10 בינואר 2018
אנחנו ראווה הפיתוח של חבילות שהורכב עצמית, תלת מימדי של somata astrocytic longitudinally מיושר ותהליכים בתוך למטרתו biomaterial הרומן. אלה מהונדסים "חי פיגומים", מפגין בקנה מידה מיקרון קוטר עדיין הארכת ס מ אורך, עשוי לשמש מבחן-מיטות לימוד מנגנוני התפתחותיות או להקל על neuroregeneration על-ידי הגירה העצבית המשגה ו/או עצב pathfinding.
פרוטוקול זה נועד להנחות את הייצור של צרורות תלת מימדיים בהרכבה עצמית של סומטה אסטרוציטית מיושרת לאורך ותהליכים בתוך מיקרו-עמודת הידרוג'ל בגודל מיקרון לשימוש כמודל נוירו-ביולוגי במבחנה או כטיפול נוירו-רגנרטיבי. טראומה ומחלות נוירודגנרטיביות מזיקות במיוחד לחולים בשל היכולת הנוירוגנית המוגבלת בסביבה מעכבת המגבילה את ההתחדשות במערכת העצבים המרכזית. חבילות אסטרוציטיות מהונדסות מתייחסות למגבלות של אסטרטגיות הטיפול הנוכחיות על ידי ניסיון לשכפל תכונות נוירו-אנטומיות מרכזיות ומנגנוני התפתחות בתיווך גליה כדי לקדם נדידת תאים ממוקדת ומציאת נתיב אקסון.
הארכיטקטורה של פיגומים אסטרוציטיים אלה שואבת השראה בעיקר מהתהליכים האסטרוציטים המיושרים בצינורות הגליה של זרם הנדידה הרוסטרלי. התחל בהכנת תמיסת אגרוז של 3% משקל לנפח ו-DPBS בכוס סטרילית. שמור על החימום והערבוב כדי למנוע מהתמיסה להתמצק בטרם עת.
הכנס מחט דיקור לפתח התחתון של מתקן הנורה. הנח צינור נימי מעל המחט החשופה ואבטח את השניים על ידי הכנסת חלק ממנו לחלק הגומי של גליל מתקן הנורה. מכסה את הצילינדר כדי להשלים את ההרכבה.
העבירו מיליליטר אחד של אגרוז נוזלי אל פני צלחת פטרי ריקה. תוך כדי צביטה של מכסה הגומי של מתקן הנורה, הכנס קצה אחד של צינור הנימים לתוך האגרוז, ושחרר את הלחץ על המכסה כדי למשוך אגרוז לתוך הצינור. מניחים את מכלולי הנורה, הצינור, המחט על צלחת פטרי ונותנים לאגרוז להתמצק בתוך צינורות הנימים למשך 5 דקות.
לאחר מכן, משוך את המחט החוצה מהצינור הנימים, והשאיר את המיקרו-עמוד עדיין מקיף את המחט. השתמש בקצות העמוד הקדמי כדי לדחוף את המיקרו-עמוד לקצה המחט, ולאחר מכן החזק את המחט מעל צלחת פטרי פתוחה המכילה DPBS ודחף את המיקרו-עמוד לתוך ה-DPBS. כדי לייצר סירות מיקרו-עמודים, המאפשרות טיפול מאוחר יותר במבנים אלה, התחל בהכנת תמיסת אגרוז במשקל של 4% לנפח, ושמירה על התמיסה מחוממת ומעורבבת.
השתמש במלקחיים כדי להעביר מיקרו-עמוד לצלחת פטרי ריקה. לאחר מכן, תוך כדי עבודה תחת סטריאוסקופ, השתמש באזמל מיקרו כדי לקצץ את המיקרו-עמודים לאורך הרצוי, כאשר הקצוות נחתכים בזווית של 45 מעלות. לאחר חיתוך שלושה מיקרו-עמודים נוספים, יישר את ארבעת העמודים במקביל.
טען פיפט עם 50 מיקרוליטר של תמיסת אגרוז של 4%, והוציא קו נוזל מעל מערך המיקרו-עמודים כדי לחבר ולצרר את המבנים לסירה. מניחים להתקרר במשך 1 עד 2 דקות כדי לאפשר ג'לציה של 4% אגרוז. לאחר מכן השתמש במלקחיים עדינים כדי להרים את סירת המיקרו-עמוד ליד גשר האגרוז המחבר.
והעבירו אותו לצלחת פטרי המכילה DPBS. העבירו את סירת המיקרו-עמודים לארון בטיחות ביולוגית ועקרו בחשיפה לאור אולטרה סגול למשך שלושים דקות. בתוך ארון בטיחות ביולוגית, הכינו תמיסה של 1 מיליגרם למיליליטר של קולגן מסוג זנב חולדה מסוג 1 במדיום תרבית משותפת.
ואז מניחים אותו על קרח. התאם את ה-pH של תמיסת ה-ECM עם חומצה או בסיס לפי הצורך עד שה-pH יציב בטווח 7.2 עד 7.4. העבירו את סירת המיקרו-עמוד לצלחת פטרי של 35 או 60 מ"ל עם מלקחיים.
השתמש בסטריאוסקופ להנחיה, מקם את קצה ה-10 מ"ל של מיקרו-פיפטה בקצה אחד של כל מיקרו-עמוד ושאב כדי לרוקן את לומן ה-DPBS ובועות האוויר. טען מיקרופיפטה P10 עם תמיסת הקולגן. הנח את קצה ה-10 מ"ל כנגד קצה אחד של כל מיקרו-עמודה, וספק מספיק תמיסה כדי למלא את הלומן.
לאחר מכן פיפטה מאגר של ECM משני קצות המיקרו-עמודה. לאחר מילוי כל העמודים, מדיום קוקולטור פיפטה בטבעת סביב צלחת הפטרי כדי למנוע את התייבשות העמודים. דגרו את הצלחת המכילה את עמודות המיקרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך שעה לפחות כדי לקדם פילמור של קולגן לפני הוספת תאים.
לאחר מכן, הנח את קצה המיקרופיפטה P10 בקצה אחד של מיקרו-עמוד והעביר כ-5 מ"ל של תמיסת תאים לתוך הלומן כדי למלא אותו. לאחר הושבת כל המיקרו-עמודים בסירה, דגרו אותה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך שעה אחת כדי לקדם את החיבור של אסטרוציטים ל-ECM. לאחר תקופת הדגירה, מלאו בזהירות את הכלים המכילים את עמודי המיקרו היושבים ב -3 או 6 מ"ל של אמצעי קוקולטורה, עבור צלחות פטרי של 35 או 60 מ"ל בהתאמה.
שמור על המיקרו-עמודים המצופים והתרבית ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני כדי לקדם את ההרכבה העצמית של יישור הצרורות האסטרוציטיים, שאמורים ליצור מבנה צרור דמוי כבל לאחר שש עד עשר שעות. שעה לאחר הציפוי, אסטרוציטים הם כדוריים בצורתם ומתפזרים ברחבי המבנה. עד חמש שעות לאחר הציפוי, אסטרוציטים מתחילים הארכה והתכווצות של התהליך.
שמונה שעות לאחר הציפוי, אסטרוציטים התיישרו והתכווצו. עד 24 שעות לאחר הציפוי, נוצר צרור צפוף של תהליכים אסטרוציטים בדוגמה זו. צרור אסטרוציטי זה שנוצר במלואו, 24 שעות לאחר הציפוי, מראה את אפקט הרוכסן, שבו קצות הכבל מתחברים לקצוות נפרדים של דופן הלומן.
סרטון זה מציג צרור בפעולה, 3 עד 10 שעות לאחר הציפוי. תיוג חיסוני של הפיגומים האסטרוציטים מדגים את היישור האורכי של תהליכים אסטרוציטים. בתמונה קונפוקלית זו של צרור אסטרוציטי, הסמן האסטרוציטי GFAP נקרא.
והגרעינים נראים בכחול. הגדלה גבוהה יותר זו של הצרור מאפשרת הדמיה של הארכיטקטורה הציטולוגית של האסטרוציטים בתוך המיקרו-עמודות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות מסוגל לייצר פיגומים חיים המורכבים מצרורות אסטרוציטים מיושרים לאורך עם ציטוארכיטקטורה בהשראה ביולוגית בתוך מעטפת ביו-חומרית.
בעקבות הליך זה, ניתן לתכנן אסטרטגיית השתלה כדי להעביר את החבילות האסטרוציטיות עם או בלי המעטפת הביו-חומרית לרקמת המוח הפגועה כדי לקדם נדידת תאים מכוונת מאזורים נוירוגניים ופועלת על הנחיה למיקרו-סביבה המגבילה של מערכת העצבים המרכזית. בנוסף, ניתן להרחיב טכניקה זו כתופעה נוירוביולוגית בתיווך גליה של פלטפורמת מודלים ביו-פידליים הנהנית מחיקוי הסביבה התלת מימדית הטבעית והשליטה הניסויית המובנית במערכות מבחנה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
מחקר זה מציג פרוטוקול לייצור צרורות מאוורסים בעצמם, תלת-ממדיים, של סומטות ותהליכים אסטרוציטיים מיושרים לרוחב בתוך עמודת מיקרו-הידרוג'ל בגודל מיקרוני. צרורות האסטרוציטים המהונדסים הללו שואפים לשכפל מאפיינים נוירו-אנטומיים מרכזיים ולהקל על נוירו-רגנרציה על ידי הכוונת הגירת נוירונים ומציאת נתיבים אקסונליים.
Engineered aligned astrocyte networks provide a biologically inspired platform to study neurodevelopmental mechanisms and support neuroregeneration strategies. By mimicking natural glial scaffolds, these constructs enable hypothesis testing of axonal pathfinding and neuronal migration in a controlled in vitro system. This approach addresses a key discovery-stage challenge in CNS repair by offering a scalable, reproducible model for target validation and mechanistic de-risking in neurodegenerative disease and neurotrauma research.
The method integrates into the discovery continuum from target validation through preclinical evaluation, supporting hypothesis-driven research on glial-guided neuroregeneration.