+subtilis+and+Streptococcus+pneumoniae+using+Automated+Time-lapse+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (53), e1-e6 (2011).</li>
</ol>

שום ניגוד אינטרסים לא הכריז.

מאמר זה מדווח על שיטת הדמיה מיקרוסקופית של תאים V. parahaemolyticus swarmer , ואחריו מנתח במורד המיועד לפתור לכמת את לוקליזציה subcellular ותכונות אחרות של חלבונים שנחקרו fluorescently שכותרתו. למרות מספר כלים קיימים לעיבוד תמונה מיקרוסקופית וניתוח 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , ניתוח של תאים בתאי V. parahaemolyt...

חיידקים כל הזמן חווים שינויים בסביבה החיצונית שלהם פיתחו מספר טכניקות לשנות ולהתאים את התנהגותם בהתאם. מנגנון אחד כזה כולל את ההבחנה לסוגים שונים של תאים המשלימים טוב יותר את הסביבה המשתנה. בידול לעיתים קרובות כרוך שינויים גדולים הרגולציה של מחזור התא, מורפולוגיה התא, ואת הארגון spatiotemporal של התאים. אורגניזם אחד שיכול לעבור בידול הוא Vibrio parahaemolyticus . V. parahaemolyticus שייך Vibrionaceae , אשר משפחה של proteobacteria כי בדרך כלל מים טריים או מלוחים. Vibrionaceae מופצים באופן נרחב בסביבה וכוללים מספר מינים הגורמים זיהומים בדרכי העיכול בבני אדם, כולל גם cholerae.V Vibrio. Parahaemolyticus הוא אורגניזם dimorphic והוא מסוגל להבדיל לשני סוגי תאים נפרדים כתגובה כדי להתאים את השינויים שלהסביבה חיצונית. בסביבות מימיות, הוא קיים כמו תא שוחה קצר בצורת מוט עם דגלום קוטב יחיד ממוקם על עמוד התא הישן. על פני השטח מגע, בידול לתא swarmer מופעלת. הבדל תאים swarmer כוללת שני שינויים עיקריים: morphogenesis תא swarmer באמצעות עיכוב חלוקת התא, ואת אינדוקציה של מערכת השני flagella. התוצאה היא היווצרותו של תא נחיל, בעל צורה מוטורית ואורך מוארך, אשר יכול להמשיך את סגנון החיים של נחיל, שבו אירועים של חלוקה מביאים לתאי נחילים, או לחילופין להבדיל חזרה לתאי שחיינים. מספר גורמים דווחו כדי להשפיע או להשפיע על בידול swarmer. הגירוי העיקרי נראה מונע על ידי mechanosensing שבו V. parahaemolyticus משתמש flagell הקוטב כחיישן מישוש המזהה עיכוב של סיבוב על פני השטח קשר, אבל גורמים נוספים מעורבים כמוטוב 1 . במעבדה, סיבוב של דגלום הקוטב יכול להיות מעוכבת באופן מלאכותי על ידי תוספת של phenamil, אשר חוסם את ערוץ הנתרן מונע סיבוב flagellar, ובכך לגרום swarmer differiation 2 . יתר על כן, במחקר מוקדם יותר, Vibrio alginolyticus היה המושרה נחיל על מדיה מוצקה כאשר תאים היו מופצות על המדיום צמיחה בצלחת פטרי חתום עם קלטת פלסטיק ברורה. נייר סינון רווי אלקלי מונע התנפחות תחת תנאים אלה, ומכאן טוען כי אחד או יותר חומצות נדיפות עשוי להיות מעורב אינדוקציה של נחיל. לפיכך, איטום צלחת פטרי עם קלטת פלסטיק מותר ככל הנראה על הצטברות של חומצות נדיפות, נוצר כמו תוצרי לוואי של חילוף החומרים הסלולרי, בתוך שטח הראש של הצלחת. אותו אפקט הושג כאשר H 2 O 2 נוספה בינוני הצמיחה במנות אטום אטום על מנת לייצר באופן מלאכותי חומצות נדיפות ידי hydrolysing רכיבי מדיה <supClass = &quot;xref&quot;&gt; 3 , 4 , 5 . עם זאת, הזהות של חומצות נדיפות כאלה עדיין לא ידוע. יתר על כן, הוכח כי זמינות עודפת של סידן 6 ו-הגבלה ברזל 7 הן לשפר את הבדל swarmer והתפשטות על פני משטחים מוצקים. תאים ניתן לרעב ברזל על ידי הוספת המתחם 2,2&#39;-Bipyridyl למדיום הצמיחה, אשר הוכח להשפיע על בידול swarmer 8 . הגורמים ידועים לוויסות בידול מיושמים עכשיו בעיצוב של פרוטוקול זה reproducibly גורם V. parahaemolyticus בידול לתוך תאים swarmer ואת התפשטות שלהם על משטחים אגר מוצק. V. parahaemolyticus בידול כוללת שינויים משמעותיים ויסות חלוקת התא, מורפולוגיה הסלולר, ואת המיקום של מכונות macromolecular כגון flagellA ו chemotaxis מנגנוני - תהליכים שדורשים כל לוקליזציה ספציפית של חלבונים בהתאם מחזור התא. לכן, היכולת ללמוד את לוקליזציה תאיים של חלבונים כאלה חיונית להבנת התהליכים הסלולר הנ&quot;ל. על מנת לבצע מחקרים כאלה מיקרוסקופ פלואורסצנטי על תאים בודדים נדרשת. זה יכול להיות מאתגר במיוחד כאשר תאים הדמיה הקיימות בתוך אוכלוסיות חיידקים צפופים, כמו במקרה של תאים swarmer. היו ניסיונות לגרום להבדל swarmer בתקשורת נוזלית, אשר יכול ליצור תאים בודדים למחקרים מיקרוסקופיים. ואף על ברמת תעתיק תאים אלה גרמו חלקית את התוכנית swarmer-differentiation, הם לא עוברים את אותם שינויים מורפולוגיים ברורים כמו תאים נבדל מובחן לחלוטין גדל על בינוני מוצק 8 . מאמר זה מציע פרוטוקול חזק לשחזור של שיטה כדי לגרום swarmer CELl הבחנה על פני אגר. הפרוטוקול מייצר אוכלוסייה של תאים swarmer נגיש בקלות זמין עבור מיקרוסקופ תא בודד וניתוח לאחר מכן. יתר על כן, הפרוטוקול מאפשר מחקרים לוקליזציה של חלבונים שכותרתו fluorescently בשחיין סוגי התאים swarmer (סעיפים 1, 2, 3, 4). בנוסף, פרוטוקול מתאר את זרימת העבודה הבאים על איך לעבד ולנתח את הנתונים שנוצר ניסויים מיקרוסקופ פלואורסצנטי, המאפשר ניתוח דמוגרפי של חברות חיידקים (סעיף 5).

<table><tbody><tr><td><חזק>רכיבי מדיה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB בינוני</td><td>Roth</td><td>X968.3</td><td></td></tr><tr><td>Difco Agar, מגורען</td><td>BD</td><td>214510</td><td>להכנת אגר LB עם LB</td></tr><tr><td>בינוני Difco Heart Infusion Agar</td><td>BD</td><td>244400</td><td>להכנת צלחות נחיל HI אגר</td></tr><tr><td>Agarose NEEO, רוט איכותי במיוחד</td><td></td><td>2267.3</td><td>להכנת מיקרוסקופיה רפידות אגרוז</td></tr> <tr><td>שם</td><td>חברה</td><td>מספר קטלוגי</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>תוספים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-arabinose</td><td>Roth</td><td>5118.3</td><td>משמש להשראת נגזרות pBAD</td></tr><tr><td>2,2'-Bipyridyl</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>D216305-25G</td><td>להכנת צלחות נחיל HI אגר</td></tr><tr><td>סידן כלוריד דיהידראט</td><td>רוט</td><td>5239.1</td><td>להכנת צלחות נחיל HI אגר</td></tr><tr><td>מלח נתרן אמפיצילין</td><td>רוט</td><td>K029.3</td><td></td></tr><tr><td>כלורמפניקול</td><td>רוט</td><td>3886.3</td><td></td></tr><tr><td>PBS מאגר</td> <td>-</td><td></td> <td>מתכון סטנדרטי למי מלח</td></tr> <tr>חוצץ פוספט<td>D(+) סוכרוז</td><td>רוט</td><td>4621.1</td><td>להכנת תאים בעלי יכולת חשמלית</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>רוט</td><td>3783.5</td><td>להכנת תאים בעלי יכולת חשמלית</td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>הערות</חזק></td></tr><tr><td><חזק>חומרה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי 150 מ"מ על 20 מ"מ עם מצלמות</td><td>Sarstedt</td><td>82.1184.500</td><td>להכנת צלחות נחיל HI אגר</td></tr><tr><td>kelvitron t (B 6420)</td> <td>Heraeus-משמש</td><td></td> <td>לייבוש צלחות נחיל HI agar</td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell Microbial System</td><td>BioRad</td><td>1652662</td><td>משמש לאלקטרופורה של DNA פלסמיד</td></tr> <tr><td>שם<</td><td>strong>חברה</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph Offline (גרסה 7.7.5.0)</td><td>התקנים מולקולריים-בשימוש</td><td></td> <td>לניתוח תמונות מיקרוסקופיה</td></tr><tr><td>Excel</td><td></td> <td>Microsoft-משמש</td> <td>לאנלזה של נתוני מיקרוסקופיה</td></tr></tbody></table>

אינדוקציה של דיפרנציאציה נייד תא הדמיה אחת של<em&gt; vibrio parahaemolyticus</em&gt; שחיין ותאי נחיל

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

היכולת ללמוד את לוקליזציה תאיים של חלבונים חיונית להבנה של תהליכים סלולריים רבים. בתורו, זה דורש את היכולת להשיג תאים בודדים עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי, אשר יכול להיות מאתגר במיוחד כאשר תאים הדמיה הקיימות בקהילות חיידקים. לדוגמה, האדם הפתוגן Vibrio parahaemolyticus קיים כמו קצר בצורת מוט שחין בצורת בתנאים נוזליים כי על פני השטח קשר להבדיל subpopulation של תאים swarmer מוארך מאוד התמחה לצמיחה על משטחים מוצקים. מאמר זה מציג שיטה לבצע יחיד תא פלואורסצנטי ניתוח מיקרוסקופ של V. parahaemolyticus בשני מצבי ההפרש שלה. פרוטוקול זה reproducibly מאוד גורם הפרדה של V. parahaemolyticus לתוך מחזור חיי תא מחזורי ומקל על התפשטות שלהם על פני משטחים מוצקים. השיטה מייצרת התפרצויות של תאים swarmer מובחנת המשתרעת מ tהוא קצה של מושבה נחיל. יש לציין, בקצה מאוד של התנפחות- swarm, תאים swarmer קיים בשכבה אחת של תאים, אשר מאפשר העברת קל שלהם שקופיות מיקרוסקופ ולאחר מכן מיקרוסקופ פלואורסצנטי הדמיה של תאים בודדים. בנוסף, זרימת העבודה של ניתוח תמונות עבור ייצוג דמוגרפי של חברות חיידקים מוצג. כהוכחה לעיקרון, ניתוח של לוקליזציה תאיים של chemotaxis איתות מערכים בשחיינים ותאי swarmer של V. parahaemolyticus מתואר.

אינדוקציה של בידול ודור של מושבות נחפזות איור 1 מספק סכימה של השלבים החשובים מעורב בהפקת מושבות נחיל של V. parahaemolyticus ( איור 1A-C ). תרבות שחיינים זוהה על נחיל אגר ו מודגרות על 24 מעלות צלזיוס, גרימת הבדל swarmer והתפשטות על פני השטח אגר מוצק. בתמונה מס &#39;2 מוצג תמונה סטרי...

פרוטוקול זה מאפשר מיקרוסקופית תא בודד של מובחן Vibrio parahaemolyticus שחיין ותאי swarmer . השיטה מייצרת אוכלוסייה של תאים swarmer זמין בקלות עבור ניתוח תא בודד ומכסה הכנה של תרבויות תאים, אינדוקציה של בידול swarmer, הכנת המדגם, ניתוח תמונה.

אינדוקציה של דיפרנציאציה נייד תא הדמיה אחת של<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; שחיין ותאי נחיל

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ...

המטרה הכוללת של שיטה זו היא להשריות דיפרנציאציה תאית של החיידק Vibrio parahaemolyticus ויצירת אוכלוסייה של תאי swarmer מבדלים, הזמינים בקלות לניתוח של תא בודד באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה. שיטה זו תסייע למדענים להבין כיצד חיידקים מווסתים את הארגון התוך-תאי במהלך דיפרנציאציה תאית ומורפוגנזה. מכיוון שדימות של תאים בתוך קהילות חיידקים עלול להיות מאתגר, היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מייצרת אוכלוסייה של תאי swarmer מבדלים הקיימים בשכבה של תא בודד, הזמינה בקלות לניתוח במיקרוסקופיה של תא בודד.ההשלכות של טכניקה זו פונות לעבר הבנה טובה יותר של האופן שבו חיידקים מווסתים שינויים במחזור התא, במורפולוגיה של התא ובארגון התוך-תאי במהלך דיפרנציאציה תאית. הדגמה של שיטה זו היא קריטית, שכן השראה אמינה של דיפרנציאציה תאית ויצירת תאים הזמינים לניתוח של תא בודד הן קשות להשגה. כדי להכין את תמיסת האגר עבור פלטות swarming, השעו ארבעה גרמים של heart infusion, או אבקת H.I.agar, ו-100 milliliters של מים מזוקקים פעמיים.הרתיחו בזהירות את תמיסת ה-H.I.agar במיקרוגל, תוך ניעור של הבקבוק מעת לעת עד להמסת האבקה. סטריליקו את תמיסת האגר באוטוקלאב בטמפרטורה של 121 degrees Celsius למשך 20 דקות, וקררו את תמיסת האגר ל-60 t0 65 degrees Celsius תוך ערבוב מתמיד. השלב הבא כולל עבודה עם 2, 2'Bipyridyl, שהוא רעיל ביו

induction-cellular-differentiation-single-cell-imaging-vibrio

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מקור: Heering, J., et al. אינדוקציה של התמיינות תאית והדמיה של תאים בודדים של תאי שחיין ונחיל Vibrio parahaemolyticus . J. Vis. Exp. (2017)סרטון זה מדגים את השראת התמיינות תאי הנחיל ב-Vibrio parahaemolyticus באמצעות מדיום אגר שהוכן במיוחד. על ידי מניפולציה של רמזים סביבתיים כגון דלדול ברזל, תוספת סידן ומגע עם פני השטח, החיידקים מגורים לעבור מצורת השחיין שלהם לתאי נחיל מוארכים עם דגלים לרוחב. תאים מובחנים אלה מתפשטים על פני השטח המוצק, ויוצרים התפרצויות נחיל אופייניות המסמלות שינוי מורפולוגי...

אינדוקציה של התמיינות של Vibrio parahaemolyticus לתאי נחיל

מקור: Heering, J., et al.אינדוקציה של התמיינות תאית והדמיה של תאים בודדים של תאי שחיין ונחיל Vibrio parahaemolyticus ., J. Vis. Exp. (2017).סרטון זה מדגים את הכנת תאי הנחיל ממושבת Vibrio parahaemolyticus להדמיה פלואורסצנטית. החיידקים מהונדסים גנטית כדי לבטא חלבון מתויג פלואורופור שמתמקם באופן חד קוטבי בתאי שחיין ודו קוטבי בתאי נחיל מוארכים, מה שמאפשר את ההתמיינות החזותית שלהם. כרית אגרוז מוכנה על שקופית מיקרוסקופ, שעליה מונח קטע מושבה ומוסר כדי להשאיר תאים דבקים, אשר מכוסים לאחר מכן בכיסוי...

הכנת תאי נחיל Vibrio parahaemolyticus להדמיה

מקור: Morales-Soto, N. et al., הכנה, הדמיה וכימות של מבחני תנועתיות פני השטח של חיידקים. J. Vis. Exp. (2015)סרטון זה מדגים בדיקת נחיל באמצעות חיידקים המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק כדי לצפות בתנועתיות פני השטח על אגר רך. הדמיית זמן-lapse לוכדת התרחבות מתואמת והיווצרות קנוקנות, ומדגישה את תנועתיות פני השטח של החיידקים.

בדיקת נחיל להמחשת תנועתיות פני השטח של חיידקים

תנועתיות הנחיל מושפעת מגורמים פיזיקליים וסביבתיים. אנו מתארים פרוטוקול דו-שלבי והנחיות לעקיפת האתגרים הקשורים בדרך כלל להכנת בדיקת נחילים ואיסוף נתונים. נעשה שימוש בטכניקת הדמיה מקרוסקופית כדי לקבל מידע מפורט על התנהגות נחיל שאינו מסופק על ידי טכניקות הניתוח הנוכחיות.

הכנה, הדמיה, וכימות של מבחני תנועתיות Surface בקטריאלי

תפקידו של מבחר (הפרדה מרחבית) בתרחישים האבולוציונית ניתן לבדוק באמצעות מערכות חיידקים פשוטה במעבדה המאפשרים נשלט התאמת הפריסה המרחבית. על ידי שינוי צפיפות התאים המייסדים, רמות מבחר שונות ניתן מדמיינות באמצעות זני חיידקים שכותרתו fluorescently ב biofilms המושבה של Bacillus subtilis.

ניטור מרחבי הפרדה Surface מיישבים אוכלוסיות מיקרוביאליות

אנו מציגים שיטה לניתוח microfluidic של שושלות בודדים תא החיידק Bacillus subtilis כדוגמא. השיטה מתגבר על החסרונות של שיטות אנליטיות מסורתי במיקרוביולוגיה בכך שהוא מאפשר התבוננות של מאות דורות תא תחת תנאי הגידול בחוזקה לשליטה ואחידה.

ניתוח Microfluidic תא בודד של Bacillus subtilis

הדמיה של תאים חיידקיים היא גישה ביולוגיה מערכות מתפתחים התמקדו הגדרת תהליכים סטטיים ודינאמיים המכתיבים את הפונקציה של מכונות macromolecular גדולות. כאן, שילוב של הדמיה תא כמותי לחיות וטומוגרפיה מסוג ההקפאה משמשת לחקר הלגיונרים האלה הפרשת מערכת הפרשה ופונקציות.

החלת הדמיית תאים בשידור חי וטומוגרפיה ממוחשבת כדי לפתור את התכונות הספאטימיות של הלגיונרים האלה מערכת הפרשות

חיידקים רבים משתמשים בתנועתיות המונעת על ידי פלאגלה כדי לנווט בסביבתם וליישב סביבה נוחה הן בנפרד והן כקולקטיב. הוכח כאן הוא השימוש בשלוש שיטות מבוססות המנצלות תנועתיות ככלי בחירה לזיהוי רכיבים / מסלולים התורמים לשחייה ותנועתיות נחיל.

חקירת תנועתיות מונחית פלאגלה באשריצ'יה קולי על ידי יישום שלוש טכניקות מבוססות בסדרה

פרוטוקול הדמיה זה של תאים חיידקיים חיים מאפשר הדמיה של אינטראקציות בין מינים חיידקיים מרובים ברמת תא יחיד לאורך זמן. הדמיה של זמן-לשגות מאפשרת להתבוננות של כל מין חיידקי במונוקולטורה או coculture לחקור אינטראקציות בין מינים בקהילות חיידקים מרובי מינים, כולל תנוענות תאים בודדים וכדאיות.

הדמיה קינטית של אינטראקציות חיידקים בין-מינים חד-תאיים

כאן, אנו מתארים את השימוש בלוחות הדרגתיים ממריצים כדי להעריך את תנועתיות נחיל החיידקים ובו זמנית להשיג תגובות ריכוז מרובות.

כימות תנועתיות נחיל משטח חיידקי על לוחות הדרגתיים ממריץ

סלמונלה פולשת ומשתכפלת בתוך תאי אפיתל מעיים הן בוואקולות ספציפיות לסלמונלה והן בחינם בציטוזול (היפר-שכפול). פרוטוקול מבוסס מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בתפוקה גבוהה מתואר כאן כדי לכמת את הפנוטיפים התוך-תאיים של סלמונלה על ידי שני ניתוחי תמונה משלימים באמצעות ImageJ, המגיעים לרזולוציה של תא בודד וניקוד.

ניתוח אוטומטי של פנוטיפים תוך תאיים של סלמונלה באמצעות ImageJ

למד אינדוקציה של דיפרננציאציה תאית ב-Vibrio parahaemolyticus לתאי נחיל לצורך מיקרוסקופיית פלואורסצנציה של תא בודד. שיטה זו מאפשרת חקר ארגון תוך-תאי במהלך מורפוגנזה בקטריאלית.

אינדוקציה של דיפרנציאציה נייד תא הדמיה אחת של

גלה סרטונים נוספים