נוירונים חוט השדרה בידוד ותרבות מ עכברים ניאונטליים

המטרה הכוללת של הליך זה היא להיות מסוגל לבודד שוב ושוב ובאופן עקבי נוירונים בחוט השדרה שניתן להשתמש בהם במגוון ניסויים. שיטה זו יכולה לאפשר לנו לקבל תובנה טובה יותר על הביולוגיה של נוירונים בחוט השדרה, ובתקווה להבין את תגובתם למגוון גורמי לחץ. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת בידוד של מספר משמעותי של נוירונים, ומאפשרת להשתמש בנוירונים אלה במגוון רחב של ניסויים.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון ששלב הטריטורציה שבו נוירונים מבודדים מכנית מהרקמה, דורש זמן מה כדי לשלוט בו, על מנת להבטיח בידוד בריא של תאי עצב, מבלי להרוג אותם. כדי להתחיל בהליך זה, הפרד את הראש מגופם של גורי העכברים שהורדמו, באמצעות מספריים. לאחר מכן, ייצב את הזנב והזרועות על שולחן ההליכים כשהצד הגבי פונה כלפי מעלה.

לאחר מכן, חתכו את העור בעזרת מספרי הקשתית המעוקלת. לאחר מכן, חתכו את חוט השדרה מאזור המותני, ממש מעל הירכיים ואז חתכו את שני צידי בית החזה כדי להפריד אותו מהגוף. שטפו את הדגימות ברצף בשלוש צלחות פטרי של 10 סנטימטרים, המכילות חמישה מיליליטר PBS מעוקר למשך 10 שניות כל אחת, כדי להסיר רקמות עודפות.

לאחר מכן, הכנס מחט ומזרק בגודל 22 מלא בחמישה מיליליטר של PBS מעוקר לקצה הזנב של עמוד השדרה ושטוף בגולגולת, מה שמאפשר לחבל לצאת לצלחת פטרי רביעית. העבירו את חוט השדרה בצינור של 15 מיליליטר עם חמישה מיליליטר HABG על קרח. הימנע מריסוק חוט השדרה וחזור על ההליכים עבור שאר הגורים.

באופן אידיאלי, תהליך זה אמור להימשך לא יותר מ-30 דקות עבור קבוצה אחת של גורים, כדי להבטיח בידוד נוירונים. להכנת שיפוע הצפיפות, הכינו כל אחת מארבע השכבות בארבעה צינורות של 15 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד מכל שכבה לצינור חדש של 15 מיליליטר.

מתחילים בשכבה הראשונה בתחתית, ומוסיפים ברצף, עד שמגיעים לשכבה הרביעית בחלק העליון. הימנע מהפרעה לשכבות בזמן ההוספה וכל תנועה נמרצת, שעלולה לגרום לערבוב. לאחר מכן, הוסף את אמצעי העיכול לרקמה הטחונה.

מניחים את הדגימה בשייקר באמבט המים בחום של 30 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוציאו את הטישו מאמבט המים והניחו לו להתייצב מספר דקות. כדי לבצע טריטורציה, שאפו את מדיום העיכול העודף.

השעו את הרקמה בשני מיליליטר של HABG, באמצעות פיפטה צרת קדח, טריטו 10 פעמים תוך 45 שניות והימנעו מהכנסת אוויר, מכיוון שזה יפחית משמעותית את התשואה הקיימת. טריטורציה היא אחד השלבים הקריטיים ביותר בהליך, יש לשאוב את הרקמה בזהירות לתוך הפיפטה המלוטשת באש ולרוקן ממנה, תוך הימנעות מעודף מרץ שעלול להוביל למוות עצבי או להיות עדין מדי, מה שיגרום לתשואה נמוכה. לאחר מכן, שאפו את שני המיליליטר העליונים של הסופרנטנט והעבירו אותו לצינור חדש של 15 מיליליטר שכותרתו אוסף.

חזור על הליכי האיסוף פעמיים נוספות, כדי להפיק שישה מיליליטר של סופרנטנט. לאחר מכן, העבירו לאט את תוכן צינור האיסוף לצינור השיפוע שהוכן בעבר. הימנעות מהפרעה של השיפוע.

כדי לטהר את הנוירונים, צנטריפוגה את צינור השיפוע למשך 15 דקות ב-800 פעמים G, ב-22 מעלות צלזיוס. אוספים את השכבות הרצויות ומעבירים אותן בצינור חדש של 15 מיליליטר. לבידוד נוירונים בטוהר הגבוה ביותר, אסוף שכבה שלישית.

לקבלת תשואה רבה יותר עם פחות טוהר, אספו שכבות שתיים עד שלוש. לאחר מכן, יש לדלל את שיפוע הצפיפות על ידי הוספת חמישה מיליליטר HABG לשכבות החדשות שנאספו. צנטריפוגה אותו, ב -200 פעמים G למשך שתי דקות ב -22 מעלות צלזיוס.

לאחר שתי דקות, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים בחמישה מיליליטר של HABG, על ידי תנועת החיך. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימה ב-200 פעמים G למשך שתי דקות ב-22 מעלות צלזיוס שוב. לאחר מכן, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים בשלושה מיליליטר של תווך נוירו-בסיסי, על ידי תנועת החיך.

לאחר מכן, קבע את צפיפות התאים באמצעות מונה תאים ולאחר מכן, דלל את התרחיף ל -300,000 תאים למיליליטר אחד של מדיום נוירו-בסיסי. מנערים בעדינות כדי להפיץ את התאים והתמיסה ומוסיפים מיליליטר אחד מהדגימה לכל באר ב-24 צלחות הבאר המקודדות. מוצג כאן, מהלך הזמן של הנוירונים בתרבית, לאחר הזריעה על הבארות.

התאים בדרך כלל יתחילו להיצמד לפני השטח במהלך השעות הראשונות. אקסונים יתחילו לנבוט בתוך 24 עד 48 השעות הראשונות, קשרים בין נוירונים שונים לתרבית, בדרך כלל מגיעים לבגרות לאחר שבעה ימים, ואז בדרך כלל מתבצעים ניסויים על הנוירונים. באיור זה, צביעה גרעינית מוצגת בכחול, עם צביעה ציטופלזמית בירוק וכאן, החלבון המיקרו-צינורי הקשור לחלבון המיקרו-צינורי של הנוירון צבוע, המראה את קווי המתאר וההקרנות האקסונליות של הנוירונים לאחר שבוע בתרבית.

תמונות המיזוג משולבות, ומציגות את השפע היחסי של הנוירונים. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלוש עד ארבע שעות, אם היא מבוצעת כראוי. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים, החוקרים את הפיזיולוגיה והפתולוגיה של חוט השדרה, לחקור את התנהגותם של נוירונים בחוט השדרה בתנאים רגילים ובתגובה לגורמים פרמקולוגיים או גורמי לחץ כגון מחסור בחמצן וגלוקוז, רק מחקה את ההליכים הכירורגיים שלנו.

בזמן ביצוע הליך זה, חשוב להימנע מעיכוב או הארכה של כל אחד מהצעדים למניעת בידוד של נוירונים לא בריאים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד נוירונים בריאים וברי-קיימא מחוטי השדרה של עכברים שזה עתה נולדו שניתן לתרבת במדיה נטולת סרום.