Name: הצלה אפיון של וירוס רקומביננטי מעולם חדש Zika וירוס זיהום מזוהם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: למדו כיצד להשיב וירוס זיקה זיהומי מקלון cDNA דו-פלסמידי. שיטה זו מאפשרת חקר אסטרטגיות חיסון, פתוגנזה ואבולוציה ויראלית בפלביוירולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לקריסטן בולרד-פייבלמן, למילנה וסלינוביץ וקלאודיה רוקר על עזרתם באפיון הווירוס הנגזר משבטים. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענקים של המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות, NIH תחת מענקים AI114675 (BJG) ו AI067380 (GDE).

<ol><li>Kindhauser, M. K., Allen, T., Frank, V., Santhana, R. S., Dye, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika%3A+the+origin+and+spread+of+a+mosquito-borne+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+World+Health+Organ%22%5BJournal%5D)">Zika: the origin and spread of a mosquito-borne virus.</a> Bull World Health Organ. 94 (9), 675C-686C (2016).</li>
<li>Oehler, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+infection+complicated+by+Guillain-Barre+syndrome--case+report%2C+French+Polynesia%2C+December+2013%5BTitle%5D)+AND+%22Euro+Surveill%22%5BJournal%5D)">Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome--case report, French Polynesia, December 2013.</a> Euro Surveill. 19 (9), (2014).</li>
<li>Li, D., Aaskov, J., Lott, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+cryptic+prokaryotic+promoter+within+the+cDNA+encoding+the+5%27+end+of+dengue+virus+RNA+genome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of a cryptic prokaryotic promoter within the cDNA encoding the 5' end of dengue virus RNA genome.</a> PLoS One. 6 (3), e18197(2011).</li>
<li>Pu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+to+propagate+flavivirus+infectious+cDNA+clones+in+bacteria+by+introducing+tandem+repeat+sequences+upstream+of+virus+genome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">A novel approach to propagate flavivirus infectious cDNA clones in bacteria by introducing tandem repeat sequences upstream of virus genome.</a> J Gen Virol. 95 (Pt 7), 1493-1503 (2014).</li>
<li>Pu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+propagation+of+flavivirus+infectious+cDNAs+by+a+novel+method+to+reduce+the+cryptic+bacterial+promoter+activity+of+virus+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Successful propagation of flavivirus infectious cDNAs by a novel method to reduce the cryptic bacterial promoter activity of virus genomes.</a> J Virol. 85 (6), 2927-2941 (2011).</li>
<li>Rice, C. M., Grakoui, A., Galler, R., Chambers, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+of+infectious+yellow+fever+RNA+from+full-length+cDNA+templates+produced+by+in+vitro+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22New+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcription of infectious yellow fever RNA from full-length cDNA templates produced by in vitro ligation.</a> New Biol. 1 (3), 285-296 (1989).</li>
<li>Yun, S. I., Kim, S. Y., Rice, C. M., Lee, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+a+reverse+genetics+system+for+Japanese+encephalitis+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Development and application of a reverse genetics system for Japanese encephalitis virus.</a> J Virol. 77 (11), 6450-6465 (2003).</li>
<li>Gualano, R. C., Pryor, M. J., Cauchi, M. R., Wright, P. J., Davidson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+major+determinant+of+mouse+neurovirulence+of+dengue+virus+type+2+using+stably+cloned+genomic-length+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of a major determinant of mouse neurovirulence of dengue virus type 2 using stably cloned genomic-length cDNA.</a> J Gen Virol. 79 (Pt 3), 437-446 (1998).</li>
<li>Johansen, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intron+insertion+facilitates+amplification+of+cloned+virus+cDNA+in+Escherichia+coli+while+biological+activity+is+reestablished+after+transcription+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Intron insertion facilitates amplification of cloned virus cDNA in Escherichia coli while biological activity is reestablished after transcription in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (22), 12400-12405 (1996).</li>
<li>Shan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Infectious+cDNA+Clone+of+Zika+Virus+to+Study+Viral+Virulence%2C+Mosquito+Transmission%2C+and+Antiviral+Inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">An Infectious cDNA Clone of Zika Virus to Study Viral Virulence, Mosquito Transmission, and Antiviral Inhibitors.</a> Cell Host Microbe. 19 (6), 891-900 (2016).</li>
<li>Schwarz, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+the+1947+Zika+Virus+Prototype+Strain+with+a+Cytomegalovirus+Promoter-Driven+cDNA+Clone%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Rescue of the 1947 Zika Virus Prototype Strain with a Cytomegalovirus Promoter-Driven cDNA Clone.</a> mSphere. 1 (5), (2016).</li>
<li>Tsetsarkin, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Full-Length+Infectious+cDNA+Clone+of+Zika+Virus+from+the+2015+Epidemic+in+Brazil+as+a+Genetic+Platform+for+Studies+of+Virus-Host+Interactions+and+Vaccine+Development%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">A Full-Length Infectious cDNA Clone of Zika Virus from the 2015 Epidemic in Brazil as a Genetic Platform for Studies of Virus-Host Interactions and Vaccine Development.</a> MBio. 7 (4), (2016).</li>
<li>Gadea, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+method+for+the+rapid+generation+of+recombinant+Zika+virus+expressing+the+GFP+reporter+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">A robust method for the rapid generation of recombinant Zika virus expressing the GFP reporter gene.</a> Virology. 497, 157-162 (2016).</li>
<li>Kapoor, M., Zhang, L., Mohan, P. M., Padmanabhan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+an+infectious+dengue+virus+type-2+RNA+genome+%28New+Guinea+C+strain%29%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of an infectious dengue virus type-2 RNA genome (New Guinea C strain).</a> Gene. 162 (2), 175-180 (1995).</li>
<li>Messer, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+reverse+genetic+system+for+studying+dengue+virus+serotype+3+strain+variation+and+neutralization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a reverse genetic system for studying dengue virus serotype 3 strain variation and neutralization.</a> PLoS Negl Trop Dis. 6 (2), e1486(2012).</li>
<li>Kinney, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avian+virulence+and+thermostable+replication+of+the+North+American+strain+of+West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Avian virulence and thermostable replication of the North American strain of West Nile virus.</a> J Gen Virol. 87 (Pt 12), 3611-3622 (2006).</li>
<li>Chang, A. C., Cohen, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+characterization+of+amplifiable+multicopy+DNA+cloning+vehicles+derived+from+the+P15A+cryptic+miniplasmid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the P15A cryptic miniplasmid.</a> J Bacteriol. 134 (3), 1141-1156 (1978).</li>
<li>Weger-Lucarelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Characterization+of+Recombinant+Virus+Generated+from+a+New+World+Zika+Virus+Infectious+Clone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Development and Characterization of Recombinant Virus Generated from a New World Zika Virus Infectious Clone.</a> J Virol. 91 (1), (2017).</li>
<li>Roberts, P. L., Lloyd, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus+inactivation+by+protein+denaturants+used+in+affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Biologicals%22%5BJournal%5D)">Virus inactivation by protein denaturants used in affinity chromatography.</a> Biologicals. 35 (4), 343-347 (2007).</li>
<li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+concentration+determination+through+plaque+assays%3A+using+traditional+and+novel+overlay+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems.</a> J Vis Exp. (93), e52065(2014).</li>
<li>Weger-Lucarelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Characterization+of+Recombinant+Virus+Generated+from+a+New+World+Zika+Virus+Infectious+Clone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Development and Characterization of Recombinant Virus Generated from a New World Zika Virus Infectious Clone.</a> J Virol. , (2016).</li>
<li>Grubaugh, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Drift+during+Systemic+Arbovirus+Infection+of+Mosquito+Vectors+Leads+to+Decreased+Relative+Fitness+during+Host+Switching%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Genetic Drift during Systemic Arbovirus Infection of Mosquito Vectors Leads to Decreased Relative Fitness during Host Switching.</a> Cell Host Microbe. 19 (4), 481-492 (2016).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

כאן אנו מתארים שיטה לשחזור מערכת שיבוט cDNA זיהומית דו-חלקית עבור ZIKV. שיבוטים שתוארו בעבר עבור ZIKV סובלים מהנחתה או דורשים תוספת של אינטרונים, מה שהופך את הפלסמידים לגדולים יותר ומונע הצלה בתאי חרקים. ניתן לשחזר וירוס זיהומי באמצעות מערכת שיבוט דו-פלסמידית בתאי יונקים או חרקים (הנתונים אינם מוצגים). בנוסף, הנגיף שהתאושש ממערכת זו מתנהג באופן דומה לנגיף מסוג פרא במספר קווי תאים, במודל של עכברים מדוכאי חיסון וביתושים. 
בשל נוכחותם של מקדמי חיידקים קריפטיים בגנום של flavivirus<sup class='xref'...

נגיף זיקה (ZIKV: משפחה Flaviviridae : Genus Flavivirus ) הוא flavivirus שנולדו יתוש שהגיע בברזיל ב 2013-14 ו היה קשור לאחר מכן עם התפרצות מסיבית של מחלה חום כי התפשטה ברחבי אמריקה 1 . בנוסף, ZIKV נקשר לתוצאות חמורות של המחלה, כגון תסמונת Guillain-Barré במבוגרים ו מיקרוסקפליה בעוברים ובילודים. מעט ידוע על ZIKV לפני התפשטותה המהירה בחצי הכדור המערבי. זה כלל היעדר כלים מולקולריים, ובכך מעכב מחקר מכניסטי. כלים מולקולריים לווירוסים, כגון שיבוטים cDNA זיהומיות, להקל על החיסון ועל התפתחות טיפולית אנטי ויראלית, ולאפשר הערכה של גורמים גנטיים ויראליים הקשורים פתוגנזה ויראלי דיפרנציאלי, התגובה החיסונית ואת האבולוציה ויראלי. Flavivirus שיבוטים זיהומיות ידועים להיות מאוד לא יציבים חיידקים עקב CRיזמים prokaryotic yptic הנוכחי בגנום שלהם 3 . מספר גישות שימשו לשיפור הבעיה; כולל החדרת טנדם חוזרת במעלה הזרם של רצפים ויראליים 4 , מוטציה של רצפים prokaryotic משוער prokaryotic 5 , פיצול הגנום למספר פלסמידים 6 , וקטורים מספר להעתיק נמוך (כולל כרומוזומים מלאכותיים חיידקים) 7 , 8 והכנסת אינטרונים בגנום ויראלי 9 . מערכת אחת באורך מלא ללא שינויים תוארה עבור ZIKV; עם זאת, שיבוט זה נראה להיות מוחלש בתרבית תאים בעכברים 10 . קבוצות אחרות יש מהונדסים אינטרונים לתוך הגנום ZIKV, המאפשר הפרעה רצפים יציבים חיידקים שיכולים להיות spliced ​​החוצה בתאי יונקים במבחנה לייצור וירוס זיהומיות 11, 12 . בנוסף, מערכת מבוססת PCR בשם זיהום Subgenomic-Amplicons שימש בהצלחה להציל את אב טיפוס MR766 אב טיפוס של ZIKV 13 . הגישה המתוארת כאן אינה דורשת רצפים זרים, אלא משבשת את הגנום באזור של חוסר יציבות גבוהה באמצעות פלסמידים מרובים, אשר בעבר נעשה שימוש בהצלחה עם קדחת צהובה 6 , דנגה 14 , 15 ו נילוס המערבי וירוסים 16 . יתר על כן, תוספת של רצף הפטיטיס D ribozyme על טרמיני הגנומי ויראלי מקל על יצירת של 3 אות &#39;אותנטי ללא צורך הוספת של האתר linearization. בנוסף, הן פלסמידים בנויים וקטור מספר עותק נמוך (pACYC177, ~ 15 עותקים לכל תא) כדי למתן כל רעילות שיורית 17 . הנגיף התאושש מציג פרופיל צמיחה דומהנגיף הוריתי ב עקומות הצמיחה במבחנה 8 שורות תאים המרכיבים מגוון של סוגי תאים נגזר הן יונקים וחרקים, וכן הציג פרופילים פתוגניים זהים בעכברים זיהום, הפצה ושיעורי תעבורה יתושים 18 . להלן, אנו מפרטים בפרוטוקול המתאר כיצד לגדל את פלסמידים משוכפלים זיהומיות, ליצור אורך מלא RNA ויראלי (הגנום ויראלי) במבחנה, ולשחזר וירוס זיהומיות בתרבית תאים. ראשית, אנו מתארים את התפשטות של פלסמידים חיידקים או חיידקים ללא הגברה באמצעות הגברה מעגל הגברה (RCA). לאחר מכן, אנו מראים כיצד שני פלסמידים מתעכלים ולאחר מכן ligated לאחר מכן יחד כדי ליצור וירוס באורך מלא. לבסוף, אנו מתארים את הייצור של רנ&quot;א transcript ו electroporation הבאים שלה לתוך תאים Vero, ואחריו טיטרציה של וירוס התאושש ( איור 1 ). הגישה המתוארת היא מהירה, המאפשרתR ההתאוששות של מניות זיהומיות וירוס בשבועות 1-2.

<table><tbody><tr><td>NEB יציב CompetentE. קולי</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>C3040H</td><td></td></tr><tr><td>קרבניצילין, מלח דיסודיום</td><td></td> ערכת מיני-הכנה של Zyppy פלסמיד שונים <td></td><td></td></tr><tr><td>Zymo</td><td>Research</td><td>D4036</td><td></td></tr><tr><td>ZymoPURE פלסמיד Maxiprep ערכת</td><td>Zymo Research</td><td>D4202</td><td></td></tr><tr><td>SalI-HF</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>R3138S</td><td>20,000 יחידות/מ"ל</td></tr><tr><td>NheI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3131S</td><td>20,000 יחידות/מ"ל</td></tr><tr><td>ApaLI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0507S</td><td>10,000 יחידות/מ"ל</td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3101S</td><td>20,000 יחידות/מ"ל</td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3136S</td><td>20,000 יחידות/מ"ל</td></tr><tr><td>HindIII-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3104S</td><td>20,000 יחידות/מ"ל</td></tr><tr><td>ערכת הגברה של illustra TempliPhi 100 GE</td><td>Healthcare Life Sciences</td><td>25640010</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin ג'ל וניקוי PCR</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.5</td><td></td></tr><tr><td>שרימפס אלקליין פוספטאז (rSAP)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0371S</td><td>1,000 יחידות/מ"ל</td></tr><tr><td>פוספטאז אלקליין, מעי עגל (CIP)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0290S</td><td>10,000 יחידות/מ"ל</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>M0202S</td><td>400,000 יחידות/מ"ל</td></tr><tr><td>HiScribe T7 ARCA mRNA Kit</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>E2065S</td><td></td></tr><tr><td>תאי Vero</td><td>ATCC</td><td>CCL-81</td><td></td></tr><tr><td>ECM 630 מערכת אלקטרופורציה בתפוקה גבוהה</td><td>BTX</td><td>45-0423</td><td>מכונות אחרות מקובלות.</td></tr><tr><td>מרק LB עם אגר (מילר)</td><td>Sigma</td><td>L3147</td><td>יכול להיות גם תוצרת בית.</td></tr><tr><td>מרק נהדר</td><td>Sigma</td><td>T0918</td><td>יכול להיות גם תוצרת בית.</td></tr><tr><td>פטרי צלחת</td><td>Celltreat</td><td>229693</td><td></td></tr><tr><td>צינורות תרבות</td><td>VWR International</td><td>60818-576</td><td></td></tr><tr><td>T75 צלוחיות</td><td>Celltreat</td><td>229340</td><td></td></tr><tr><td>T182 צלוחיות</td><td>Celltreat</td><td>229350</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>קורנינג</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 עם L-גלוטמין</td><td>קורנינג</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM עם L-גלוטמין ו-4.5 גרם/ליטר גלוקוז</td><td>קורנינג</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Atlas Biologicals</td><td>FP-0500-A</td><td></td></tr><tr><td>אבקת טרגקנת'</td><td>MP ביו</td><td>MP 104792</td><td></td></tr><tr><td>קריסטל סגול</td><td>אמרסקו</td><td>0528-1006</td><td></td></tr><tr><td>אתנול מפוגל</td><td>VWR International</td><td>BDH1156-1LP</td><td></td></tr><tr><td>צלחת</td> <td>6 בארותCelltreat</td><td>229106</td><td></td></tr><tr><td>12 צלחת באר</td><td>Celltreat</td><td>229111</td><td></td></tr><tr><td>רצף אוליגוס</td><td>IDT</td><td>ראה טבלה 1</td><td></td></tr><tr><td>קיוביט 3.0</td><td>ThermoFisher</td><td>קיוביט 3.0</td><td>שיטות אחרות מקובלות.</td></tr><tr><td>ערכת בדיקה של Qubit dsDNA BR</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32850</td><td>שיטות אחרות מקובלות.</td></tr><tr><td>ערכת בדיקה של Qubit RNA HS</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32852</td><td>שיטות אחרות מקובלות.</td></tr><tr><td>ארון בטיחות ביולוגית Class II</td><td>משתנה</td><td>N/A</td><td>זה הכרחי לעבודה עם וירוסים חיים.</td></tr></tbody></table>

הצלה אפיון של וירוס רקומביננטי מעולם חדש zika וירוס זיהום מזוהם

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

שיבוטים cDNA זיהומיות לאפשר מניפולציה גנטית של הנגיף, ובכך להקל על עבודה על חיסונים, פתוגנזה, שכפול, שידור האבולוציה ויראלי. כאן אנו מתארים את הבנייה של שיבוט זיהומיות עבור Zika וירוס (ZIKV), אשר כרגע גורם להתפרצות נפץ באמריקה. כדי למנוע רעילות לחיידקים, כי הוא נצפה בדרך כלל עם פלסמידים הנגזרים flavivirus, יצרנו מערכת שני פלסמיד המפריד בין הגנום בגן NS1 והוא יציב יותר מאשר באורך מלא בונה שלא ניתן לשחזר בהצלחה ללא מוטציות. לאחר עיכול קשירת להצטרף שני קטעים, RNA ויראלי באורך מלא יכול להיווצר על ידי שעתוק במבחנה עם פולימרז T7 RNA. בעקבות electroporation של RNA transcribed לתאים, וירוס היה התאושש כי הציג דומה קינטיקה הצמיחה במבחנה ב vivo ארסיות פנוטיפים זיהום בעכברים ויתושים, בהתאמה.

פרוטוקול המתואר כאן מאפשר התאוששות של זיהום נגוע נגוע זיקה וירוס. מניפולציה של שני מערכת פלסמיד שיבוט זיהומיות היא פשוטה כאשר מבוצעת בזהירות, לעומת גירסאות באורך מלא, שהם מאוד לא יציבים (נתונים לא מוצגים). לאחר עיכול קשירת של שתי חתיכות נפרדות, כתרים CNA מיוצר באמצעות שעתוק במבחנה עם פולימראז T7 אשר לאחר מכן electroporated לתוך תאים Vero ( איור 1 ). רצף פלסמיד נכון ניתן לפקח באמצעות עיכול הגבלה כמו miniprep פר...

פרוטוקול זה מתאר את ההתאוששות של וירוס זיהום זיהומיות משני שיבוט cDNA שני פלסמיד זיהומיות.

הצלה אפיון של וירוס רקומביננטי מעולם חדש Zika וירוס זיהום מזוהם

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להפיק נגיף זיהומי משבט Z-DNA של נגיף זיקה בן שני חלקים. שיטה זו יכולה לספק תשובות לשאלות מפתח בתחום הפלאביו-וירוסולוגיה, כגון אסטרטגיות חיסון, פתוגנזה, העברה ואבולוציה של נגיפים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהמערכת בת שני החלקים יציבה יותר מגישות המבוססות על אורך מלא.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי נגיף זיקה, ניתן להחיל אותה גם על מערכות ויראליות אחרות שהוכחו כקשות לשיבוט עקב חוסר יציבות של הפלסמיד. את הפרוצדורה ידגים ג'יימס וגר, פוסט-דוקטור מהמעבדה שלי. התחילו בהכנת תגובות עיכול עבור שני הפלסמידים המקודדים לגנום של נגיף זיקה, P1 ו-P2. עכלו 3.3 micrograms של P1 באמצעות ApaL1 ו-BamH1 High Fidelity בנוכחות פוספטאזה כשנפח הסופי הוא 100 microliters.עבור P2, בצע עיכול של 13.3 micrograms של DNA של P2 עם ApaL1 ו-EcoR1 High Fidelity בנפח סופי של 100 microliters. דגרו את שתי התגובות ב-37 degrees celsius למשך 1.2 hours. לאחר טיהור הפלסמידים המעוכלים באמצעות ערכה מסחרית לניקוי ג'ל ו-PCR, הוסיפו לעמודה 30 microliters של בופר אלוציה שחומם מראש ל-70 degrees celsius ודגרו למשך חמש דקות.לאחר סבב צנטריפוגה להורדת הפלסמידים המעוכלים והמטוהרים, הכינו את תגובת הליגציה על ידי ערבוב של 29 µl של P1 מטוהר ו-29 µl של P2 מטוהר עם תמיסת בופר לתגובת ליגציית T4 DNA ו-T4 DNA ligase במים מזוקקים פעמיים לנפח סופי של 100 µl. דגרו את תגובת הליגציה בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. לאחר הדגירה, טהרו את הפלסמיד שעבר ליגציה כפי שבוצע קודם לכן.הפעם השתמש ב-10 µL של בופר אלוציה שחומם מראש. לאחר מכן, הרץ את הפלסמידים שלא עברו עיכול, הפלסמידים שעברו עיכול ואת תוצר הליגציה על ג'ל אגרוז. ליגציה מוצלחת אמורה להניב תוצר ליגציה של כ-11Kb.לאחר אישור שהפלסמידים רצים במשקל המולקולרי הנכון, הגדירו תגובת שעתוק T7 in vitro באמצעות שמונה µL של תגובת ליגציה מטוהרת והדגרירו למשך ארבע שעות ב-37 °C. לאחר ההדגירה, מדדו את ריכוז ה-RNA באמצעות ספקטרופוטומטר UV. יום או יומיים לפני האלקטרופורציה, הכינו בקבוק T182 אחד של תאי Vero עבור כל קונסטרוקט שייגבה.יש לכלול בקבוק T182 שישמש כביקורת אלקטרופורציה דמה (mock electroporation). כאשר התאים מגיעים לרמת התמזגות (confluency) של 70% עד 80%, יש לחמם DMEM המכיל 15% FBS ו-10 millimolar heaps באמבט מים המחומם ל-37 degrees celsius. יש להפריד את התאים באמצעות טריפסינציה לפי שיטות סטנדרטיות, ולאסוף את התאים ואת המצע המכיל 10% FBS לצורך נטרול הטריפסין.לאחר מכן, סבב את התאים בצנטריפוגה ב-150 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4 °C. לאחר שטיפת התאים שלוש פעמים ב-PBS, השעה כל משקע תאים ב-RPMI 1640 בתוספת 10 mM HEPES לריכוז של כ-0.5 × 10⁷ תאים למיליליטר. העבר 200 µL מתלהי התאים למבחנה סטרילית.בשלב הבא, הוסף 20 µL מים כביקורת דמי (mock control) או 20 µL של RNA לכל קבוצת תאים. ערבב את התאים בעדינות על ידי נקישה על המבחנה, ולאחר מכן העבר את תכולת המבחנה לכובית אלקטרופורציה בעלת מרווח של 2 mm. הגדר את מכשיר האלקטרופורציה ל-170 V, התנגדות של 0 Ω וקיבול של 950 µF.בצעו פולס אחד לתאים והוסיפו מיד 600 µL מהמצע שחומם מראש. העבירו את התאים לבקבוק תרבית רקמה T75 המכיל 10 mL של המצע שחומם מראש. הסירו כל שארית מצע מהקוובטה באמצעות הטפטפת המצורפת לקוובטה.סובב את הבקבוק כדי לערבב את המצע והתאים, ולאחר מכן הנח אותו באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C. למחרת ובכל יום לאחר מכן, בדוק את חיות התאים עד שתצפה למוות של 50% עד 75% מהתאים ביחס לבקרת ה-mock electroporated. כאשר נראה מוות של 50% עד 75% מהתאים, אסוף את העלייה (supernatant) לשפופרת קונית, ולאחר מכן צנטריפוגה במהירות של יותר מ-3,000 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C כדי להסיר פסולת תאית.לאחר הצנטריפוגציה, העבירו את העלייה (supernatant) המזוהרת למבחנה חדשה והוסיפו FBS עד לריכוז סופי של 20%. בנוסף, הוסיפו HEPES סטרילי עד לריכוז סופי של 10 millimolar כחומר בופר לשמירה על זיהומיות הנגיף בזמן ההקפאה. לבסוף, ערבבו את הנגיף באמצעות וורטקס וחלקו לאליקוטים במבחנות עם פקק הברגה. אחסנו את הנגיף בטמפרטורה של minus 80 degrees celsius לשימוש עתידי.תמונה זו מראה את ההשפעה דומה של נגיף Zika מסוג wild-type PRVABC59 ושל נגיף Zika שנגזר משיבט זיהומי (infectious clone) על קינטיקת הגדילה של קו תאי Vero מקרימטות שאינן אנושיות. תמונה זו מראה את השפעתם של שני הנגיפים על תאי שליה אנושיים. קינטיקת גדילה דומה נראית בקו תאי C6/36 שנגזר מיתושים.עקום הישרדות זה מציג נתונים שהתקבלו מעכברים בני ארבעה שבועות עם נוק-אאוט של רצפטורים לאינטרפרון alpha, beta ו-gamma, שהוחדרו ב-1,000 PFU של PRVABC59 או של הנגיף שהופק מהשבט הזיהומי. נשיקי Aedes aegypti נשחטו 14 ימים לאחר ארוחת דם שהכילה נגיף זיקה. בדיקת פלאקים (Plaque assay) שימשה להערכת הזיהום בגופי היתושים, ברגליים למדידת ההפצה, או בהפרשות הרוק למדידת ההעברה של נגיף זיהומי.השיעורים מוצגים כאחוז מכלל היתושים שנבדקו. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לבצע ריצוף של הנגיף כולו. כמו כן, חשוב לזכור לאסוף את הנגיף ב-50 עד 75% CPE כדי למזער את מחזורי השכפול הנגיפיים.טכניקה זו חשובה עבור חוקרים בתחום הפלביו-וירוסים (flavivirology) כדי לחקור חיסונים, פתוגנזה ואבולוציה של נגיף זיקה.

rescue-characterization-recombinant-virus-from-new-world-zika-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

הצלה של שפעת וירוסים מ-DNA פלסמיד היא טכניקה ניסויית בסיסי וחיוני המאפשר לחוקרים שפעת לייצר וירוסים רקומביננטי ללמוד היבטים מרובים הביולוגיה של נגיף השפעת, וכן לשמש וקטורים או חיסונים פוטנציאליים.

הדור של וירוס שפעת רקומביננטי מ-DNA פלסמיד

סרטון זה מדגים הליך להדבקת תאי גזע עצביים עובריים אנושיים בנגיף זיקה. התאים הנגועים יכולים לשמש למחקרים נוספים.

זיהום בנגיף הזיקה של תאי גזע עצביים עובריים

הצלת Arenaviruses רקומביננטי מcDNAs המשובטים, גישה המכונה להפוך גנטיקה, מאפשרת לחוקרים לחקור את התפקיד של מוצרים גנטיים נגיפיים ספציפיים, כמו גם את תרומתו של תחומים ושאריות הספציפיים השונים שלהם, להיבטים רבים ושונים של הביולוגיה של arenavirus . כמו כן, להפוך טכניקות גנטיקה בשורות תאי ה-FDA (Vero) לפיתוח חיסון מספק אפשרויות חדשות לייצור חיסונים יעילים ובטוחים כדי להילחם Arenaviruses פתוגניים אדם.

דור של Arenavirus רקומביננטי לפיתוח חיסון בתאי Vero-FDA

Zika Virus (ZIKV), פתוגן מתפתח, קשור להפרעות התפתחותיות בעובר ולמיקרוצפליה. הקמת מערכת תרבית תאים זיהומית יעילה היא חיונית למחקרים על שכפול ZIKV כמו גם לפיתוח חיסונים ותרופות. במחקר זה מומחשות ונדונות בדיקות וירולוגיות שונות הנוגעות לזיק"ו.

מערכת תרבית תאי זיהומיות וירוס זיקה ואת<em&gt; במבחנה</em&gt; אפקט מניעתי של אינטרפרונים

כאן נתאר שיטת יצירת מודל של Zika הנוצרות על-ידי וירוס microcephaly עכבר. פרוטוקול זה כולל שיטות חיסון גרם עובריים neonatal, מבוגר-שלב של הנגיף Zika.

יצירת מודלים העכבר עבור וירוס Zika-induced הפרעות נוירולוגיות באמצעות הזרקת גרם אסטרטגיות: עובריים Neonatal, למבוגרים

פרוטוקול להעריך תגובות תא T אנטיגן ספציפי באיברים immunoprivileged של Ifnar1- / - מאתר מודל עבור זיהום בנגיף (ZIKV) Zika מתואר. בשיטה זו הוא מרכזי בשביל לחקור את המנגנונים התאיים של ההגנה, השיגה חיסונים ZIKV, והוא גם יקר להערכת היעילות שלהם.

הערכה של תגובות T-cell Zika וירוס ספציפיים באיברים Immunoprivileged של עכברים נגועים Ifnar1- / -

אנו מתארים שיטה להעריך את ההשפעה של הקיימת מראש חסינות מפני וירוס דנגה על זיהום בנגיף Zika באמצעות בנסיוב אדם ראשי תאים אנושיים, כימות זיהום על ידי תגובת שרשרת של פולימראז בזמן אמת כמותית.

כימות של נוגדנים תלויי שיפור של הנגיף Zika בתאי אדם ראשי

המגיפה האחרונה של וירוס Zika מדגיש את החשיבות של הקמת גישות גנטיות הפוכה לפתח חיסונים ו/או אסטרטגיות טיפוליות. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול כדי להציל וירוס מדבק רקומביננטי Zika מתוך שיבוט באורך מלא cDNA התאספו בכרומוזום מלאכותי חיידקי תחת השליטה של cytomegalovirus ירוס האדם המוקדם מיידית היזם.

הצלה של וירוס רקומביננטי Zika מתוך כרומוזום מלאכותי בקטריאלי cDNA שיבוט

המטרה של הפרוטוקול היא להדגים את הטכניקות המשמשות לחקירת מחלה נגיפית על ידי בידוד וכימות וירוס Zika, מאיברים מרובים בעכבר לאחר ההדבקה.

בידוד וקוונפיקציה של וירוס Zika ממספר איברים בעכבר

הפרוטוקול המוצג יכול לקבוע את היכולת הווקטורית של אוכלוסיות יתושים Aedes aegypti עבור וירוס נתון, כגון זיקה, במסגרת בלימה.

וקטור יכולת ניתוחים על יתושים Aedes aegypti באמצעות וירוס זיקה

בעבודה זו, אנו מתארים את הפרוטוקולים המשמשים בבדיקות מבוססות אנזים מבוססות replicon ויראלי כדי לסנן מעכבים של שכפול וירוס זיקה בפורמט הקרנה תפוקה גבוהה.

בדיקות אנטי-ויראליות בעלות תפוקה גבוהה למסך עבור מעכבי שכפול וירוס זיקה

למדו כיצד להשיב וירוס זיקה זיהומי מקלון cDNA דו-פלסמידי. שיטה זו מאפשרת חקר אסטרטגיות חיסון, פתוגנזה ואבולוציה ויראלית בפלביוירולוגיה.

הצלה אפיון של וירוס רקומביננטי מעולם חדש Zika וירוס זיהום מזוהם

גלה סרטונים נוספים