Name: נוירונים חוט השדרה בידוד ותרבות מ עכברים ניאונטליים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: למדו שיטה לאיסולציה של נוירונים מחוט השדרה בעכברים ניאונטליים באמצעות פירוק מכני ואנזימטי. טכניקה זו מאפשרת לחקור את הביולוגיה של הנוירונים ותגובתם למגוון מאמצים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

למחברים אין תודות.

הטיפול והטיפול בבעלי חיים בהליך זה בוצעו על פי הנחיות הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש באוניברסיטת קולורדו. 1. הכנת פתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ואחסן את כל הפתרונות בטמפרטורות המתאימות, כפי שמוצג בטבלה 1 . </li></ol> 2. ציפוי בארות ושקופיות הערה: נוירונים לא לדבוק היטב פלסטיק או משטחי זכוכית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום אחד לפני הבידוד של הנוירונים, מעיל את הבארות של צלחת 24 תרבות סטרילית עם 0.5 מ&quot;ל של פולי-D- ליזין (PDL, טבלה 2 ) ולהשאיר אותו ברדס זרימה למינרית O / N. הערה: השיטה המועדפת היא להשתמש 24-גם צלחות מעיל רק בארות מרכז, כמו אידוי מן בארות הפריפריה נוטה להיות מואצת יותר ולהוביל לתוצאות עקבי. בנוסף, זכוכית שקופיות ניתן להציב את הבארות לפני לאO ציפוי. הנוירונים יצרפו את השקופיות זכוכית מצופה ניתן להסיר מאוחר יותר עבור הדמיה מיקרוסקופית נוספת . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום של בידוד, להסיר את PDL מן הבארות. לשטוף עם מים סטריליים במשך כמה דקות לפני הסרת כל המים הנותרים ומאפשר להתייבש במשך שעה 1 (ראה להלן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ייבוש, מעיל את השקופיות עם laminin ( טבלה 2 ). הערה: כ 10 μL של laminin (10 מיקרוגרם / μL) מספיק כדי מעיל כל טוב של צלחת סטרילית 24 גם. זה מעורבב עם μL 340 בינוני (נפח כולל: 350 μL) על מנת לכסות את כל טוב. תן זה לשבת על 2 שעות ב RT ברדס תרבות ולאחר מכן לשאוב לפני ציפוי התאים. </li></ol> 3. קצירת חוט השדרה הערה: כל המכשירים צריכים להיות autoclaved (135 ° C ו 30 psi עבור מחזורי 4 x 7 דקות) עבור סטריליות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים 1-3 יום בן C57BL / 6 גורים העכבר בחדר עם isoflurane. לַחֲכוֹת30 s לאחר הפסקת התנועה וקמצוץ את הרגל כדי לאשר חוסר תגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפריד את הראש מן הגוף באמצעות מספריים, עם גור במצב נוטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצב את הרגליים האחוריות או זנב וזרועות על השולחן ההליך, עם הצד הגב מול המשתמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את העור באמצעות מספריים איריס מעוקל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את חוט השדרה מן האזור המותני רק מעל הירכיים ולהמשיך לחתוך את שני הצדדים של בית החזה להפריד אותו מהגוף. הערה: זה דורש דיסקציה זהיר של חוט השדרה מאיברים הקרביים, כדי למנוע נזק מכוון לאיברים אחרים ( איור 1 א ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ברצף במשך 10 שניות ב 3 x 10 ס&quot;מ צלחות פטרי המכיל 5 מ&quot;ל של 0.2 מיקרומטר מסנן מעוקר פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) כדי להסיר רקמת עודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מחט 22 G מזרק מלא 5 מ&quot;ל של מסנן מעוקר PBS אל קצה הזנב של עמוד השדרה ואת סומק cranially, המאפשר את כבל tO היציאה לתוך צלחת פטרי הרביעי ( איור 1b ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף חוט השדרה בצינור 15 מ&quot;ל עם 5 מ&quot;ל של HABG ( טבלה 1 ) על הקרח. השתמש בזהירות כדי למנוע מוחץ את חוט השדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.1-3.8 עבור כל גור במיטה. הערה: באופן אידיאלי, תהליך זה צריך לקחת פחות מ -30 דקות לכל חוט השדרה כדי להבטיח בידוד נוירון בריא. </li></ol> 4. בידוד נוירונים הערה: השלב הבא צריך להתבצע מכסה המנוע זרימה למינרית. היכרות עם טכניקה סטרילית בסיסית צפויה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את הצינור המכיל את חוט השדרה ולנער קלות להשעות את הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים רקמות מן הצינור לתוך צלחת פטרי 60 מ&quot;מ זכוכית וקוביות עם להב גילוח כדי ליצור חתיכות בסדר ~ 0.5 מ&quot;מ בגודל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הרקמה עם פיפטה רחב נשא לתוך צינור 15 מ&quot;ל המכיל 5 מ&quot;ל של HABG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים אותו ב30 ° C אמבטיה למשך 30 דקות כדי לאפשר לתאים לאזן בטמפרטורה זו. שמור את התאים על שייקר מספיק רק כדי לאפשר להם להיות מושעה בנוזל. הערה: צעד זה נעשה כדי למנוע מזעזע את התאים עם המעבר מן הקרח המדיום העיכול. שמירה על התאים ב 30 מעלות צלזיוס מסייעת להפחית את המוות התא הקשורים מטבוליזם מוגברת אחרת ב 37 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המדיום העיכול ( טבלה 1 ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את שיפוע צפיפות (טבלה 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן כל אחת 4 שכבות 4 צינורות נפרדים 15 מ&quot;ל, כפי שתואר בטבלה 1 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל מכל שכבה לתוך צינור 15 מ&quot;ל חדש. התחל עם שכבה 1 בתחתית להוסיף ברצף עד להגיע השכבה 4 בראש. הימנע להפריע את השכבות תוך הוספת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את צלחות מצופה PDL משלב 2.2. לשטוף עם מים סטריליים במשך כמה דקות לפני הסרת כל המים הנותריםהמאפשר להם להתייבש במשך 1 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הרקמה המדיום עיכול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצינור המכיל רקמות מן האמבט מים שייקר ב 30 מעלות צלזיוס ולאפשר לו להתיישב במשך כמה דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צינור העיכול בינוני מן האמבט מים 37 מעלות צלזיוס לשאוב אותו לתוך מזרק לנעול leur. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את HABG עודף מן הצינור המכיל רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש leur- לנעול 0.2 מסנן מיקרומטר על המזרק להוסיף בינוני עיכול לצינור המכיל רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור באמבט מים 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. שמור על התאים רועד מספיק רק כדי לאפשר להם להיות מושעה בנוזל. הערה: חשוב לא לשמור את התאים במדיום העיכול זמן רב מדי או לתת לטמפרטורה להגיע גבוה מדי, אשר עלול להוביל לעיכול מופרז וכתוצאה מכך הרקמה הופכת תלויה בתערובת ג&#39;לטין. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך תקופה זו, מעיל laminin כמו בשלב 2.3. </li> &lt;Li&gt; לבצע טחינה ( כלומר, הפרדת התאים מן הרקמה). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצינור מן רועד 30 מעלות צלזיוס אמבט מים ולאפשר לו להסתפק דקות ספורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב עודף מערכת העיכול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות את הרקמה ב 2 מ&quot;ל של HABG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פיפטה צרה נשא, triturate 10x במשך 45 שניות. הערה: זה כנראה הצעד החשוב ביותר אחד יכול להפחית באופן משמעותי את התשואה אם ​​לא נעשה כראוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את הרקמה לתוך פיפטה ומיד לרוקן את התוכן בחזרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הימנע החדרת אוויר, שכן זה יהיה להפחית באופן משמעותי את התשואה קיימא. הערה: פיפטה האידיאלי הוא פיפטה זכוכית 9. קצה פיפטה צריך להיות מלוטש כדי להחליק את המשטחים הגסים.זה צריך להיות siliconized על ידי מיקום ב 1:20 פתרון של dichlorodimethylsilane (DMDCS) ב chloroform ו שמאל O / N. לאחר מכן, יש להסיר את פיפטה מותר לאוויר יבשהוא יהיה autoclaved עבור עיקור. זהירות: DMDCS ו chloroform הם דליקים מאוד, siliconizing צריך להתבצע במנדף קטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את מ&quot;ל העליון של supernatant ומכניסים אותו לתוך צינור חדש 15 מ&quot;ל שכותרתו &quot;אוסף&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 4.7.3-4.7.5 שתי פעמים נוספות (צינור איסוף התא צריך 6 מ&quot;ל בסוף). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט להעביר את התוכן צינור אוסף לתוך צינור שיפוע מוכן בשלב 4.2, הימנעות הפרעה של שיפוע. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה, להסיר את המדיום neurobasal מוכן מראש ( טבלה 1 ) מהמקרר ולאפשר לו להתחמם ב 37 ° C אמבטיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את הנוירונים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינור שפופרת במשך 15 דקות ב 800 xg ו 22 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את השכבה הרצויה (ים) עם פיפטה ( איור 2 ) ו במקום צינור חדש 15 מ&quot;ל. עבור נוירו הגבוהה ביותר טוהרN בידוד ( כלומר &gt; 90%), לאסוף שכבה 3. לקבלת תשואה יותר עם פחות טוהר ( כלומר &gt; 70-80%), לאסוף שכבות 2 &amp; 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את שיפוע צפיפות על ידי הוספת 5 מ&quot;ל של HABG לשכבות שנאספו זה עתה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 200 דקות 2 ב 22 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק supernatant, מחדש להשעות 5 מ&quot;ל של HABG, וכן קפיצי גלולה להשעות את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 2 דקות x 200 ב 22 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק supernatant, resuspend ב 3 מ&quot;ל של המדיום neurobasal, ואת קפיצי גלולה resuspend התאים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 10 μL של הפתרון, עכשיו עם תאים במדיום neurobasal, ומערבבים עם 10 μL של כחול Trypan. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 10 μL של תערובת זו בספירת זכוכית ספירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות תא ספירת זכוכית רגילה, לספור את מספר התאים בכל אחד מארבע 4 x 4 הרביעים. הוסף את כל התאים נספר (n), רברובד של 2 (גורם דילול), לחלק 4 (מספר הרביעים נספר), להכפיל את ידי 3 (נפח המדיום neurobasal), להכפיל ידי 10 4 כדי להשיג את ריכוז התאים בתאים / מ&quot;ל. <img alt="משוואה" src="/files/ftp_upload/55856/55856eq0.jpg" /></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע את התאים על לוחות תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את ההשעיה התא 300,000 תאים 1 מ&quot;ל של המדיום neurobasal. הערה: בהתבסס על ריכוז של תאים שהתקבלו בשלבים לעיל, בינוני נוירובאס נוסף נוסף כדי להשיג ריכוז סופי של 3 * 10 5 תאים / מ&quot;ל. המשוואה היא C 1 V 1 = C 2 V 2 , כאשר C 1 הוא הריכוז הראשוני של תאים המתקבלים מן הקציר; V 1 הוא 3 מ&quot;ל; ו C 2 הוא 3 * 10 5 תאים / מ&quot;ל, כפי שפורט לעיל. המשוואה נפתרת עבור V 2 . הוסף את נפח המדיום neurobasal צורך להפוך את הנפח הכולל של תאים בפתרון שווהאשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנער בעדינות כדי להפיץ את התאים בפתרון ולהוסיף 1 מ&quot;ל היטב כל מצופים 24-גם צלחות. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Qayumi, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+model+for+investigation+of+spinal+cord+injury+caused+by+aortic+cross-clamping%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Surg%22%5BJournal%5D)">Animal model for investigation of spinal cord injury caused by aortic cross-clamping.</a> J Invest Surg. 10 (1-2), 47-52 (1997).</li>
<li>Fang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemic+preconditioning+protects+against+spinal+cord+ischemia-reperfusion+injury+in+rabbits+by+attenuating+blood+spinal+cord+barrier+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Ischemic preconditioning protects against spinal cord ischemia-reperfusion injury in rabbits by attenuating blood spinal cord barrier disruption.</a> Int J Mol Sci. 14 (5), 10343-10354 (2013).</li>
<li>Taira, Y., Marsala, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+proximal+arterial+perfusion+pressure+on+function%2C+spinal+cord+blood+flow%2C+and+histopathologic+changes+after+increasing+intervals+of+aortic+occlusion+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Effect of proximal arterial perfusion pressure on function, spinal cord blood flow, and histopathologic changes after increasing intervals of aortic occlusion in the rat.</a> Stroke. 27 (10), 1850-1858 (1996).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. -A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).</li>
<li>Ahlemeyer, B., Baumgart-Vogt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+protocols+for+the+simultaneous+preparation+of+primary+neuronal+cultures+of+the+neocortex%2C+hippocampus+and+cerebellum+from+individual+newborn+%28P0.+5%29+C57Bl%2F6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized protocols for the simultaneous preparation of primary neuronal cultures of the neocortex, hippocampus and cerebellum from individual newborn (P0. 5) C57Bl/6J mice.</a> J Neurosci Methods. 149 (2), 110-120 (2005).</li>
<li>Brewer, G. J., Torricelli, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+neurons+and+neurospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult neurons and neurospheres.</a> Nat Protoc. 2 (6), 1490-1498 (2007).</li>
<li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Res. 126 (3), 397-425 (1977).</li>
<li>Graber, D. J., Harris, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+culture+of+spinal+motor+neurons+from+rat+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Purification and culture of spinal motor neurons from rat embryos.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013 (4), 319-326 (2013).</li>
<li>Anderson, K. N., Potter, A. C., Piccenna, L. G., Quah, A. K., Davies, K. E., Cheema, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+motor+neurons+from+the+newborn+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Prot%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of motor neurons from the newborn mouse spinal cord.</a> Brain Res Prot. 12 (3), 132-136 (2004).</li>
<li>Gingras, M., Gagnon, V., Minotti, S., Durham, H. D., Berthod, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+protocols+for+isolation+of+primary+motor+neurons%2C+astrocytes+and+microglia+from+embryonic+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized protocols for isolation of primary motor neurons, astrocytes and microglia from embryonic mouse spinal cord.</a> J Neurosci Methods. 163 (1), 111-118 (2007).</li>
<li>Brewer, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+survival+of+hippocampal+neurons+in+B27-supplemented+Neurobasal%2C+a+new+serum-free+medium+combination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination.</a> J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).</li>
<li>Fang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemic+preconditioning+protects+against+spinal+cord+ischemia-reperfusion+injury+in+rabbits+by+attenuating+blood+spinal+cord+barrier+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Ischemic preconditioning protects against spinal cord ischemia-reperfusion injury in rabbits by attenuating blood spinal cord barrier disruption.</a> Int J Mol Sci. 14 (5), 10343-10354 (2013).</li>
<li>Su, M., Zhong, W., Ren, S. <a target="_blank" href="https://www.ajol.info/index.php/tjpr/article/view/139098">Dose-dependent protection of reseveratrol against spinal cord ischemic-reperfusion injury in rats.</a> Trop J Pharm Res. 15 (6), 1225-1233 (2016).</li>
<li>Haapanen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+ischemic+preconditioning+protects+the+spinal+cord+against+ischemic+insult%3A+An+experimental+study+in+a+porcine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thorac+Cardiovasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Remote ischemic preconditioning protects the spinal cord against ischemic insult: An experimental study in a porcine model.</a> J Thorac Cardiovasc Surg. 151 (3), 777-785 (2016).</li>
<li>Conrad, M. F., Ye, J. Y., Chung, T. K., Davison, J. K., Cambria, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+complications+after+thoracic+aortic+surgery%3A+long-term+survival+and+functional+status+varies+with+deficit+severity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Spinal cord complications after thoracic aortic surgery: long-term survival and functional status varies with deficit severity.</a> J Vasc Surg. 48 (1), 47-53 (2008).</li>
<li>Wong, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+spinal+cord+deficits+after+thoracoabdominal+aortic+aneurysm+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Thorac+Surg%22%5BJournal%5D)">Delayed spinal cord deficits after thoracoabdominal aortic aneurysm repair.</a> Ann Thorac Surg. 83 (4), 1345-1355 (2007).</li>
<li>Freeman, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-2+agonist+attenuates+ischemic+injury+in+spinal+cord+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Alpha-2 agonist attenuates ischemic injury in spinal cord neurons.</a> J Surg Res. 195 (1), 21-28 (2015).</li>
<li>Freeman, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+protection+via+alpha-2+agonist-mediated+increase+in+glial+cell-line-derived+neurotrophic+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thorac+Cardiovasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Spinal cord protection via alpha-2 agonist-mediated increase in glial cell-line-derived neurotrophic factor.</a> J Thorac Cardiovasc Surg. 149 (2), 578-586 (2015).</li>
</ol>

למחברים אין גילויים.

טכניקה זו מאפשרת תרבות אמין של נוירונים חוט השדרה. לאחר מיומנות הטכניקה מושגת, זה לוקח בערך 3.5 שעות כדי להשלים. הצלחנו לבצע את הבידוד של נוירונים מ 2 litters נפרדים (16 סה&quot;כ עכברים) כ 4 שעות. צעד המפתח היתכנות היא היכולת לחלץ את חוט השדרה מן העכברים. התשואה מאפשרת ציפוי כמה בארות ועל היכולת לבחון את הנוירונים בתנאים שונים. הצלחנו לטפל נוירונים לאחר בגרות להעריך באופן אמין ביטוי חלבון באמצעות ניתוח כתם המערבי. יתר על כן, באמצעות שקופיות זכוכית בתוך הבארות עבור קבצים מצורפים נ...

<html> הבנת הפתולוגיה של חוט השדרה מחייבת שימוש במודלים שונים, הן ברמה המקרוסקופית והן ברמת המיקרוסקופיה. דגמי בעלי חיים גדולים וקטנים 1 , 2 , 3 משמשים בחקירות vivo של מחלת חוט השדרה ופציעה. בעוד שלומדים נושאים אלה in vivo יש את היתרונות שלה, ניתוח של חוט השדרה מוגבל homogenate חוט השדרה כולו או לסעיפים רקמות 4 . זה יוצר כמה עמימות כאשר מנסים לבודד תגובות ספציפיות ומטרות בעמוד השדרה בין נוירונים תושביה גליה הסובבים אותה. הזמינות הגוברת של עכברים מניפולציות גנטית מאפשרת חקירות מפורטות יותר של הביולוגיה ברמות תאית ומולקולרית. לכן, מודל העכבר הילוד משמש כאן, המאפשר ללמוד את המאפיינים הייחודיים והביולוגיה של נוירונים חוט השדרה במבחנה . &quot;הבידוד והשימור של נוירונים במבחנה אינו פשוט במיוחד.יש שפע של טכניקות לבידוד נוירון מן רקמת קליפת המוח של מכרסמים בוגרים, כי נראה לגרום למספר ניכר של נוירונים מבודדים ( כלומר מיליונים) 5 , 6 , 7. לעומת זאת, התשואה של נוירונים מרקמת חוט השדרה הוא נמוך 8 , 9 , 10 , בין השאר בשל המסה הקטנה של רקמות.יתר על כן, בעכברים, יש מיעוט יחסית של טכניקות לבידוד של הילודים נוירונים של חוט השדרה, ושיטות קיימות מוגבלים על ידי תשואות נוירונים נמוכות יותר ( כלומר מאות) 9 או מטורפות ומשאבים כבדים טכניקות הדורשות בידוד של עכברים עובריים 10 . בפרוטוקול זה, אנחנולהשתמש בטכניקה המאפשרת בידוד עלות משאבים יעיל של מספר ניכר של נוירונים מן החוט השדרה של עכברים בילודים. כפי נפוץ בטכניקות שפורסמו בעבר, אנו משתמשים papain כמו פרוטאז אנזימטי, המאפשר לשחרור של נוירונים מרקמת חוט השדרה 5 , 6 . בנוסף, אנו משתמשים שיפוע צפיפות הפרדת תאים מעודן, אשר בעבר הוכח להיות יעיל 6 , 10 . בעוד המדיום שבו תאים מודגרת יכול להשתנות, מניסיוננו כפי שפורסם בעבר 11 , תוספת עם תוסף בינוני B27 בינוני הוכיחה להיות קריטי עבור אריכות ימים נוירון. נוירונים הם בדרך כלל קיימא עבור עד 10 ימים, המאפשר טיפול להתבצע.

<table><tbody><tr><td>Hibernate A בינוני - 500 מ"ל</td><td>Thermo-Fisher</td><td>A1247501</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1247501</td></tr><tr><td>Hibernate A מינוס סידן - 500 מ"ל</td><td>Brainbits</td><td>HA-Ca</td><td>http://www.brainbitsllc.com/hibernate-a-minus-calcium/</td></tr> <tr><td>Glutamax 100X - 100 מ"ל</td><td>Thermo-Fisher</td><td>35050061 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/35050079</td><td></td></tr><tr><td>תוסף B27 50X - 10 מ"ל</td><td>תרמו-פישר</td><td>17504044</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/17504044</td></tr><tr><td>פפאין, ליופיליזציה - 100 מ"ג</td><td>וורת'ינגטון</td><td>LS003119</td><td>http://www.worthington-biochem.com/pap/cat.html</td></tr><tr><td>נוירובזל A בינוני - 500 מ"ל</td><td>תרמו-פישר</td><td>10888022</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10888022</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 יח"ל/מ"ל)</td><td>תרמו-פישר</td><td>15140122</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122</td></tr><tr><td>פולי-די-ליזין (PDL) הידרוברומיד - 5 מ"ג</td><td>למינין עכבר http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p6407?lang=en&region=US סיגמא-אולדריץ</td>' <td>P6407-5 מ"</td><td></td></tr><tr><td>ג - 1 מ"ג</td><td>תרמו-פישר</td><td>23017015</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23017015</td></tr><tr><td>טריפאן כחול - 20 מ"ל</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T8154-20 מ"ל</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t8154?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>שיפוע צפיפות OptiPrep בינוני - 250 מ"ל</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D1556-250 מ"ל</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d1556?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>דיכלורודימתילסילן ( DMDCS, סיגמא סיליקואט)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>440272-100 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440272?lang=en&region=US כלורופורם</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>288306-1 ליטר</td><td></td></tr><tr><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en&region=US זכוכית פיפטה - 9 אינץ'</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>נורת פיפטה http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls7095d9?lang=en&region=US - 5 מ"ל</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z186678-3EA</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/z186678?lang=en&region=US&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold10-1</td></tr><tr><td>BRAND&reg; &nbsp; צלחת פטרי, זכוכית - 60 x 15 מ"מ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR455717-10EA</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/br455717?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>צלחת תרבית תאים סטרילית 24 בארות</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8812-100EA</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8812?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>Hausser Hemacytometer (תא ספירת זכוכית)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>02-671-6</td><td></td></tr><tr><td>https://www.fishersci.com/shop/products/hausser-bright-line-phase-hemacytometer-hemacytometer/026716 שקופיות זכוכית - זכוכית כיסוי סטרילית 12 מ"מ - לא מצופה</td><td>Neuvitro</td><td>GG-12-1.5-Pre</td><td></td></tr><tr><td>http://www.neuvitro.com/german-coverslip-12mm-diameter.htm NeuN Rabbit נוגדן חד שבטי - 100 ומיקרו; L</td><td>Abcam</td><td>ab177487</td><td>לאחר קיבוע בפרפורמלדהיד (PFA) וחסימה עם 5% BSA, תאים על כיסוי כיסוי של 12 מ"מ הודגרו בנוגדנים מדוללים 1:200 למשך 18 שעות ב-4 מעלות; </td></tr><tr><td>C MAP-2 נוגדן חד שבטי לעכבר - 50 ומיקרו; L</td><td>Abcam</td><td>ab11267</td><td>לאחר קיבוע בפרפורמלדהיד וחסימה עם 5% BSA, תאים על כיסוי כיסוי של 12 מ"מ הודגרו בנוגדנים מדוללים 1:500 למשך 18 שעות ב-4 מעלות; ג</td></tr></tbody></table>

נוירונים חוט השדרה בידוד ותרבות מ עכברים ניאונטליים

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

אנו מציגים פרוטוקול לבידוד ותרבות של נוירונים של חוט השדרה. הנוירונים מתקבלים C57BL הילוד / 6 עכברים מבודדים על הלידה 1-3 יום. עכבר המלטה, בדרך כלל 4-10 גורים שנולדו מתוך זוג הרבייה אחד, נאסף לניסוי אחד, מיתרי השדרה נאספים בנפרד מכל עכבר לאחר המתת חסד עם isoflurane. עמוד השדרה הוא גזור החוצה ואז חוט השדרה הוא שוחרר מן הטור. חוט השדרה הם לאחר מכן טחון כדי להגדיל את פני השטח של המשלוח עבור פרוטאז אנזימטי המאפשר נוירונים ותאים אחרים להשתחרר מן הרקמה. Trituration משמש לאחר מכן כדי לשחרר את התאים לתוך פתרון. פתרון זה מחולק לאחר מכן ב שיפוע צפיפות להפריד בין תאים שונים בתמיסה, המאפשר נוירונים להיות מבודדים. בערך 1-2.5 x 10 6 נוירונים יכול להיות מבודדים מקבוצה אחת המלטה. הנוירונים הם seeded אז על בארות מצופה דבק FactoRs המאפשרים צמיחה נכונה והתבגרות. הנוירונים לוקחים בערך 7 ימים כדי להגיע לבגרות במדיום הצמיחה והתרבות וניתן להשתמש בהם לאחר מכן לטיפול וניתוח.

באמצעות טכניקה זו, יחיד המלטה (4-10 גורים) מאפשר בידוד של 1-2.5 10 6 נוירונים מתאים זריעה על צלחות תרבות. בדרך כלל, בארות 4-8 הם seeded בריכוז שהוזכר לעיל ( כלומר 300,000 תאים / מ&quot;ל). איור 3 מראה את המראה של נוירונים בריכוז זה לאחר שבוע בתרבות ב נמוך ( א ) גבוה ( ב ) מיקרוסקופ אור הגדלה. עם זאת, יש לנו גם מסוגל לתאי התרבות בריכוזים גבוהים כמו 500,000 תאים / טוב...

מחקר זה מציג טכניקה לבידוד של נוירונים מ WT עכברים neonatal. זה דורש דיסקציה זהיר של חוט השדרה מן העכבר הילוד, ואחריו הפרדת הנוירונים של רקמת חוט השדרה דרך מחשוף מכני אנזימטי.

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא היכולת לבודד באופן חוזר ועקבי נוירונים של חוט השדרה שניתן להשתמש בהם במגוון ניסויים. שיטה זו עשויה לאפשר לנו להעמיק את ההבנה לגבי הביולוגיה של נוירונים בחוט השדרה, ובתקווה להבין את תגובתם למגוון של גורמי לחץ. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת בידוד של מספר משמעותי של נוירונים, ובכך מאפשרת להשתמש בנוירונים אלה במגוון רחב של ניסויים.הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן שלב הטרטורציה (Trituration), שבו מבודדים נוירונים באופן מכני מהרקמה, דורש זמן מסוים למיומנות, וזאת כדי להבטיח בידוד של נוירונים בריאים מבלי להמית אותם. כדי להתחיל בהליך זה, הפרידו בעזרת מספריים את הראש מגוף גורי העכברים שהורגזו.לאחר מכן, הסר את העור באמצעות מספרי איריס מעוקלים. לאחר מכן, חתוך את חוט השדרה מאזור המותניים, ממש מעל הירכיים, ואז חתוך את שני צדי בית החזה כדי להפרידו מהגוף. שטוף את הדגימות באופן רצף בשלוש צלחות פטרי בקוטר 10 centimeter, המכילות five milliliters של PBS סטרילי, למשך 10 שניות בכל פעם, כדי להסיר רקמה עודפת.לאחר מכן, הכניסו מחט בכישור (gauge) 22 ומזרק מלא בחמישה מיליליטר של PBS סטרילי אל הקצה הזנבי של עמוד השדרה והזרימו לכיוון הגולגולת (cranially), כך שחוט השדרה ייצא אל צלחית פטרי רביעית. העבירו את חוט השדרה למבחנה של 15 מיליליטר עם חמישה מיליליטר של HA

spinal-cord-neurons-isolation-and-culture-from-neonatal-mice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

הפגנה של בידוד של חוט השדרה בילוד עכבר ללימודי אלקטרו.

חוט השדרה Electrophysiology

דרך אלטרנטיבית של בידוד motoneurons עכבר עובריים מן חוט השדרה מתואר. השיטה לוקחת בחשבון את העובדה לקטינים יכולים לאגד את הזיקה נמוך עצב p75NTR גורם הגדילה לקולטן. זה preplating לקטינים מבוססי מאפשרת טיהור דומה לזה עם נוגדן ספציפי נגד p75NTR.

לקטינים מבוססי בידוד תרבות Motoneurons עכבר עובריים

בסרטון זה אנו מתארים פרוטוקול שלב אחר שלב לבידוד נוירונים בעמוד השדרה מעכבר יילודים לצורך מחקרי מבחנה.

בידוד נוירונים בחוט השדרה: הליך שיפוע צפיפות לבידוד נוירונים בעמוד השדרה בילודים למחקרי מבחנה

הסרטון מדגים את הבידוד של נוירונים מוטוריים, טרוכליאריים ומוטוריים בעמוד השדרה מעובר עכבר מהונדס. העובר מבטא נוירונים מוטוריים המסומנים בחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) להדמיה וזיהוי קלים. הנוירונים המוטוריים מבודדים בניתוח תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ונשמרים בתווך תרבית.

בידוד ותרבית של נוירונים אוקולומוטוריים, טרוכליאריים ומוטוריים בעמוד השדרה מעובר עכבר

הסרטון הדגים את השיטה של בידוד וטיפוח תאים ממוחו של עכבר בילוד. היא כללה דיסוציאציה אנזימטית ומכנית של המוח, ואחריה תרבית במצע גדילה חסר גורם גדילה עצבי כדי להשיג אוכלוסיית גלייה מעורבת.

השגת תרבית תאי גליה מעורבת ממוח עכבר יילוד

סרטון זה מדגים טכניקה לבידוד וטיפוח תאי גלייה מעורבים ראשוניים מרקמת חוט השדרה של עכבר בוגר. הפרוטוקול כולל עיכול אנזימטי של הרקמה, ואחריו הסרת קרומי תאים שבורים ופסולת מיאלין כדי להשיג אוכלוסייה של תא יחיד. לאחר מכן התאים מתורבתים במדיה המותאמת לגידול תאי גלייה מעורבים.

הקמת תרביות תאי גליה מעורבים ראשוניים מחוט השדרה של עכבר

אנו מתארים שיטות לבידוד היעילה ומהיר / התרבות של microglia קיימא מקליפת המוח וחוט השדרה בילוד מבוגר. הנתיחה והציפוי של microglia קליפת המוח יכולים להיות מושלמת תוך 90 דקות, עם קציר microglial שלאחר מכן מתקיים ~ 10 ימים לאחר הנתיחה הראשונית.

Microglia culturing ממערכת העצבים המרכזי וילודים למבוגרים

ניהול ניסויים בלתי מתורבת כדי לשקף את התנאים הvivo ככל האפשר, אינו משימה קלה. השימוש בתרביות תאים ראשונית הוא צעד חשוב להבנת הביולוגיה התאית באורגניזם שלם. הפרוטוקול שסופקו מתאר כיצד לצמוח בהצלחה תרבות עובריים העכבר מתחלקים נוירונים.

התרבות הראשית של הנוירונים מבודדים מתוך עכבר ממוח עובריים

עבודה זו מציגה פרוטוקול להניב התרבויות תאים הומוגנית של מנוע התנועה הראשוני, trochlear, ומנועי השדרה נוירונים. תרבויות אלה ניתן להשתמש לניתוחים השוואתיים של מורפולוגית, תאית, מולקולרית, ו אלקטרופיזיולוגיה המאפיינים של נוירונים מנוע העינית השדרה.

בידוד ותרבות של והעושות, טרוליר, ושדרה מוטוריים נוירונים מ בטרום לידתי : עכברים הטרנסגניים

פרוטוקול זה מציג דרך ייחודית ליצירת תרביות תאים של מערכת העצבים המרכזית ממוחות עכברים עובריים ביום ה-17 לצורך מחקר נוירו(אימונו)לוגי. ניתן לנתח מודל זה באמצעות טכניקות ניסיוניות שונות, כולל RT-qPCR, מיקרוסקופיה, ELISA וציטומטריית זרימה.

ביסוס תרביות תאי עצב וגליה מעורבים ממוחות עכברים עובריים לחקר זיהומים וחסינות מולדת

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של אסטרוציטים מטוהרים ותאי מיקרוגליה מחוט השדרה של העכבר הבוגר, ומקל על יישומים עתידיים כגון ניתוח RNA ותרבית תאים. הוא כולל שיטות ונהלים מפורטים לדיסוציאציה של תאים שנועדו לשפר הן את האיכות והן את התפוקה של תאים מבודדים.

בידוד אסטרוציטים טהורים ותאי מיקרוגליה מחוט השדרה של העכבר הבוגר עבור בדיקות חוץ גופיות ומחקרי שעתוק

למדו שיטה לאיסולציה של נוירונים מחוט השדרה בעכברים ניאונטליים באמצעות פירוק מכני ואנזימטי. טכניקה זו מאפשרת לחקור את הביולוגיה של הנוירונים ותגובתם למגוון מאמצים.

נוירונים חוט השדרה בידוד ותרבות מ עכברים ניאונטליים

גלה סרטונים נוספים