תלת מימדי רקמות מהונדסים מיושר אסטרוציט רשתות כדי לסכם מנגנונים התפתחותית וכדי להקל על מערכת העצבים התחדשות
10 בינואר 2018
אנחנו ראווה הפיתוח של חבילות שהורכב עצמית, תלת מימדי של somata astrocytic longitudinally מיושר ותהליכים בתוך למטרתו biomaterial הרומן. אלה מהונדסים "חי פיגומים", מפגין בקנה מידה מיקרון קוטר עדיין הארכת ס מ אורך, עשוי לשמש מבחן-מיטות לימוד מנגנוני התפתחותיות או להקל על neuroregeneration על-ידי הגירה העצבית המשגה ו/או עצב pathfinding.
פרוטוקול זה נועד להדריך את ייצורם של צרורים תלת-ממדיים המורכבים מהרכבה עצמית של גופי תאי אסטרוציטים ושל תהליכיהם, המסודרים ביישור אורכי בתוך מיקרו-עמוד של הידרוג'ל בגודל מיקרוני, לשימוש כמודל נוירו-ביולוגי in vitro או כטיפול נוירו-רגנרטיבי. טראומה ומחלות נוירודגנרטיביות גורמות נזק משמעותי לחולים בשל היכולת הנוירוגנית המוגבלת בסביבה מעכבת, המגבילה את הרגנרציה במערכת העצבים המרכזית. צרורים אסטרוציטיים מהונדסים נותנים מענה למגבלות של אסטרטגיות טיפול נוכחיות על ידי ניסיון לשחזר מאפיינים נוירו-אנטומיים מרכזיים ומנגנוני התפתחות המתווכים על ידי גליות, כדי לקדם הגירה תאית ממוקדת וסלילת נתיבים של אקסונים.
הארכיטקטורה של פיגומים אסטרוציטיים אלה מבוססת בעיקר על התהליכים האסטרוציטיים המיושרים בצינורות הגליאליים של זרם הנדידה הרוסטרלי (rostral migratory stream). התחילו בהכנת תמיסת אגרוז בריכוז 3% משקל לנפח ו-DPBS בכלי זכוכית סטרילי. המשיכו בחימום ובערבוב כדי למנוע מהתמיסה להתמצק בטרם עת.
החדירו מחט דיקור לתוך הפתח התחתון של מתפעל הנורה (bulb dispenser). הניחו צינור נימי מעל המחט החשופה ואבטחו את השניים על ידי הכנסת חלק ממנו לחלק הגומי של גליל מתפעל הנורה. סגרו את הגליל במכסה כדי להשלים את ההרכבה.
העבירו מיליליטר אחד של אגרוזה נוזלית למשטח של פטריה ריקה. תוך כדי לחיצה על מכסה הגומי של השואב (bulb dispenser), הכניסו קצה אחד של צינור הנימית אל תוך האגרוזה, ושחררו את הלחץ מהמכסה כדי לשאוב את האגרוזה לתוך הצינור. הניחו את מכלול השואב, הצינור והמחט על פטריה והמתינו 5 דקות עד שהאגרוזה תתגבש בתוך צינורות הנימית.
לאחר מכן, משוך את המחט מתוך צינור הנימי, כך שהמיקרו-עמודה תישאר עוטפת את המחט. השתמש בקצות פינצטה כדי להזיז את המיקרו-עמודה לקצה המחט, ולאחר מכן החזק את המחט מעל פטריה פתוחה המכילה DPBS ודחף את המיקרו-עמודה לתוך ה-DPBS. כדי לייצר "סירות" של מיקרו-עמודות, המקלות על טיפול מאוחר יותר במבנים אלה, התחל בהכנת תמיסת אגרוז בריכוז של 4% weight per volume, תוך שמירה על התמיסה במצב מחומם ומערבב.
השתמשו בפינצטה כדי להעביר מיקרו-עמוד לכלי פטרי ריק. לאחר מכן, בעבודה תחת סטראוסקופ, השתמשו במיקרו-סקלפל כדי לקצץ את המיקרו-עמודים לאורך הרצוי, כאשר הקצוות נחתכים בזווית של 45 מעלות. לאחר קיצוץ של שלושה מיקרו-עמודים נוספים, סדרו את ארבעת העמודים במקביל.
מלאו פיפטה ב-50 µL של תמיסת agarose בריכוז 4%, והתירו פס של נוזל מעל מערך המיקרו-עמודים כדי לחבר ולאגד את המבנים למבנה דמוי סירה. המתינו 1 עד 2 דקות לקירור כדי לאפשר גילוי (gelation) של ה-4%agarose. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה עדינה כדי להרים את "סירת" המיקרו-עמודים באמצעות גשר ה-agarose המחבר.
העבירו זאת לצ그러ת פטרי המכילה DPBS. העבירו את סירת המיקרו-עמודה לקבינה לבטיחות ביולוגית ועקרו אותה בחשיפה לאור על-סגול למשך שלושים דקות. בתוך קבינה לבטיחות ביולוגית, הכינו תמיסה של 1 mg/mL של קולגן מסוג 1 מזנב חולדה בתוך מדיום לשיתוף-תרביות.
לאחר מכן יש להניח אותו על קרח. יש לכוון את ה-pH של תמיסת ה-ECM באמצעות חומצה או בסיס לפי הצורך, עד שה-pH יהיה יציב בטווח של 7.2 עד 7.4. העבירו את סירת המיקרו-עמודה לפיתרי 35 או 60 mL באמצעות פינצטה.
בעזרת סטריאוסקופ להנחיה, מקם את הטיפ של מיקרו-פיפט בנפח 10 µL בקצה אחד של כל מיקרו-עמודה ושאב כדי לרוקן את הלומן מ-DPBS ומבועות אוויר. טען מיקרו-פיפט P10 בתמיסת קולגן. הצמד את הטיפ בנפח 10 µL לקצה אחד של כל מיקרו-עמודה, והעבר כמות מספקת של תמיסה כדי למלא את הלומן.
לאחר מכן, העבירו בפיפטה מאגר של ECM לכל קצה של המיקרו-עמוד. לאחר שכל העמודים מולאו, העבירו בפיפטה מצע גידול לקו-קולטורה בטבעת מסביב לפטריה כדי למנוע את התייבשות העמודים. הדגירו את הצלחת המכילה את המיקרו-עמודים בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide למשך שעה אחת לפחות כדי לעודד פולימריזציה של קולגן לפני הוספת התאים.
לאחר מכן, מקמו את קצה המיקרופיפט P10 בקצה אחד של מיקרו-עמודה והעבירו כ-5 mL של תמיסת תאים אל תוך הלומן כדי למלא אותו. לאחר הצבת כל המיקרו-עמודות בתוך סירה, דגרו אותן בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide למשך שעה אחת כדי לעודד את היצמדות האסטרוציטים ל-ECM. לאחר תקופת הדגירה, מלאו בזהירות את הצלחות המכילות את המיקרו-עמודות המוצבות ב-3 או 6 mL של מצע תרבית משותפת (coculture media), עבור צלחות פטרי של 35 או 60 mL בהתאמה.
שמר את המיקרו-עמודים המגולגלים ואת התרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני כדי לעודד את ההרכבה העצמית של צרורות האסטרוציטים המסודרים, אשר אמורים ליצור מבנה צרורי דמוי-כבל לאחר שש עד עשר שעות. שעה לאחר הגלגול, האסטרוציטים הם בעלי צורה כדורית ומפוזרים ברחבי המבנה. חמש שעות לאחר הגלגול, האסטרוציטים מתחילים בהארכת תהליכים ובהתכווצות.
שמונה שעות לאחר הזריעה, האסטרוציטים התיישרו והתכווצו. בדוגמה זו, לאחר 24 שעות מהזריעה, נוצר צרור דחוס של שלוחות אסטרוציטיות. צרור אסטרוציטי זה, שהשלים את התהליך 24 שעות לאחר הזריעה, מדגים את "אפקט הרוכסן" (zippering effect), שבו קצות הכבל נצמדים לקצוות נפרדים של דופן הלומן.
סרטון זה מציג את תהליך הצמימה (bundling) בפועל, 3 עד 10 שעות לאחר הזריעה. סימון אימונו-היסטוכימי של הפיגומים האסטרוציטיים מדגים את היישור האורכי של התהליכים האסטרוציטיים. בתמונה קונפוקלית זו של צמימה אסטרוציטית, ניתן לראות את GFAP, הסמן האסטרוציטי.
והגרעינים נראים בכחול. הגדלה גבוהה יותר זו של הצרור מאפשרת ויזואליזציה של הציטו-ארכיטקטורה של האסטרוציטים בתוך המיקרו-עמודים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להיות מסוגלים לייצר פיגומים חיים המורכבים מצרורי אסטרוציטים מיושרים אורכית עם ציטו-ארכיטקטורה בהשראה ביולוגית בתוך מעטפת של ביו-מטריאל.
בעקבות הליך זה, ניתן לתכנן אסטרטגיית השתלה להעברת צרורות של אסטרוציטים, עם או ללא מעטפת של חומר ביולוגי, לרקמת מוח פגועה כדי לעודד נדידה מכוונת של תאים מאזורים נוירוגניים ולשמש כמדריך במיקרו-סביבה המגבילה של ה-CNS. בנוסף, ניתן להרחיב טכניקה זו כפלטפורמת מידול ביו-פדלית (biofidelic) לתופעות נוירוביולוגיות המתווכות על ידי גלייה, תוך ניצול הדמיון לסביבה התלת-ממדית הטבעית והשליטה הניסיונית האינהרנטית של מערכות in vitro.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול לייצור צרורים תלת-ממדיים בהרכבה עצמית של גופי תא ואפיזורים של אסטרוציטים המיושרים לאורכו בתוך מיקרו-עמוד של הידרוג'ל בגודל מיקרוני. צרורים אסטרוציטיים מהונדסים אלו נועדו לשחזר מאפיינים נוירו-אנטומיים מרכזיים ולהקל על נוירו-רגנרציה על ידי הכוונת נדידה עצבית וסלילת נתיבים אקסוניים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- נוירו-רגנרציה
- ביומטריאלים
רקע
- טראומה ומחלות ניוון עצבי מגבילות את הרגנרציה במערכת העצבים המרכזית.
- אסטרטגיות טיפול נוכחיות ניצבות בפני אתגרים עקב הסביבה המעכבת.
- תהליכים אסטרוציטיים מיושרים הם קריטיים למנגנוני התפתחות עצבית.
- פיגומים מהונדסים יכולים לתת מענה למגבלות אלה על ידי חיקוי מבנים טבעיים.
מטרת המחקר
- פיתוח מודל נוירו-ביולוגי חדש in vitro.
- קידום טיפול נוירו-רגנרטיבי.
- עידוד נדידה תאית ממוקדת וסלילת נתיבי אקסונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת תמיסת אגרוז בריכוז של 3% משקל לנפח.
- שימוש ב-DPBS בסביבה סטרילית.
- חימום וערבוב לשמירה על עקביות התמיסה.
- הרכבה עצמית של צרורות אסטרוציטים בתוך מיקרו-עמודים של הידרוג'ל.
תוצאות עיקריות
- ייצור מוצלח של צרורים אסטרוציטיים מיושרים.
- הדגמת הפוטנציאל למחקרים בנושאי התפתחות נוירולוגית.
- ראיות לקידום נדידה נוירונלית וסלילת נתיבים אקסונליים.
- יצירת ביו-חומר המדמה סביבות אסטרוציטיות טבעיות.
מסקנות
- צמתי אסטרוציטים מהונדסים יכולים לשמש כפלטפורמות בדיקה יעילות למחקר.
- פיגומים אלו עשויים להעמיק את ההבנה של תהליכי התפתחות עצבית.
- יישומים פוטנציאליים בטיפולים ל regeneration עצבית נראים מבטיחים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
רשתות של אסטרוציטים מיושרות בהנדסה ביולוגית מספקות פלטפורמה בהשראה ביולוגית לחקר מנגנוני התפתחות עצבית ותמיכה באסטרטגיות של רגנרציה עצבית. על ידי חיקוי של פיגומים גליאליים טבעיים, מבנים אלה מאפשרים בדיקת השערות בנוגע לסלילת נתיבים אקסוניים ולנדידה עצבית במערכת in vitro מבוקרת. גישה זו נותנת מענה לאתגר מרכזי בשלב הגילוי של תיקון מערכת העצבים המרכזית (CNS) על ידי הצעת מודל שניתן להרחבה ולשחזור לצורך תיקוף מטרות והפחתת סיכונים מנגנוניים במחקר של מחלות ניווניות של מערכת העצבים וטראומה עצבית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של מנגנוני התפתחות המתווכים על ידי גליאל ובדיקת היפותזות טיפוליות עבור נוירו-רגנרציה.
- ערך תפעולי: מספק מערכת סטנדרטית הניתנת לשחזור להערכת אינטראקציות בין אסטרוציטים לנוירונים ולהבהרת מסלולים.
- ערך ניבוי: תומך ברמת הביטחון במטרה על ידי מידול של תשתיות מאפשרות להתרחבות אקסונית ולהיצמדות נוירונלית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר תוצאות כמותיות על התארכות נוריטים ויישורם לאורך צרורים של אסטרוציטים לצורך סריקת תרכובות.
- ערך תפעולי: מספק הרכבות של מיקרו-עמודים סטנדרטיים וניתנים להרחבה, התואמים לדימות בעל תוכן גבוה (high-content imaging) ולניתוח אוטומטי.
- מוכנות הבדיקה: מייצר פיגומים יציבים ומיושרים עם חיוניות של >97%, המתאימים להעברה לפלטות רב-בארים ולניטור לאורך זמן.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מגשר בין שלב הגילוי לתיקוף פרה-קליני על ידי שמירה על השלמות המבנית לאחר ההוצאה לצורך מחקרי השתלה.
- ערך תפעולי: מאפשר בחינה של אסטרטגיות השתלה במודלים של פגיעה כדי להעריך נדידה מכוונת של תאים וסלילת נתיבים אקסונליים.
- צמצום סיכונים: מקל על הפחתת סיכונים מנגנונית של גישות רגנרציה המתווכות על ידי גליות לפני תיקוף in vivo.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד להערכה פרה-קלינית, ותומכת במחקר מונחה-השערות בנושא נוירו-רגנרציה בהנחיית תאי גליה.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בהבהרת מסלולים ובהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות מידול של פיגומים גליאליים התפתחותיים בסביבה מיקרוסקופית ניתנת לכוונון.
- סריקה: מאפשרת מערכות מוכנות לבדיקה עם מדידות כמותיות של צמיחת נוריטים לצורך הערכת תרכובות פרו-רגנרטיביות.
- אנליטיקה: מספקת תוצרי ציטו-ארכיטקטורה מיושרים ומדידים להשוואת תנאים ניסיוניים ומעקב אחר הבשלה מבנית.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין ממצאים in vitro לרציפות פרה-קלינית באמצעות מבנים ניתנים להשתלה השומרים על יישור וחיוניות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה לשימוש חוזר למידול אינטראקציות בין גליה לנוירונים במגוון אינדיקציות של ניו rodaו-דגנרציה וטראומה נוירולוגית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי במבצעי תיקוף המטרה על ידי שחזור של ארכיטקטורות גליאליות התפתחותיות.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה והדירות באמצעות ייצור מוגדר של מיקרו-עמודים מהידרוג'ל וציפוי קולגן.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות go/no-go על ידי הפחתת העמימות המכניסטית במסלולי נוירו-רגנרציה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם-סיכון של טיפולים המכוונים לגליות באמצעות מידול מערכות מהוק, רלוונטי למחלה ומתוכנן.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהנדסת רקמות, תרביות של אסטרוציטים וטיפול בחומרי ביו-מטריאל.
- תלוי בייצור מיקרו-עמודים מאגרוז, ציפוי קולגן ומערכות תרבית משותפת (co-culture) סטריליות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית להשגת קוטר לומן עקבי (<350 µm) והשראה של יישור (alignment).
- כולל שיקולי התאמה עבור מקורות שונים של אסטרוציטים והרכבים שונים של מטריצה חוץ-תאית.
- כולל מגבלות מעשיות כגון שונות באורך המבנה ותלות בממדי מיקרו-עמודים מדויקים לצורך הרכבה עצמית.
