Name: חלבון הסרט אינפרא-אדום אלקטרוכימיה שהפגינו למחקר של H2 חמצון Hydrogenase ניפה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: חקור את כימיית האתר הפעיל של אנזים הידרוגנאז ניקל-ברזל באמצעות אלקטרוכימיית אינפרא-אדום בסרט חלבון. שיטה זו מאפשרת בקרה אלקטרוכימית מדויקת ודגימה ספקטרוסקופית בו-זמנית של חלבוני רדוקס.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה של K.A.V. ו P.A.A. נתמכה על ידי המועצה האירופית למחקר (EnergyBioCatalysis-ERC-2010-StG-258600), פרס הנדסה, מדעים פיסיקליים מחקר המועצה ליברות זרז EP/N013514/1, וביוטכנולוגיה ו ביולוגי מחקר מדעי המועצה (BB/L009722/1 ו- BB/N006321/1). ר. ה נתמכה על ידי Ministerio דה Ciencia y Tecnologìa, למד דה קוסטה ריקה, לינקולן קולג, אוקספורד. המחברים להכיר מר צ'ארלי ג'ונס, מר צ'ארלי אוונס והצוות של הסדנה מכני (המחלקה לכימיה) לקבלת סיוע בעיצוב וייצור של תאים spectroelectrochemical נעשה שימוש בעבודה זו.

1. מסעדה ובר תא הדגימה פנימי של ספקטרומטר FTIR בתוך הכפפות אנאירובית, יבש ודרישות ניסיוני כללי
<ol><li>השתמש ספקטרומטר FTIR מסחריים המצוידים עם חיצוני כספית קדמיום טלוריד (MCT) גלאי, אביזר ATR. גוף ספקטרומטר עם אוויר יבש או dinitrogen, או לחלופין להשתמש ספקטרומטר עם ספסל אופטי פונו.</li>
	<li>למקם את ספקטרומטר על גבי שולחן יציב, ללא רטט באותו גובה כמו אנאירובית (< ppm 1 או2), יבשה, הכפפות (נקודת הטל <-75 ° C). להסיט את קרן IR ספקטרומטר לתוך בתא הכפפות, דרך חלון שקוף IR גדול מספיק כדי להכיל את קרן defocused. הערה: חשוב כי הרווח בין הכפפות ספקטרומטר גם לצמיתות או פונו, במיוחד אם חומר היגרוסקופי חלון, כגון NaCl או KBr לדוגמה, משמש.</li>
	<li>
שכפל תא הדגימה פנימי של ספקטרומטר בתוך בתא הכפפות.
	<ol>
<li>כוונו את הקרן בתוך הכפפות אל ראי אליפסואידי מהציר, באופן אידיאלי עם אורך מוקד זהה במראה התמקדות פנימי של ספקטרומטר. הערה: זה שימושי שיש שתי מראות המטוס נוספים הממוקמים לפני הראי התמקדות הזה, על מנת לאפשר את הגובה וגם את הכיוון של קרן IR יותאם בתוך הכפפות; זה יהיה לקזז כל דיוקים להצבת הראשונית ספקטרומטר.</li>
		<li>המקום של גלאי חיצוני MCT, להשלים עם מתאים מיקוד הראייה (כגון אורך מוקד קצר ZnSe העדשה, או מראה פרבולית מהציר, עם אורך מוקד קצר) בתוך הכפפות ממוצבת כגון כדי לשכפל את הממדים של המדגם פנימי תא המטען של ספקטרומטר.</li>
		<li>להתאים את המוקד' ' של קרן IR להיות כ קו מקביל בין המראה התמקדות והגלאי MCT.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מגניב של דיואר של הגלאי MCT חיצוני עם חנקן נוזלי.</li>
	<li>הר האביזר ATR לתוך תא הכפפות הדגימה. יישר את הקלט והפלט התמקדות אופטיקה וסיוע ATR כדי להשיג תפוקה מקסימלית כדי הגלאי MCT. אם יש צורך, להשתמש צמצם או אחרים הנחתה מתאימים (כגון רשת תיל) כדי למנוע oversaturation של האות גלאי. הערה: עבור הנתונים המובאים כאן, אביזר ATR חמש-השתקפות ועם כל אופטיקה רעיוני של Si הבסיסי נשלף רכיב השתקפות פנימית (חמתו) משמש (קריסטל GmbH, מידות ca 5 × 8 × 1 מ3, זווית פניה 39.5 מעלות). חמתו נטענה baseplate נשלף במכונה של פוליאטר אתר קטון (פיק).</li>
	<li>להשתמש עם הכפפות כדי לשכן תא הדגימה המשוחזר עם feedthroughs מתאימה כדי לאפשר חיבור potentiostat שוכן מבחוץ (חיבורי BNC חזק גז שימושיים למטרה זו), גישה לאינטרנט גז, כבל (י) כדי להעביר את האות MCT גלאי. חשוב לשמור על כל סיכוך הכבל גלאי כדי להימנע מציגה רעש או הפרעה למידותיו.</li>
	<li>המקום משאבה סחרור, מסוגל זרימה המחירים גדול מ 60 mL/min בתוך בתא הכפפות. נוף סכמטי של ספקטרומטר, ATR אביזר, סחרור משאבת, potentiostat ההתקנה מוצג באיור1.</li>
	<li>לבנות תא spectroelectrochemical, כמו זה המוצג סכמטי איור 2, כי החותמות על ATR אביזר. התא צריך להכיל שטח גבוהה מונה אלקטרודה (Pt תיל או גזה), חיבור האלקטרודה עבודה (מוט פחמן), אלקטרודה הפניה של מיניאטורי. התא צריך להכיל לפחות שתי יציאות נוספות כמו כניסת ו עודפים לזרימה מהירה של פתרונות דרך התא. הערה: אלקטרודה הפניה calomel רווי מיניאטורי אידיאלי למטרה זו. 36
</li>
</ol>2. הכנת חלקיקי פחמן שחור שופרת e. coli Hydrogenase 1
<ol><li>בהכפפות אנאירובית, 'רטוב' לערבב 20 מ ג של שטח גבוהה חלקיקי פחמן שחור (> 1,000 m3/g) עם מים טוהר על קוליים 1 מ"ל (resistivity > 18 ס מ MΩ) צינור microcentrifuge. לפזר חלקיקי מאת sonication צריכת חשמל נמוכה (< 100 W) לפחות 15 דקות, או עד הפיזור אחיד ועושה את המשקע לא בתוך 1 h, לתת פיזור פחמן שחור עם טעינה של 20 מ"ג/מ"ל.</li>
	<li>
קח aliquot של e. coli hydrogenase 1 (Hyd1, כ- 50 µL, המוכנים לפי הייתה הליך שפורסמו55)-ריכוז חלבון ~ 7 מ"ג/מ"ל, להחליף אותו לתוך מאגר כוח יונית נמוך ב- pH קרוב נקודה איזואלקטרית (עבור דוגמה אשלגן פוספט, 15 מ מ, pH 5.8, בלי. מלח נוספים). כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר, השתמש הכנה של אנזים זה פעיל ככל האפשר. לבצע את ההחלפה מאגר על ידי ריכוז דילול, התקן צנטריפוגלי מסנן עם משקל מולקולרי המתאים חיתוך (50 kDa זו פועלת היטב עבור Hyd1).
	<ol>
<li>להוסיף Hyd1 את המכשיר מסנן.</li>
		<li>לדלל עם µL בערך 450 מאגר exchange.</li>
		<li>Reconcentrate לאמצעי אחסון של 50 µL באמצעות צנטריפוגה מתון (< ~ 2700 × g) למניעת משקעים בלתי הפיך.</li>
		<li>חזור על שלבים 2.2.2, 2.2.3 עד מאגר exchange תושלם (בדרך כלל תוך ~ 5 מחזורים).</li>
	</ol>
</li>
	<li>מערבבים נפח 5 µL של 20 מ"ג/מ"ל פחמן שחור הפיזור (להכין ב 2.1) עם aliquot 50 µL של חילופי-מאגר Hyd1. לאחסן את תערובת אנזימים-חלקיקים מקרר (ב-0 מעלות צלזיוס) למשך הלילה כדי לאפשר את האנזים לספוח. יתכן צורך לנער את התערובת מידי פעם כדי להבטיח שהחלקיקים יישארו התפזרו.</li>
	<li>לשטוף את החלקיקים Hyd1-השתנה עם מאגר כוח יונית נמוך (אשלגן פוספט, 15 מ מ, pH 5.8, בלי. מלח נוספים) על ידי מחזורים רצופים שיקוע, פיזור מחדש ב microcentrifuge (~ 2700 × g). חזור על תהליך זה 3 - 5 פעמים כדי להסיר את האנזים הספוחה. הערה: על לפני כביסה ראשונה תגובת שיקוע צריך להיות כמעט נטול צבע, המציין ספיחה טובה של האנזים.</li>
	<li>רכז החלקיקים לאמצעי הסופי של µL ~ 5, לתת טעינה הסופי של ~ 20 מ"ג/מ"ל של חלקיקים אנזים-השתנה. הערה: החלקיקים Hyd1-לאחרונה ניתן לאחסן ב 4 ° C עד שבועיים אם הם נשארים hydrated; זו מושגת בצורה הטובה ביותר על-ידי אחסון חלקיקים מדולל עם ~ 50 µL של מים טוהר על קוליים.</li>
</ol>3. הכנה המידות PFIRE e. coli Hydrogenase 1
<ol><li>לנקות את חמתו סי על ידי מאפיק נמוך sonication (< 100 W), תחילה ב H2אז4 (< 90% w/w) ~ 15 דקות ולאחר מכן עב ס3 (70% w/w) עבור עד 1 משאבי אנוש. הליך ניקוי זה אמור להוביל חמתו הידרופילי. אם נדרש ניקוי נוסף ניתן להציב את חמתו בפתרון פיראניה (יחס של 1:3 של2O H2: H2אז4) להתחמצן כל חומר אורגני הנותרים. הערה: ייתכן קשים שיטות ניקוי חומצי לא להיות מתאים לשימוש עם כל החומרים חמתו. פתרון פיראניה קורוזיבית מאוד, חמצון חזקים, משטחים צריך להיות נקיות למדי לפני השימוש פיראניה פתרון וטיפול יש לנקוט במהלך ההכנה ולהוסיף שימוש בפתרון פיראניה בשל אופיו אקסותרמית של התהליך - תמיד H2O 2 לאט לאט H2אז4 ולהפנות נוהלי הבטיחות המתאים עבור הכנה, השימוש, סילוק.</li>
	<li>שוטפים את חמתו נקי במים טוהר על קוליים, ומייבשים תחת זרם של גז חנקן יבש. לבצע כל טיפול פריזמה באמצעות פינצטה נקי כדי למנוע זיהום.</li>
	<li>חותם את חמתו לתוך baseplate אביזר ATR באמצעות רצועה דקה של איטום סיליקון חשמל-כיתה. לטפל כדי להגביל את חומר האיטום על הקצוות של חמתו. לאפשר את חומר האיטום לייבוש מלא.</li>
	<li>להעביר את baseplate אביזר ATR בתא הכפפות ספקטרומטר והר זה אל האביזר ATR. מדד קשת הפניה (רקע) בין 4000-1, 000 ס מ-1 4 ס מ-1 רזולוציה, באמצעות תקן מהירה לסרוק במצב של ספקטרומטר 1024 interferograms בממוצע (מדידה time ~ 3-5 דקות). השתמש הספקטרום הזה כקלט כדי לאפשר חישוב של ספיגת ספקטרה בהמשך הניסוי. הערה: עקב ספיגת קטן הצפוי עבור האתר הפעיל Hyd1 יש צורך לאסוף ספקטרה קליטה גבוהה יחסי הרעש.</li>
	<li>להעביר את baseplate אביזר ATR בתא הכפפות "רטוב" אשר מכיל את פיזור חלקיקים Hyd1-השתנה מוכן מראש (סעיף 2). ירידה-שחקנים aliquot 1 µL של פיזור חלקיקים על הפנים גדול של חמתו, ולהפיץ את אותם באופן שווה על פני השטח. הערה: אל תאפשר את החלקיקים להיות יבש לחלוטין על חמתו.</li>
	<li>חותכים פיסת נייר פחם, כגון בשימוש כחומר דלק דיפוזיה שכבה בתאי דלק גודל ~0.1 מ מ קטן יותר מידות משטח חמתו (קרי ca. 8.2 × 4.9 מ מ2). פני השטח של הנייר פחמן צריך להיות גדול מספיק כדי לכסות את החלקיקים Hyd1-השתנה טיפה-שחקנים, אבל לא כל כך גדולים עד חופפים איטום סיליקון נהגו לאבטח את חמתו. משרים את הנייר פחמן במים, הנח אותו בעדינות מעל הסרט חלקיקים. הנייר פחמן תספק חשמל חיבור טוב לאורך הסרט כל חלקיק. הערה: מומלץ להכין מראש מספר פיסות נייר פחם, ולאחסן אותם מראש ספוגה במים טוהר על קוליים בתוך הכפפות אנאירובית 'רטוב'.</li>
	<li>הר spectroelectrochemical התא (המתוארים 1.7 סכמטי באיור 2) מעל חמתו, לאבטח אותו לתוך baseplate עם ברגים. להוסיף ~ 200 µL של המאגר ניסיוני לשמור את האנזים להתייבש. מערכת מאגר מעורב, יכולת אגירת מעל טווח pH רחב, שימושית עבור מחקרים על ניפה hydrogenases:56 סודיום אצטט, 2-[N'-מורפולינו] אתאן-sulfonic חומצה (MES), N'-[2-hydroxyethyl] piperazine -N' -[חומצה 2-אתאן-sulfonic] (HEPES), N'-טריס [hydroxymethyl] חומצה מתיל-3-אמינו-פרופאן-sulfonic (ברזים), ו 2-[N'-cyclohexylamino] אתאן-sulfonic חומצה (צ'ז), עם כל רכיב בריכוז סופי של 15 מ מ, המכיל 0.1 M NaCl תמיכה אלקטרוליט, עם pH להתאים ל- pH 6 שימוש מרוכז NaOH ו- HCl. הערה: החיבור אלקטרודה עבודה צריך לבלוט מעט מתחת למישור העליון תא spectroelectrochemical (~0.1 מ"מ) כדי להבטיח חיבור אלקטרונית טובה על הנייר פחמן (איור 2).</li>
	<li>לחבר את כניסת פתרון ו עודפים של התא spectroelectrochemical מערכת זרימת המכילה צינור משאבת סחרור, בקבוקון של המאגר ניסיוני. להעביר את התא התאספו בתא הכפפות 'יבש' המכיל את ספקטרומטר.</li>
	<li>טעינת ההרכבה תא spectroelectrochemical אל האביזר ATR. להתחבר potentiostat העבודה, מונה ואלקטרודות הפניה. להתחבר לאורך צינור משאבת סחרור המשאבה.</li>
	<li>להקליט על הספקטרום ספיגת עם 1024 בממוצע interferograms ברזולוציה-1 4 ס מ מעל מגוון ספקטרלי של 4,000-1, 000 ס מ-1, באמצעות הקשת שליקט 3.4 כרקע/הפניה. בשלב זה הספקטרום צריך להכיל משמעותי (> 100 mO.D...) להקות השנייה אמיד ב ~ 1,540 ס מ-1 , אתר פעיל להקות של Hyd1 צריך להיות ניכר ספקטרלי מהאולטרא 1,850-2,150 ס מ-1, בארצות הברית מחמצנים, לא פעיל (איור 3 ).</li>
</ol>4. הפעלה של e. coli Hydrogenase 1 ובדיקות התא Spectroelectrochemical
<ol><li>הפחתת פוטנציאל (−0.8 V vs SCE) חלות על הסרט חלקיקים Hyd1-השתנה. עיתוני המאגר ניסיוני עם H2 ואת זרימת מאגר באיטיות דרך התא spectroelectrochemical. להשאיר את הדגימה לילה מלא להפעיל את Hyd1. הערה: חשוב להשתמש H אנאירובית2, N2 וכווגזים אנאירובית אז כל צריך לעבור דרך מסנן2 O.</li>
	<li>שיא של ספקטרום ספיגת המדגם לאחר ההפעלה. ΝCO ולהקות vCN של האתר הפעיל כעת יופיע התפלגות של הברית מופחתת, 'פעיל'. זה הוא ציין ביותר בקלות באמצעות קשת ההבדל, ביחס הספקטרום טלקוה 3.10 (איור 4).</li>
	<li>בדוק את חיבור חשמל של התא spectroelectrochemical. כדי לעשות זאת, עיתוני המאגר ניסיוני עם גז2 N. להחיל רצף של חמצון (0 V vs SCE) וקיצור (−0.8 V vs SCE) פוטנציאל (משך 30 דקות ca ) הסרט חלקיקים Hyd1-לאחרונה, והקלטה של ספקטרום ספיגת בכל אחד. צריך להיות מחומצן, מופחתת במהירות Hyd1, אם הסרט חלקיקים מחובר היטב 100% מכלל המדגם צריך להגיב על פוטנציאל יישומי.</li>
	<li>הגדר של קצב הזרימה המתאימה המאגר ניסיוני. כדי לעשות זאת, להחיל הפחתת פוטנציאל (−0.8 V vs SCE) על המדגם, עיתוני המאגר ניסיוני עם H2. להקליט סדרה של voltammograms מחזורית בין-0.707 - 0.039 V vs SCE בקצב הסריקה של mV 10/ס להגדיל בהדרגה את קצב הזרימה של H2-רוויות חיץ בין voltammograms עד waveshape קטליטי דומה לזו-סיבוב מישורי דיסק אלקטרודה55 , הזרם המרבית היא עצמאית של קצב הזרימה (איור 5). הערה: מגבלת מסיסות של H2 במים הוא מ"מ ~0.8 293 K ו- 1 בר.</li>
	<li>כמו לדוגמה עכשיו הוא מוכן למדידות PFIRE, לאסוף ספקטרה במגוון של פוטנציאל, תחת מגוון תנאים פתרון (pH, טמפרטורה, H2 ריכוז וכדומה). להקליט את כל הנתונים אלקטרוכימי באמצעות התוכנה potentiostat כפי שזה חשוב שניתן יהיה להתאים נתונים ספקטרוסקופיות אלקטרוכימי, במיוחד כאשר לומד electrocatalytic תהליכים כגון H2 חמצון על ידי Hyd1.</li>
</ol>5. טיפול נתונים ספקטרוסקופיות
<ol><li>לאשר כי האתר הפעיל לא לצמיתות שונתה במהלך המדידות בהקלטת ספקטרה-0 V ו−0.8 V vs SCE בסוף הניסוי. אלה צריכים להיות זהים כדי ספקטרום טלקוה 4.3, ללא אובדן של אתר פעיל להתייחס בתקופת המדידה (איור 6).</li>
	<li>ייצוא ספקטרה ספיגת מוחלטת מתוך התוכנה ספקטרומטר בתבנית מתאימה (. csv, ASCII, 'matlab', Jcamp וכדומה) לצורך עיבוד באמצעות תוכנות כגון מקור או Matlab.</li>
	<li>
הבסיס לתקן את הנתונים, באמצעות תהליך מאויר איור7.
	<ol>
<li>לקחת את הנגזרת השנייה של כל ספקטרום ספיגת ב- 1,800-2,150 ס"מ ' טווח '-1, על מנת לזהות קטן (< mO.D 1.) אתר פעיל להקות רקע מים עקומים מאוד.</li>
		<li>במקום בסיסית סמן נקודות על הספקטרום ספיגת המקורי, להגדיר את נקודות 'הצמד' אל הספקטרום ניסיוני.</li>
		<li>להתאים תוכנית בסיסית באמצעות נקודות באמצעות פונקצית spline מעוקב עם אינטרפולציה או פונקציה פולינום. חיסור פונקציה בסיסית זו מתוך נתוני ניסיוני.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

המחברים מצהירים שום עניין פיננסי מתחרות.

PFIRE היא טכניקה בהרחבה הישים של ספקטרוסקופיות IR למיעון חלבונים אלקטרודה. מרותק למיטה חמצון-חיזור. בפרט, electrocatalytic תגובות חמצון-חיזור אנזימים פתור בתנאים תחלופת מהירה. שיטת PFIRE מתבססת על הפקד אלקטרוכימי ישירה המסופקים על ידי הטכניקה של PFE, אשר מספק מידע מבניים ישירה, זוגות זה ספקטרוסקופיית אינפרא-אדום-פחמן האלקטרודה. הגישה PFIRE ובכך מוסיף תובנה כימי המידע הזמין של אלקטרוכימיה לבד, מתאימה מאוד ללמוד של חמצון-חיזור חלבונים ואנזימים מעורב מולקולה קטנה קשירה והפעלה. בנוסף, PFIRE יכול לספק מידע אודות שינויים מבניים תלויי-פוטנציאל בחלבונים בהיעדר תחלופת קטליטי. אירועים כאלה של העברת אלקטרונים בלתי-מחזור לעיתים קשה לזהות באמצעות יישומים 'תקן' של PFE, למרות ההרחבה של PFE AC טרנספורמציה-פורייה voltammetry שימש בהצלחה רבה. 45 , 46
השיטה PFIRE הוא, כעיקרון, מתאים המחקר של כל חלבון חמצון-חיזור שניתן ללמוד באמצעות PFE. לכן, בדומה PFE, ספיחה חלבון הוא שלב קריטי עבור ניסוי יירוט מוצלח PFIRE. ב פרוטוקול זה אנו מתארים יישום של הטכניקה PFIRE באמצעות Hyd1 e. coli כמקרה. 36 , 43 . אולם, לנו יש גם מוחלת הטכניקה PFIRE את hydrogenase תקינה cytoplasmic מ ר eutropha,44 ועל פלווין mononucleotide הספוחה על פחמן שחור. 40 בכל המקרים האלה, ספיחה פיסיקלית פשוט כדי שלא שונתה שטח גבוה פחמן שחור (כפי שמתואר פרוטוקול זה) מספק כיסוי השטח של חלבון זה מספיק גבוה כדי להקליט באיכות טובה ספקטרום אינפרא-אדום עם יחס אות לרעש גבוה. במקרים שבהם לא ניתן להשיג ברמה כה גבוהה של ספיחה זה ייתכן שיהיה צורך לשנות את פני השטח של חלקיקי פחמן, לדוגמה לאפשר מצורף קוולנטיות החלבון על פני השטח אלקטרודה. 60 , 61 , 62 השימוש הכפפות למדידות PFIRE נחוץ רק אך ורק כאשר לומד כי חייבים להיות מטופלים anaerobically. עם זאת ב אימון מאוד קבוע ונמוך (נקודת הטל < 80 מעלות) רמות של אדי מים המסופקים על ידי האווירה הכפפות לתת רמות גבוהות של אות לרעש המאפשרים הפקת absorbances קטן מאוד. 44 במקרים רבים סביבה אנאירובית, כגון זו הניתנת בתא הכפפות, רצוי גם עבור המידה אלקטרוכימי (חלק בלתי נפרד הטכניקה PFIRE) על מנת למנוע הנוכחי עקב ירידה של2 O על האלקטרודה עבודה.
IR absorbances עקב מים בכמות גדולה, מאגרי ניסיוני, חלקיקי פחמן שעליו המדגם הוא הספוחה כל לתרום באופן משמעותי ספקטרום ניסיוני, יכול לחפוף להקות של עניין, במיוחד אמיד, II ו- III מחוזות ספקטרום. 63 אזור אמיד מכיל גם מידע ממינים אורגניים כגון flavins או nicotinamide cofactors, כמו גם מצעים ומוצרי של תגובות חמצון וצמצום רבים. במקרה של hydrogenases ניפה, νCO וνCN להקות של האתר הפעיל ליפול באזור צלולים יחסית של הספקטרום, אז השיטה PFIRE הוא מאוד מתאים גם במחקר של אנזימים אלה. במקרים אחרים, עם זאת, ההבדל ספקטרה בשילוב עם גישות labelling איזוטרופי עשוי להיות נחוץ כדי לבודד את השינויים, כתוצאה הפרוטאין קיבוע. גישות דומות שימשו כדי לזהות, לדוגמה, פרוטונציה שינויים מבניים rearrangements וכדי ללמוד מתחמי קינטיקת מיכאליס-מנטן באמצעות ספקטרוסקופית אינפרא-אדום. 64 , 65 , 66 PFIRE ולא מוגבל, לכן, המחקר של hydrogenases, אבל ניתן להחיל על כל חלבון חמצון-חיזור המכיל (או של מי סובסטרטים, מוצרים או מעכבי מכילים) קבוצות עם תנודות IR-פעיל אבחון; פחמן חד-חמצני dehydrogeanses,67 nitrogenases,68,flavoproteins14 , dehydrogenases40 ו formate, למשל...
הטכניקה קשורים, SEIRA, מתאים מאוד במחקר של חלבוני ממברנה-הקשורים בסביבה ביונים. 32 SEIRA הוא עיבוד של ספקטרוסקופיית אינפרא-אדום גם משתמש בתצורת ATR-IR ולאחר עושה שימוש אפקט שיפור פני השטח זה מגביר את ספיגת IR של מולקולות ממוקם קרוב (במרחק כמה ננומטר) פני המנסרה ATR (חמתו). SEIRA ולכן הוא רגיש ביותר לשינויים ספקטרלי להטבה הארכיטקטורה חלבון וממברנה הספוחה והיא יחסית בחינם מהמודיעין מתחרות של הממס ולהציג מצעים/מעכבי בפתרון. . זה מעט לעומת הטכניקה PFIRE המתוארים כאן הנשענת על עומק החדירה גדול יותר באופן משמעותי מעל פני השטח של חמתו (~ 1 מיקרומטר), כלומר PFIRE הוא יותר רגישים סובסטרטים, מוצרים או מעכבי להציג פתרון. זו רגישות מוגברת ממס 'בצובר' יכול להיות יתרון; אם המצע או מוצר יכול להיות שנצפו ישירות על-ידי אינפרא-אדום, PFIRE ספקטרה דווח על שני קינטיקה מצב יציב של חיים ארוכים מינים הפעילים ויצירת מוצרים משויכות במהלך electrocatalysis. 69 היכולת להתבונן מצב יציב ריכוזי המצע והמוצר יהיה יקר במיוחד עבור אנזימים כגון פחמן חד-חמצני דהידרוגנאז (אשר מזרז חמצון הפיך של CO ל CO2, בולם חזק IR) או formate דהידרוגנאז (אשר מזרז חמצון הפיך של formate CO2).
בזמן הנוכחי, PFIRE מוגבל מחקרים קינטי מצב יציב של אנזים electrocatalysis עקב האלקטרודות פחמן מאקרוסקופית נהגה "להתרכז" האנזים על פני חמתו של איסוף נתונים, גיאומטריה ATR-IR. במובן זה PFIRE מחקרים של hydrogenases ניפה הם משלימים לעבודה של דייר ועמיתים,49,50 משתמשים מבוססות אור חולף IR בליעה ללמוד קינטיקה תת מחזור. העבודה מתבצע על ממוזער התא spectroelectrochemical,40 , עם השימוש microelectrodes הזמן רזולוציה גודל מיקרו השגה. זה יאפשר לימוד של משנה מחזור קינטיקה של אנזימים בתדירויות מחזור עד ca 100-500 s-1, ויאפשר המחקר של תצלום התקריב ותהליכי חמצון.
בסך הכל, PFIRE היא טכניקה ספקטרוסקופיות המאפשר אפיון כימי של electrocatalytic תגובות של חמצון-חיזור אנזימים בתנאים מצב יציב. הגישה PFIRE מאפשר titrations כימית, אלקטרוכימי מרובות להתבצע על הדגימה אנזים אותו, כמו אלקטרודות שטח גבוהה בשימוש לספק של ספיחה חזקים של חלבון, הגיאומטריה ATR-IR מאפשרת פתרון נתיישב חילופי. היכולת לאסוף כזה מידע מבני בחיי עיר במהלך הפונקציה אנזימים הוא כלי רב ערך עבור הקהל הרחב bioelectrochemistry.

אתגר מפתח במחקר של פונקציה של חלבונים כרוך פיתוח שיטות בחיי עיר המאפשרים תצפית ישירה של חלבונים בביצוע תפקידיהם פיזיולוגיים, או ויוו או באמצעות דגימות חלבון מבודד. פעולה זו דורשת השילוב של שליטה או מפעילה תהליכים לתוך בצרות ושימוש בשילוב טכניקות המאפשרות את תגובתיות לפנות לבדיקה, של צעדים כימיים בודדים במהלך פונקציה של חלבונים כדי למדוד, בו זמנית. במקרה של חמצון-חיזור חלבונים זה לעיתים קרובות משווה ל המשלב טכניקות אלקטרוכימי, אשר בדיוק לשלוט פוטנציאל יישומי אבל לספק מידע כימי ישיר אין, עם שיטות ספקטרוסקופיות רגישים מבחינה כימית ספציפית שינויים הקשורים עם פונקציה של חלבונים. 1 , 2 , 3 Spectroelectrochemistry הוא מונח כללי עבור טווח בשילוב שיטות אלקטרוכימיות, ספקטרוסקופיות להקיף מגוון רחב של שיטות ספקטרוסקופיות ואת רמת השליטה אלקטרוכימי. חלבונים רבים יכולים להחליף אלקטרונים עם אלקטרון מלאכותי, מסיסים התורמים, acceptors, זו נוצלה במחקרים אשר השתמש מולקולות קטנות כדי לתווך העברת-אלקטרונים, כולל צימוד עם UV הגלוי,4,5 , 6 , קיווטות מגנטי 7 8 ו אינפרא-אדום5,9,10,11,12,13,14 (IR) spectroscopies. במספר מצומצם של מקרים הוכיחה אפשרות לנצל אלקטרונים בלתי מבוקרת דיפוזיה, חליפין בין חלבונים אלקטרודות. 15 , 16
לתגובות קטליטי ביצעו על ידי אנזימים חמצון-חיזור, גישות אלקטרוכימיה פתרון קיים חיסרון ברור. העברת אלקטרונים מבוקרת דיפוזיה דרך חמצון-חיזור מגשרים בתמיסה היא צפויה להפוך הגבלת קצב. קינטי, מכניסטית מידע אודות האנזים עלול ללכת לאיבוד או לפחות להקשות על deconvolute של חפצי אמנות טשטוש הנובע השיטה הניסיונית. ישירה, בלתי שליטה אלקטרוכימי לכן כלי חשוב לצורך המחקר של חמצון-חיזור חלבונים ואנזימים. הטכניקה של חלבון הסרט אלקטרוכימיה (PFE) מעסיקה חלבונים אלקטרודה. מרותק למיטה חמצון-חיזור, בצורה כזאת, כי האלקטרונים מועברים ישירות או ממנה את cofactors חמצון-חיזור בתוך החלבון כפי האלקטרודה היא מקוטב-סדרה של פוטנציאל. 17 , 18 , 19 PFE הוא בעל ערך מסוים לצורך המחקר של תגובות חמצון או הפחתת על ידי אנזימים חמצון-חיזור, כמו העברת-אלקטרונים פנים יכול להיעשות בקצב מאוד גבוה. לדוגמה, שיעור תחלופה electrocatalytic hydrogenase ([ניפה]) ניקל וברזל מן Allochromatium vinosum נמדדה על ידי PFE כמו ca 1,000-10,000 s− 1 עבור H2 חמצון. 20 האלקטרודה פוטנציאליים פועל כגורם מפעיל להפוך זרז 'על' או 'ביטול' ולאחר הדיווחים הנוכחי electrocatalytic על פעילות האנזים. PFE ולכן היא שיטה ערך לניתוח את תגובתיות של אנזימים מורכבים באופן אינטימי תלויים פוטנציאלית, כגון תגובות של האתר הפעיל di-ברזל של [FeFe]-hydrogenases עם CO ו- O2,21 או בהשפעת פוטנציאל השתקה של כרומוזום תגובות של hydrogenases דהידרוגנאז פחמן חד-חמצני22 ,23 , אנזימים חמצון-חיזור מורכבים אחרים. 24
המכשול העיקרי בפני שילוב שיטות ספקטרוסקופיות עם הפקד אלקטרוכימי ישירה המוענקת על ידי PFE נובע כיסוי משטחים נמוכה של אנזימים חמצון-חיזור, גודל 1-2 pmol ס מ-2 עבור hydrogenase [ניפה] מ- vinosum א, 20 יחסית בחיי עיר המדע משטח מחקרים של מולקולה קטנה adsorbates על גבי אלקטרודות מתכת בצובר. זה מהווה אתגר על הרגישות של המדידה ספקטרוסקופיות מספר שיטות spectroelectrochemical דווחו ללמוד מתאושש חמצון-חיזור חלבונים במגוון של אלקטרודות שונות: ספקטרוסקופיה UV-גלוי-אלקטרודות תחמוצת מתכת שקוף; 25 , 26 , 27 ספקטרוסקופיה זריחה-אלקטרודות זהב; 28 , 29 השטח משופרת ספקטרוסקופיית בליעה אינפרא-אדום (SEIRA)-אלקטרודות זהב; 30 , 31 , 32 , 33 , משטח משופרים שיטות ספקטרוסקופיות ראמאן, בעיקר על אלקטרודות כסף. 34 , 35
כאן נתאר שיטת צימוד PFE עם ספקטרוסקופיית אינפרא-אדום, בטכניקה המכונה חלבון הסרט אלקטרוכימיה אינפרא-אדום (PFIRE). 36 PFIRE שיטת מחקרים חמצון-חיזור אנזימים ותשמרו על אלקטרודה עבודה פחמן שטח גבוהה בשיתוף עם גאומטריה אינפרא-אדום (ATR-IR) השתקפות הכולל הקלוש, ניצול הקלות של ספיחה של מגוון של חלבונים על משטחי פחמן. ספקטרוסקופיית אינפרא-אדום שימושית במחקרים של חמצון-חיזור אנזימים וחלבונים כמו מולקולות קטנות רבות, ליגנדים, cofactors יש absorbances אבחון זה ניתן להשתמש כדי להעריך את מצב תגובתיות, איגוד, עיכוב, חמצון-חיזור. דוגמאות כוללות קשירה של לא למרכזי ברזל-גופרית,37 המחקר של flavoproteins,38,39,40 מולקולה קטנה איגוד מרכזי heme ועוד. 41 הגיאומטריה ATR ה-IR מאפשר בנייה של תא אלקטרוכימי שלוש ממוטבת-אלקטרודה (ספקטרו)42 , ולכן מספק שליטה אלקטרוכימי מעולה. פתרון התנגדות וטיילו פוטנציאליים הן מזעריות על-ידי הצבת של אלקטרודה הפניה ליד האלקטרודה עבודה. אלקטרודות שטח גבוהה מונה משמשים שעולות בקנה אחד עם זרמים electrocatalytic גבוהה המיוצר על ידי האנזים מהירה מחזור ב האלקטרודה עבודה. זרימה של פתרון באמצעות תא spectroelectrochemical מאפשר שליטה נתיישב על הריכוז של מצעים, מעכבי ו- pH. 36 , 43 , 44 PFIRE השיטה מאפשרת לכן ספקטרה IR להיות מוקלט בחיי עיר בזמן ממושך אנזים electrocatalysis. 36 , 44 PFIRE הוא גם מסוגל לספק מידע כימי בהיעדרו של הנוכחי, קטליטי43 בניגוד PFE איפה זה יכול להיות קשה כדי לחלץ מידע שאינו קטליטי בתהליכי חמצון-חיזור אנזימים. 45 , 46
הראו את שיטת PFIRE עבור המחקר של electrocatalytic H2 חמצון על ידי [ניפה] hydrogenases, אשר מכילים ליגנדים CO ו- CN מהותי מתואמת כדי Fe-אתר פעיל בי-מתכתיים. 36 , 43 , 44 [ניפה] hydrogenases ולכן הם התאימו היטב כדי ללמוד על-ידי PFIRE. שיטת PFIRE מספק מידע על מינים שנמצאים במהלך מחזור מצב יציב ומספק ולכן קריטי תובנה מכניסטית בנוסף העושר של ספרות על ספקטרוסקופיית אינפרא-אדום של hydrogenases ללא שליטה ניסויית על מחזור. 47 , 48 דייר ועמיתים המועסקים זמן לפתור IR שיטות ללימוד ניפה hydrogenases,49,50,51 באמצעות גורם אור כדי להחיל צעד פוטנציאל שלילי קטן (באמצעות שימוש של פתרון מגשרים ומקור אלקטרון "כלואה") או photolyse הידריד מאוגד. למרות השיטה PFIRE לא יכול, בזמן הנוכחי, לספק רזולוציה הזמן כדי להתאים את המידות האלה,40 זה לאפשר לימוד של תהליכים קטליטי חותכות והן חמצוני, לגשת במגוון של פוטנציאל מוגדרים היטב וללא התחבורה ההמונית מגבלות.
השיטה PFIRE היא נבדלת SEIRA מחקרים של חמצון-חיזור חלבונים, אשר גם להשתמש של הגיאומטריה ATR-IR ולהעסיק אלקטרודת מתכת של ננו-roughened כדי לשפר את ספיגת IR של מולקולות הספוחה על פני האלקטרודה. 30 SEIRA היא טכניקה בעלת ערך רב מאוד ללמוד קרום חלבונים, בפרט הספוחה על או בתוך הממברנה מימטי ארכיטקטורות,32 אבל את הצורך אלקטרודת מתכת יכול להגביל את טווח המצע והמעכב עקב תגובתיות את התמיכה אלקטרודה לכיוון מולקולות קטנות כגון CO, CN–, CO2 וכו הפחתת פרוטונים ו טפט עצמית שהורכב desorption יכול להיות בעייתי על משטחי מתכת-פוטנציאל שלילי מאוד,1,52 למרות אנזים electrocatalysis על הגנה מתכת אלקטרודות דווח. 53 , 54 חיסרון של PFIRE ביחס SEIRA הוא הקושי היחסי של שילוב קרום חלבונים בממברנה מקורית או מימטי ארכיטקטורות. עם זאת, יחסי אינרטיות כימית מצוינת ועמידות של החקירה פחמן תגובות הפעלה מתחרה של מולקולה קטנה גורם PFIRE טכניקה מצוינת ללמוד אנזים electrocatalysis, במיוחד בתחום פוטנציאל נמוך הרלוונטיים ביולוגי חמצון-חיזור תהליכים כגון פרוטון הפחתת על-ידי hydrogenases. 1 , 43
מטרת מאמר זה היא להציג את השיטה PFIRE כמו שיטת לימוד חלבונים אלקטרודה. מרותק למיטה חמצון-חיזור, ניפה hydrogenase 1 (Hyd1) מ- Escherichia coli כדוגמא. שיקולים של הכנת הדוגמא, הדרישה זרימה טובה המצע ונתונים טיפול הם דנו. PFIRE היא טכניקה בהרחבה ישימים, מותאם היטב כדי ללמוד כל חלבון חמצון-חיזור (עם absorbances האופיינית IR) זה יכול להיות adsorbed על גבי אלקטרודות פחמן, או ישירות או באמצעות שינוי פני השטח, כך שזה יכול להחליף אלקטרונים עם אלקטרודה.

<table><tbody><tr><td>ספקטרומטר</td><td>Agilent</td><td>680-IR</td><td>עם גלאי MCT חיצוני</td></tr><tr><td>אביזר ATR</td><td>Pike Technologies</td><td>GladiATR</td><td>מותאם אישית לשימוש עם Si IRE</td></tr><tr><td>Glovebox</td><td>Technology Ltd.</td><td>N/A</td><td>קופסה 'רטובה' ו'יבשה' שתוכננה בהתאמה אישית לטיפול ומדידה אנאירוביים</td></tr><tr><td>של דגימות חלון KBr</td><td>Crystran</td><td>מותאם אישית</td><td>כדי לאפשר צימוד של תא הכפפות עם הקורה החיצונית של ספקטרומטר FTIR</td></tr><tr><td>אופטיקה נוספת</td><td>Agilent</td><td>N/A</td><td>רכיבים מאביזר PM-IRRAS</td></tr><tr><td>סיליקון IRE</td><td>Crystal GmbH</td><td>מותאם אישית</td><td>טרפז: 8.4 מ"מ x 5 מ"מ (פנים גדולות), עובי 1 מ"מ, כ 39 מעלות זווית פנים</td></tr><tr><td>Potentiostat</td><td>Metrohm</td><td>Autolab PGSTAT 128N</td><td></td></tr><tr><td>Nova 10.1</td><td>Metrohm</td><td></td><td>תוכנה לשליטה במשאבה הפריסטלטית הפוטנציוסטט</td></tr><tr><td></td><td>Williamson Manufacturing Company Ltd</td><td>QL-1000-024-300</td><td></td></tr><tr><td>Pt חוט</td><td>Surepure Chemetals</td><td>3272</td><td>99.95% חוט פלטינה טהור, 0.014 אינץ 'מוט</td></tr><tr><td>פחמן</td><td>קוטר WH סמית</td><td>30729209</td><td>0.7 מ"מ HB עופרת עיפרון</td></tr><tr><td>פחמן שחור</td><td>Cabot Corporation</td><td>פנינים שחורות 2000</td><td></td></tr><tr><td>אמבט אולטרסאונד</td><td>Ultrawave</td><td>U100</td><td>35 W</td></tr><tr><td>מסנן צנטריפוגלי</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC5050BK</td><td>Amicon Ultra, 50 KDa MW ניתוק</td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה</td><td>אפנדורף</td><td>5452000018</td><td>מיניספין</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td></td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Fisher S</td><td>/ 9240 / PB17</td><td></td></tr><tr><td>HNO3</td><td>Fisher N</td><td>/ 2300 / PB17</td><td></td></tr><tr><td>איטום סיליקון</td><td>Cow Corning Toray Co., Ltd.</td><td>SE 4486</td><td></td></tr><tr><td>נייר פחמן</td><td>Toray</td><td>TGP-H-030</td><td></td></tr><tr><td>H2 גז</td><td>BOC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N2 גז</td><td>BOC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OriginPro 2015</td><td>OriginLab</td><td></td><td>תוכנת ניתוח נתונים / גרפים</td></tr><tr><td>רזולוציות Pro 4.0</td><td>Varian</td><td></td><td>תוכנה לשליטה בספקטרומטר FTIR</td></tr></tbody></table>

חלבון הסרט אינפרא-אדום אלקטרוכימיה שהפגינו למחקר של h2 חמצון hydrogenase [ניפה]

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

הבנת הכימיה של חמצון-חיזור חלבונים דרישות שיטות המספקים שליטה מדויקת חמצון-חיזור מרכזי בתוך החלבון. הטכניקה של חלבון הסרט אלקטרוכימיה, שבו חלבון זה ותשמרו על פני השטח אלקטרודה כך האלקטרודה מחליפה אלקטרונים פיזיולוגיים או acceptors, סיפקה פונקציונלי תובנה תגובות חמצון-חיזור של מגוון שונה חלבונים. ההבנה כימי מלא דורש שליטה אלקטרוכימי להיות משולבת עם טכניקות אחרות, באפשרותך להוסיף תובנה מכניסטית מבניים נוספים. כאן אנחנו מדגימים טכניקה, חלבון הסרט אינפרא-אדום אלקטרוכימיה, המשלב חלבון הסרט אלקטרוכימיה עם אינפרא אדום ספקטרוסקופיות דגימה של חלבונים חמצון-חיזור. הטכניקה משתמשת של הגיאומטריה מרובות-השתקפות השתקפות הכולל הקלוש כדי לחקור חלבון חמצון-חיזור ותשמרו על אלקטרודה פחמן שחור שטח גבוהה. תיאגוד זו האלקטרודה לתא זרימה מאפשר פתרון pH או ממס ריכוזים להשתנות במהלך המדידות. . זה חזק במיוחד בהתייחסות אנזימים חמצון-חיזור, תחלופה מהירה קטליטי יכול להיות מתמשכת ואיפה נשלטת על האלקטרודה ומאפשר תצפית ספקטרוסקופיות של מינים ביניים מאריכים את המנגנון קטליטי. נדגים את הטכניקה עם ניסויים על e. coli hydrogenase 1 תחת מחזור (H2 חמצון) ומצבים שאינם-מחזור.

כאן, אנו מתארים טכניקה, חלבון הסרט אינפרא-אדום אלקטרוכימיה, המאפשר קיבוע חמצון-חיזור חלבונים שילמדו spectroscopically תחת שליטה ישירה אלקטרוכימי פחמן האלקטרודה. ניתן להקליט ספקטרום אינפרא-אדום של דגימה של חלבון יחיד בטווח של פוטנציאל יישומי, תחת מגוון תנאים פתרון.

חלבון הסרט אינפרא-אדום אלקטרוכימיה שהפגינו למחקר של H2 חמצון Hydrogenase [ניפה]

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לחקור את הכימיה של הצד הפעיל באנזים חמצון-חיזור (redox) מסוג ניקל-ברזל הידרוגנאז בתנאי מצב שאינו במחזור (non-turnover) ובתנאי מחזור אלקטרוקליטי במצב יציב (steady-state), וזאת באמצעות אלקטרוכימיה של תשתית חלבון באינפרא-אדום (protein film infrared electrochemistry) או PFIRE. היתרון המרכזי של טכניקת ה-PFIRE הוא שהיא מאפשרת בקרה אלקטרוכימית מדויקת במקביל לדגימה ספקטרוסקופית באינפרא-אדום של חלבוני חמצון-חיזור המקובעים על אלקטרודת פחמן. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחומי הביופיזיקה והביאו-אלקטרוכימיה לגבי המצבים של חלבוני חמצון-חיזור הנמצאים במהלך מחזור קטליטי במצב יציב.כדי להתחיל את הפרוצדורה, בתוך תא כפפות אנאירובי לח, השעו 20 מיליגרם של חלקיקי carbon black בעלי שטח פנים גבוה בתוך מילליטר אחד של מים אולטרה-טהורים. בצעו סוניקציה לסספנסיון בהספק נמוך למשך 15 דקות לפחות, או עד שחלקיקי הפחמן יתפזרו באופן אחיד ולא ייווצר משקא לאחר שעה של מנוחה. לאחר מכן, העמיסו 15 מיקרוליטר של תמיסה בריכוז של כ-7 מיליגרם למילליטר של E.Coli hydrogenase one אל תוך יחידת סינון צנטריפוגית של 50 kilodalton.דללו את התמיסה עם 450 µL של בופר חליפה בעל חוזק יוני נמוך וב-pH קרוב לנקודת האיזואלקטרית של ההידרוגנאז. רכזו את התערובת ל-50 µL באמצעות סבב צנטריפוגה ב-27,000 ×g. חזרו על תהליך הריכוז ארבע פעמים נוספות כדי להשלים את החלפת הבופר.לאחר מכן, ערבבו 5 µL של תמיסת פיזור פחמן שחור בריכוז 20 mg/mL עם ההידרוגנאז שעבר החלפת בופר. שמרו את התערובת בטמפרטורה של 0 °C למשך הלילה כדי לאפשר להידרוגנאז להיספג בחלקיקי הפחמן השחור. בדקו את התערובת מעת לעת כדי לשמור על פיזור החלקיקים.סבבו את החלקיקים המודגשים ב-27,000 times g ואששו כי הנוזל העליון כמעט חסר צבע, מה שמעיד על ספיחה טובה של ההידרוגנאז לחלקיקים. השגת רמה גבוהה של ספיחה היא קריטית להצלחת הניסוי. אנו מבצעים אופטימיזציה לבופר הספיחה באמצעות שימוש בבופר בעל חוזק יוני נמוך, ב-pH הקרוב לנקודת האיזואלקטרית של החלבון, כנקודת התחלה.שטפו את החלקיקים בשלושה עד חמישה מחזורים של סרכוז ותליה מחדש (resuspension) בתמיסת חליפה (exchange buffer) טרייה. רכזו את תערובת החלקיקים לנحو 5 µL כדי להשיג טעינה של חלקיקים בריכוז של 20 mg/mL. כדי להתחיל בהכנה למדידות PFIRE, נקו אלמנט השתקפה פנימית מסיליקון באמצעות סוניקציה בעוצמה נמוכה בחומצה גופרית למשך 15 דקות.לאחר מכן, השתמש בחומצה חנקית למשך שעה אחת. לאחר מכן, שטוף את האלמנט במים אולטרה-טהורים ויבש אותו תחת זרם של גז חנקן יבש. השתמש בחומר איטום סיליקון בדרגה חשמלית כדי לקבע את ה-IRE לתוך לוח הבסיס של אביזר ATR בעל חמש השתקפויות, תוך הקפדה שחומר האיטום יישאר רק בקצוות ה-IRE.יש להמתין לייבוש מלא של החומר האיטום. לאחר מכן, העבירו את לוח הבסיס אל תוך תא כפפות אנאירובי יבש בעל חלון שקוף ל-IR הממוקם לצד ספקטרופוטומטר FTIR. התקינו את לוח הבסיס על אביזר ה-ATR.רכשו ספקטרום רקע במצב סריקה מהירה. לאחר מכן, נתקו את לוח הבסיס של אביזר ה-ATR והעבירו אותו לתא הכפפות אנאירובי הרטוב. טפטפו מיקרוליטר אחד של חלקיקי הפחמן השחור המעובדים באנזים באופן אחיד על פני שטח ה-IRE, מבלי לאפשר לחלקיקים להתייבש לחלוטין.חשוב שתערובת החלקיקים שעברו מודיפיקציה אנזימטית תרוכז לרמה הקרובה ככל האפשר ל-20 milligrams per milliliter. אחרת, עלול להיות קשה להשיג סרט חלקיקים מחובר היטב בעת ביצוע dropcasting לחלקיקים בשלב זה. הניחו בעדינות פיסת נייר פחמן הספוגה במים אולטרה-טהורים על פני השטח של ה-IRE, תוך וידוא שסרט החלקיקים מכוסה ומבלי לאפשר לנייר לבוא במגע עם האטום הסיליקוני.הרכב תא ספקטרו-אלקטרוכימי מותאם אישית מעל ה-IRE. הוסף 200 µL של באפר ניסוי דרך כניסת התמיסה כדי לשמור על האנזים הידרטרי במהלך הכנת המערכת. חבר את כניסת ויציאת התמיסה למבחנה של באפר ניסוי באמצעות צינורות של משאבה פריסטלטית.לאחר מכן, העבירו את התא המורכב אל תא הכפפות היבש. התקינו את מכלול התא על אביזר ה-ATR וחברו את הפיתול למשאבה הפריסטלטית. רכשו ספקטרום בליעה תוך שימוש בספקטרום שנרכש קודם לכן כרקע.וודאו שהפסים של MI2 נראים בבירור ב-1,540 סנטימטרים הפוכים וכי ניתן לזהות את שיאי האתר הפעיל של ההידרוגנאז באזור שבין 1,850 ל-2,150. כהכנה לניסוי, השלימו פוטנציאל חיזון של 0.8- וולט ביחס לאלקטרודת ייחוס קלומל רוויה על סרט החלקיקים. רוו את בופר הניסוי בגז מימן אנאירובי.לאחר מכן, התחילו להזרים את התמיכה (buffer) דרך התא הספקטרו-אלקטרוכימי בקצב של כ-12 milliliters לדקה. השאירו את הדגימה תחת זרימה של תמיכת ניסוי רוויה במימן למשך הלילה כדי להפעיל את ההידרוגנאז. רכשו ספקטרום בליעה של הדגימה הפעילה ואמתו כי פסי ה-CO וה-CN של האתר הפעיל מראים מספר מצבי חיזור.בשלב הבא, רווי את תמיסת המערכת (buffer) בגז חנקן אנאירובי והזרם את התמיסה דרך התא. הפעל פוטנציאל חמצון של 0 וולט לעומת אלקטרודת ייחוס קלומל רוויה למשך 30 דקות, ורכוש ספקטרום בליעה. לאחר מכן, הפעל פוטנציאל חיזור למשך 30 דקות ורכוש ספקטרום נוסף.וודאו שהאנזים חומצן לחלוטין ולאחר מכן חזר למצב רדוקציה. אם לא, בדקו את החיבורים החשמליים של התא. באמצעות בופר רווי במימן אנאירובי, השיגו סדרה של וולטמוגרמות מחזוריות בקצבי זרימה עולים כדי לקבוע את קצב הזרימה האופטימלי לניסוי.באמצעות קצב זרימה זה, רכשו ספקטרה בטווח של פוטנציאלים ותנאי תמיסה שונים. מדידות PFIRE של hydrogenase one של E.coli התקבלו בפוטנציאלים שונים באטמוספירה אינרטית ובנוכחות גז מימן. הספקטרה שnerכשו תחת אטמוספירת מימן ייצגו את התפלגויות מצב המצב היציב (steady-state) של מצבי האתר הפעיל הנוכחים במהלך חמצון קטליטי של מימן.החמצון וההפעלה האנאירוביים של ההידרוגנאז באמצעות יצירת מצב nickel-B ממצב nickel-Si נחקרו באמצעות רכישת ספקטרא בנקודות זמן שונות במהלך הפעלת פוטנציאל, והכנת ספקטרא שונים ביחס לספקטרום הראשון. המרה הדרגתית שנצפתה של nickel-Si ל-nickel-B הייתה עקבית עם הירידה המונוטונית בזרם. ספקטרא נרכשו גם בטווח של pH של התמיסה כדי לחקור את שלבי העברת הפרוטונים במחזור הקטליטי של ההידרוגנאז.ב-pH נמוך, מצב הניקל-C היה שכיח יותר, בעוד שמצב הניקל-L היה שכיח יותר ב-pH גבוה. התלות של הריכוזים היחסיים של ניקל-C וניקל-L ב-pH נקבעה על סמך ערכי הבליעה המקסימליים בשיאים המתאימים בכל pH שנבדק בניסוי. טכניקה זו סוללת את הדרך עבור חוקרים בתחום הביו-אלקטרוכימיה לחקור קינטיקה במצב יציב של הפעלת מימן באמצעות hydrogenesis.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של ניסוי PFIRE טיפוסי. הטכניקה מתאימה לכל חלבון רדוקס שניתן לחקור באמצעות אלקטרוכימיה של שכבת חלבון (protein film electrochemistry) ומוסיפה תובנה כימית ישירה למדידה האלקטרוכימית.

protein-film-infrared-electrochemistry-demonstrated-for-study-h2

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

במאמר זה אתאר את הליך סינתזה אנזים שונה hydrophobically Nafion immobilization קרום ואיך לשתק חלבונים ו / או אנזימים בתוך קרום ולבדוק הפעילות הספציפיים שלהם.

Nafion הידרופובי מלח, שונה עבור Immobilization האנזים ייצוב

אנו מציגים פלטפורמה ייחודית לאפיון משטחי האלקטרודה בתאי דלק תחמוצת מוצקים (SOFCs) המאפשרת ביצוע סימולטני של שיטות אפיון מרובות...

חיטוט ומיפוי משטחי אלקטרודה דלק תאי תחמוצת מוצקות

המחקר מדגים את הצמיחה של תחמוצת גרפן-מופחת תחמוצת אירידיום (IRO 2 -RGO) nanohybrid סרטים דקים על מצע פחמן מסך מודפס סדיר ומחוספס באמצעות סינתזה ירוקה אלקטרוכימיים, ויישומן כחיישן pH עם פלטפורמת נייר-fluidic בדוגמת .

תחמוצת-מופחת אירידיום גראפן אוקסיד Nanohybrid Thin Film אלקטרודות מסך מודפס שינויים, כפי שהם פנויים אלקטרוכימיות נייר Microfluidic pH חיישנים

אנו להדגים את יישום 1 H (15 N, αγ) 12 C ניתוח תגובה גרעיני תהודה (NRA) כדי להעריך את צפיפות כמותית של אטומי מימן על פני השטח, בהיקף, ותמורת שכבת interfacial של חומרים מוצקים. פרופיל עומק מימן משטח כמעט של Pd (110) גביש יחיד ושל SiO 2 / Si (100) ערימות מתואר.

כימות של ריכוזי מימן שכבות חיצוניות ואת ממשק חומרים בתפזורת באמצעות פרופיל עומק עם ניתוח תגובה גרעיני

המיטוכונדריה מכילה מספר אנזימים תלויי-פלווין שיכול לייצר מינים חמצן תגובתי (ROS). ניטור ROS שחרור שאתרים בתוך המיטוכונדריה הוא מאתגר עקב תגובות לוואי לא רצויות. אנו מציגים שיטה קלה, זולה עבור הערכה ישירה של המחירים יליד לשחרור ROS באמצעות מטוהרים flavoenzymes ו- microplate fluorometry.

מדידה סימולטני של סופראוקסיד/מימן על-חמצני ו- NADH הייצור על ידי המכילות פלווין Dehydrogenases מיטוכונדריאלי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לסינתזה ומתואמות בדיקות אלקטרוכימי של מתכות מעבר אטומים בודדים במשרות פנויות גראפן מרכזים פעילים הפחתה סלקטיבית פחמן דו-חמצני כדי פחמן חד-חמצני בפתרונות...

סינתזה, אפיוני ביצועים של מתכות מעבר מאטום בודד הזרז להפחתת2 CO אלקטרוכימי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור photoelectron הדמיה של מינים anionic. אניונים שנוצר באופן vacuo ומופרדים באמצעות ספקטרומטר מסה הם ובחן באמצעות photoelectron מהירות מיפוי imaging, מתן פרטים של אניון, רמות אנרגיה נייטרלית, אניון ומבנה נייטרלי, אופי המדינה אלקטרונית אניון.

Photoelectron הדמיה של אניונים מאויר על ידי ניתוק 310 ננומטר F−

דינאמי, מאמץ מוחל על TiO2 סרטים דקים כדי ללמוד את ההשפעות של מתח על אלקטרוקטליזה, במיוחד הפחתת פרוטון וחמצון מים. סרטי TiO2 מוכנים על ידי טיפול תרמי של סגסוגת NiTi פסאודו-אלסטית (Nitinol).

החלת זן דינמי על סרטי תחמוצת דק משותק על סגסוגת ניקל-טיטניום פסאודואלסטית

פרוטוקול זה מראה שיטה נוחה להשוואת התכונות הקטליטיות של זרזי פלטינה נתמכים, המסונתזים על ידי תצהיר של קולואידים בגודל ננומטרי או על ידי הספגה. ההידרוגנציה של ציקלוהקסן משמשת כתגובת מודל לקביעת הפעילות הקטליטית של הזרזים.

תגובות קטליטיות בננו-חלקיקי פלטינה מיוצבים באמין וללא ליגנד הנתמכים על טיטניה במהלך הידרוגנציה של אלקנים ואלדהידים

פרוטוקול זה מציג תכנון והערכה של אלקטרודות תלת-ממדיות חדשניות עבור תאי דלק מי חמצן, תוך שימוש בבד סיבי פחמן Au-electroplated ואלקטרודות Ni-foam. ממצאי המחקר מדגישים את הפוטנציאל של מי חמצן כמועמד מבטיח לטכנולוגיות אנרגיה בת קיימא.

תאי דלק ללא מי חמצן כמקור אנרגיה נקי מבטיח

חקור את כימיית האתר הפעיל של אנזים הידרוגנאז ניקל-ברזל באמצעות אלקטרוכימיית אינפרא-אדום בסרט חלבון. שיטה זו מאפשרת בקרה אלקטרוכימית מדויקת ודגימה ספקטרוסקופית בו-זמנית של חלבוני רדוקס.

חלבון הסרט אינפרא-אדום אלקטרוכימיה שהפגינו למחקר של H₂ חמצון Hydrogenase [ניפה]

גלה סרטונים נוספים