כוונון להקת הטטה בהיפוקמפוס במבחנה מתודולוגיות להקלטת מכרסמת מבודדת מעגל ספוטוהיפוקמפוס

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להקלטת קצבית רשת עצבית theta ו תנודות גמא מ הכנה בהיפוקמפוס שלם מבודד. אנו מתארים את השלבים ניסיוני מן החילוץ של ההיפוקמפוס לפרטים של שדה, יחידית תא שלם קליפת הקלטות מהדק, כמו גם צעדה optogenetic של קצב theta.

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להציג נהלים לחילוץ כל הכנת ההיפוקמפוס ולחקור את יצירת הרשת העצבית הקצבית באמצעות הקלטות שדה, יחידות ותיקון-מהדק כמו גם גירוי אופטוגנטי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח של למידה וזיכרון על ידי הקלה רבה על חקר המנגנונים התאיים והסינפטיים העומדים בבסיס תנודות קצביות בהיפוקמפוס. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משתמשת בתכשיר אופטימלי כדי לחקור את המעגלים בתנודות מפורטות, הממלאות תפקיד מכריע במידע זיכרון תלוי היפוקמפוס.

כדי להתחיל בהליך זה, הנח את המוח על צלחת הדיסקציה במצב זקוף, הסר את המוח הקטן בעזרת סכין גילוח, ואז חתוך את המוח לשניים לאורך המישור הסגיטלי האמצעי והחזיר את שתי ההמיספרות המבודדות לתא ההחזקה. לאחר מכן, הניחו את המוח היחיד שנחצה זקוף על צלחת הדיסקציה. סובב את המנה עד שהמבנים הסגיטליים האמצעיים פונים אל הנסיין וקווי המתאר המוטבעים של קומפלקס המחיצה נראים כשכבה דקה בצורת אגס של רקמה פנימית לתלמוס.

לאחר מכן, הכנס מרית מצופה מתחת למחיצה והזיז את הקצה כלפי מטה עד שמגיעים לצלחת החיתוך, חתכו את הסיבים המחברים את אזור המחיצה בלבביות. כעת, חזרו על אותה פעולה לאורך הקצה הקדמי של המחיצה וחתכו את הסיבים שמתחברים לחלק הקדמי של המוח. כאשר המרית מחזיקה קלות את החלק הפנימי של קליפת המוח ממש מעל ההיפוקמפוס במצב זקוף, השתמש במיקרו-מרית כדי למשוך בזהירות את גרעיני התלמוס, ההיפותלמוס ושאר גרעיני גזע המוח.

לאחר מכן, השתמש במרית כדי לחתוך ולהסיר את הרקמה שנשלפה. לאחר מכן, הכנס את המרית המצופה לחדר הצדדי מתחת לקצה הרוסטרלי של ההיפוקמפוס הגבי. החזק את המרית אופקית, מיושרת עם המישור האמצעי הסגיטלי של המוח החצוי והחלק אותה דרך קווי המתאר החלקים של דפנות החדר, עד שהקצה יוצא בלבביות.

החזיקו את המרית מתחת להיפוקמפוס ולחצו אותה קלות על הסיבים המחברים לאורך השכבה הפנימית שבה ההיפוקמפוס מתחבר לקליפת המוח שמעליה, ולאחר מכן, מרחו את המיקרו-מרית בצד החיצוני של שכבה זו ולחצו אותה על המרית המצופה כדי לחתוך דרך הסיבים המחברים. כדי להשלים את החילוץ, סובב את צלחת החיתוך והכנס את המרית המצופה מתחת להיפוקמפוס הגחוני. החזק קלות את ההיפוקמפוס עם המרית וחתך את החיבורים האנדוקריניים באמצעות תנועת חיתוך כנגד המרית.

לאחר השלמת הבידוד, השאירו את ההיפוקמפוס מונח על הצלחת והוסיפו טיפה של תמיסת סוכרוז קרה כקרח כדי לשמור על קור רוח. חתוך בזהירות את כל קליפת המוח והסיבים שנותרו והפרד את ההיפוקמפוס מהמחיצה על ידי מריחת סכין גילוח בעדינות על הפורניקס. לאחר מכן, העבירו את התכשיר לתמיסת סוכרוז בטמפרטורת החדר ותנו לו להתאושש במשך 15 עד 30 דקות לפני העברתו לתא ההקלטה.

בשלב זה, הגדר את מערכת הזלוף המוזנת בכוח הכבידה כדי לאפשר מהירות גבוהה רציפה בזרימה של ACSF מחומצן. לאחר מכן, עצרו את זרימת ה-ACSF והעבירו את ההיפוקמפוס לתא ההקלטה, באמצעות הקצה הרחב של פיפטת זכוכית. הניחו לתכשיר רווי הסוכרוז לשקוע ולהתיישב בתחתית.

הנח את התכשיר במרכז תא ההקלטה, כשהמשטח החלק של CA1 ו-subiculum למעלה. ייצב את ההיפוקמפוס עם משקולות קטנות של המחיצה והגפיים הטמפורליות והפעל מחדש את זרימת ה-ACSF. בהליך זה, הורד את אלקטרודת LFP לפני השטח של ההיפוקמפוס.

קדם את אלקטרודת ה-LFP דרך שכבת הפרמטר וצפה בעלייה בפעילות הזינוק החוץ-תאי כאשר מתגלה פריקה של יחידה אחת מנוירונים בודדים. הורד את האלקטרודה עוד יותר ושים לב שהזינוק מתחיל לדעוך שוב כאשר הקצה חוצה לתוך הרדיאום. שימו לב שתנודת רשת נראית בבירור בטווח תדרי התטא, מתגלה ומגיעה למשרעת מקסימלית כאשר מיקום ההקלטה מוריד דרך הרדיאום.

כדי לבדוק את המאפיינים המרחביים של תנודות תטא ספונטניות על פני אזור CA1, הנח אלקטרודת LFP שנייה באתר CA1 ושים לב שתנודות תטא CA1 מסתנכרנות על פני מרחקים גדולים. כדי לבדוק את המאפיינים של תנודות תטא על פני שכבות ההיפוקמפוס, השאר אלקטרודת ייחוס LFP באתר רדיאטום CA1. החל ממש מעל השכבה אוריינס, הורד אלקטרודה שנייה לשכבת תא הפרמטר ודרך הרדיאטום.

שימו לב להיפוך הדרגתי של אות ה-LFP על פני שכבת הפרמטר. כדי לבדוק תנודות גמא וצימוד תטא גמא בהיפוקמפוס השלם, הנח אלקטרודת שדה בגבול ה-subiculum CA1 והורד אותה עד שהיא יושבת בממשק בין הפרמטר לשכבות המולקולריות. ברמה זו, ניתן לרשום פוטנציאל שדה המציג תנודות גמא ברורות עם שינויים במשרעת הפאזה הנעולה למקצב התטא המקומי.

לאחר מכן, התאם את קנה המידה כדי להתבונן בסולם הזמן האיטי של צימוד תטא גמא. שימו לב שהתפרצויות גמא מתרחשות בשני פסי תדרים נפרדים שניתן לחשוף על ידי פס במהלך אות ה-LFP המתמשך, בטווח הגמא האיטי והמהיר. להקלטת מהדק תיקון תא שלם במהלך תנודות תטה בהיפוקמפוס במבחנה, השתמש במיקרוסקופ וידאו פלואורסצנטי עם הגדלה בעוצמה נמוכה וגבוהה כדי לדמיין אינטרנוירונים חיוביים tdTomato הממוקמים ליד פני השטח של תכשיר היפוקמפוס מעכבר טום PV.

תחת מבט בהגדלה נמוכה של ההיפוקמפוס, הנח אלקטרודת LFP בתת-קולום CA1 כדי לנטר את תנודות התטא תוך כדי הכנה לניסויי מהדק טלאי. לאחר מכן, עבור להגדלה של פי 40 וטבול את המטרה מעל אזור היעד. הורד אותו עד שהשכבות העליונות נראות לעין, תחת המיקרוסקופ הקרינה, בחר את תא ה-PV טום הפלואורסצנטי והתקרב עם פיפטת תיקון מלאה בתמיסה בין-תאית סטנדרטית.

לאחר תצורת התא השלם, בדוק את התכונות הפיזיולוגיות של תא ה-PV שזוהה במהלך תנודות היפוקמפוס ספונטניות. התבונן בהקלטת פוטנציאל הממברנה הפנימית מתאי PV המאופיינים בהתנהגות זינוק מהיר והתפרצויות של פוטנציאל פעולה המסונכרנים לקצב CA1 subiculum theta המתמשך. בהליך זה, מקם אלקטרודת LFP באזור תת-העצב CA1 ותקן תא פרמטר סמוך בהיפוקמפוס המבודד של עכבר, המבטא את האופצין המעורר הרגיש לאור כחול, CHR2 באינטרנוירונים PV.

הניחו מוביל אור סיבים אופטיים מעל הכנת ההיפוקמפוס ומרכזו אותו באזור המתועד. השתמש באור כחול ממקור LED לגירוי גנטי אופטי, המורכב מפולסי אור של 10 עד 20 אלפיות השנייה או פקודות מתח גלי חטא המועברות בתדרי תטא. במהדק הנוכחי, אפיינו את פעילות התא המוקלט במהלך תנודות תטא ספונטניות.

לאחר מכן, התחל את פרוטוקול הגירוי ורשום את תגובות האור. שימו לב שתנודות השדה והפעילות הסינפטית והנוירון המוקלט, הופכים מסונכרנים יותר ויותר במהלך גירוי אופטוגנטי וכי קצב קצבי של תאי PV מביא לשליטה חזקה הן בתדירות והן בעוצמה של תנודות תטא. מוצגת כאן, הפעילות האלקטרופיזיולוגית שנרשמה מתא פרמטר במהלך תנודות תטא.

עקבות המהדק הנוכחיים מראים ירי ספונטני אך לא קצבי במנוחה ופוטנציאלים פוסט-סינפטיים מעכבים שלא היו מסונכרנים בבירור עם תנודת ה-LFP המתפתחת לאט. הקלטות מהדק מתח מראות כי לזרמים הפוסט-סינפטיים המעכבים המתאימים יש פוטנציאל היפוך בסביבות מינוס 70 מילי-וולט. והנה, הפעילות האלקטרופיזיולוגית שנרשמה מאינטרנוירון PV פלואורסצנטי מהיר במהלך תנודות תטא.

במהדק הנוכחי, תא זה ירה באופן ספונטני במנוחה והונע חזק על ידי פוטנציאלים פוסט-סינפטיים מעוררים קצביים שננעלו בשלבים עם תנודת LFP יציבה. בהקלטות מהדק מתח, פוטנציאל היפוך הזרם הפוסט-סינפטי המעורר היה בערך באפס מילי-וולט. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעתיים-שלוש, תוך כדי ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לחמצן תמיסה במרץ ולהשתמש במערכת זלוף המאפשרת זרימה מהירה אך יציבה של ACSF חמוש על התכשיר במהלך ההקלטות האלקטרופיזיולוגיות.

בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות כגון גירוי אופטוגנטי או השתקה של אוכלוסיות מסוג תאים ספציפיות, על מנת לענות על שאלות נוספות כגון זיהוי תת-הסוגים התאיים היוצרים מתנדי תטא בהיפוקמפוס. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מדעי המוח לחקור באופן שיטתי את הדינמיקה של תנודות תטא על פני הציר הטמפורלי של המחיצה של ההיפוקמפוס במבחנה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לחלץ תכשיר היפוקמפוס שלם על מנת לחקור את תפקודן של רשתות עצביות קצביות באמצעות הקלטות מהדק שדה, יחידה וטלאי, כמו גם גירוי אופטוגנטי.