אינדוקציה של דיפרנציאציה נייד תא הדמיה אחת של Vibrio parahaemolyticus שחיין ותאי נחיל

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לגרום להתמיינות תאית של החיידק Vibrio parahaemolyticus ויצירת אוכלוסייה של תאי נחיל מובחנים הזמינים בקלות לניתוח תאים בודדים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. שיטה זו תסייע למדענים להבין כיצד חיידקים מווסתים את הארגון התוך תאי במהלך התמיינות תאית ומורפוגנזה. מכיוון שתאי הדמיה בתוך קהילות חיידקים יכולה להיות מאתגרת, היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מייצרת אוכלוסייה של תאי נחיל מובחנים הקיימים בשכבת תא בודדת הזמינה לניתוח מיקרוסקופיה של תא בודד.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות לקראת הבנה טובה יותר של האופן שבו חיידקים מווסתים שינויים במחזור התא, מורפולוגיה של התא וארגון תוך תאי במהלך התמיינות תאית. הדגמה של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה להשיג אינדוקציה אמינה של התמיינות תאים ויצירת תאים זמינים לניתוח תאים בודדים. להכנת תמיסת האגר להכנת צלחות נחילים, השעו ארבעה גרם עירוי לב, או אבקת H.I.agar, ו-100 מיליליטר מים מזוקקים כפולים.

מרתיחים בזהירות את תמיסת H.I.agar במיקרוגל, מנערים את הבקבוק מדי פעם עד להמסת האבקה. חיטוי תמיסת האגר בחום של 121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, מצננים את תמיסת האגר ל 60 t0 65 מעלות צלזיוס תוך ערבוב מתמיד. השלב הבא כולל טיפול ב-2, 2'Bipyridyl, שהוא רעיל מאוד, ולכן יש ללבוש כפפות ומשקפי מגן.

הוסף 2, 2'Bipyridyl לריכוז סופי של 50 מיקרומולר. הוסף סידן כלורי לריכוז סופי של ארבעה מילמולרים. יש לחסן כמות קטנה של תאי V.parahaemolyticus מקצה מושבה בודדת לתוך 5 מיליטרים של מרק LB.

דגרו את התרבית ב-37 מעלות צלזיוס בחממת שייקר עד שהיא מגיעה לצפיפות אופטית של 600 ננומטר של 0.8. זה בדרך כלל לוקח כשעתיים-שלוש. בזמן שתרבית התאים גדלה, פיפטה 30 עד 35 מיליליטר מתמיסת ה-H.I.agar הסופית לצלחת פטרי עגולה של 150 מילימטר, ותן לאגר להתמצק.

ממש לפני שמבחינים בתרבית התאים, יש לייבש את צלחת האגר זקופה עם מכסה פתוח בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפחות, או עד שנעלמו שאריות נוזלים, אך לא עוד. הבחין במיקרוליטר אחד של תרבית תאים במרכז צלחת הנחיל של H.I.agar ותן לנקודה להתייבש. אטום את הצלחת בעזרת סרט פלסטיק שקוף, הקפד למנוע היווצרות בועות אוויר וקפלים לקלטת.

דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 24 מעלות צלזיוס למשך הלילה. זה יביא להיווצרות מושבת נחיל V.Parahaemolyticus עם התפרצויות נחיל המשתרעות ממרכז המושבה, כפי שמוצג בסרטון דולג זמן זה. השלב הראשון בהליך זה הוא הכנת שקופיות אגרוז למיקרוסקופיה.

הוסף גרם אחד של אגרוז ל-100 מיליליטר של תמיסת מרק של 20% PBS ותמיסת מרק של 10% LB. הרתיחו בזהירות את התמיסה במיקרוגל כדי להמיס את האגרוז, ולאחר מכן הניחו לה להתקרר ל-65 עד 70 מעלות צלזיוס תוך ערבוב עם מוט ערבוב מגנטי. הנח שקופית מיקרוסקופ נקייה על קטע ישר לחלוטין של ספסל עבודה.

קבע את השקופית לספסל על ידי כיסוי שני קצוות השקופית בשתי שכבות של סרט תיוג מעבדה לשימוש כללי. המרחק בין שתי חתיכות הקלטת צריך להיות בסביבות שלושה סנטימטרים. פיפטה כ -250 מיקרוליטר מתמיסת האגרוז שהוכנה בעבר על משטח הזכוכית הלא מכוסה.

הנח שקופית מיקרוסקופ שנייה באותו כיוון כמו השקופית התחתונה למעלה ולחץ מעט כלפי מטה כך ששאריות האגרוז יוכלו לזרום החוצה לצדדים. תנו לאגרוז להתמצק במשך דקה עד שתיים. השתמש באזמל כדי לחתוך כל שאריות אגרוז המחוברות לדפנות שקופית המיקרוסקופ.

כאשר האגרוז התמצק, משוך לאט את מגלשת הזכוכית העליונה מהתחתונה בתנועה אופקית. הסר לאט את הסרט מקצות שקופית המיקרוסקופ. יש להשתמש במגלשת האגרוז בהקדם האפשרי, מכיוון שהיא תתחיל להתייבש לאט.

מיד לפני העברת תאי הנחיל לשקופית המיקרוסקופ, השתמש באזמל כדי לחתוך את סרט הפלסטיק מצלחת הנחיל שהוכנה בעבר. במהלך כריתת האגר הנחיל, חשוב לכוון את החיתוך מבחוץ לחלק הפנימי של מושבת הנחיל כדי למנוע זיהום התלקחויות הנחיל בתאים שמקורם במרכז המושבה. השתמש באזמל טרי כדי לחתוך חתיכה של שלושה מילימטר על 10 מילימטר של אגר נחיל מהקצה החיצוני ביותר של מושבת נחילים, והקפד לכוון את החתכים מהחלק החיצוני של קצה מושבת הנחיל לחלק הפנימי של המושבה.

העבירו את חתיכת אגר הנחיל לשקופית האגרוז במיקרוסקופ כשהתאים פונים לכרית האגרוז כדי להטביע את התאים הנחיליים על כרית האגרוז. לאחר המתנה של כ -30 שניות, הסר את חתיכת האגר בזהירות מכרית האגרוז. הנח כיסוי זכוכית על כרית האגרוז שבה הוטבעו התאים.

התאים מוכנים כעת למיקרוסקופיה פלואורסצנטית. הדמיה סטריאו-מיקרוסקופית של מושבת נחיל V.parahaemolyticus בהגדלה הולכת וגדלה מראה התפרצויות נחיל המשתרעות מהפריפריה של מושבת הנחיל. תאים בהתלקחויות מקובצים בשכבות חד-שכבתיות או דו-שכבתיות בלבד, בעוד שתאים באמצע מושבת הנחיל נערמים במספר שכבות.

הדמיית מיקרוסקופיה DIC גילתה שההתלקחויות מורכבות רק מאוכלוסייה מובחנת לחלוטין של תאי נחילים, בעוד שתאים ממרכז מושבת הנחיל קצרים משמעותית, וככל הנראה מייצגים תערובת של תאי שחיין ונחיל. כהוכחה לעיקרון, הדמיית DIC ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית בוצעה על תאי שחיין ונחיל V.Parahaemolyticus מסוג בר, המבטאים באופן אקטופי חלבון כימוטקסיס חיוני, YFP-CheW. בתאי שחיין, YFP-CheW מתמקם בצורה חד קוטבית ודו-קוטבית, אך בתאי נחילים, YFP-CheW תמיד ממוקם דו קוטבי ויוצר גם אשכולות הממוקמים באופן אקראי לאורך התא.

שינויים בדפוס הלוקליזציה של YFP-CheW במהלך התמיינות תאים משחיין לנחיל, הוצגו גם על ידי תצוגות של התפלגות מוקדים וניתוחים דמוגרפיים של פרופילי עוצמת הקרינה. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של התא המיקרוביאלי לחקור כיצד החיידק Vibrio parahaemolyticus מווסת את הארגון הפנימי שלו במהלך המצבים המובחנים של תאי שחיין ונחיל. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לגרום להתמיינות תאית של החיידק Vibrio parahaemolyticus וכיצד להכין אוכלוסייה של תאי נחיל מובחנים לניתוח תאים בודדים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

אל תשכח כי Vibrio parahaemolyticus הוא פתוגן אנושי ויש ליישם נהלים ותקנות מתאימים כיצד לטפל בפתוגנים BSL 2 באזורך.