שיטות חדשות לחקר קידוד גוסטוריאלי

המטרה הכוללת של שיטות אלה היא לחקור קידוד גוסטטורי במנדי קאסקסטה פשוטה של בעלי חיים על ידי רישום הפעילות של נוירונים קולטנים מרובים in vivo, תוך אספקה וניטור של פולסים מתוזמנים במדויק של טעמים. שיטות אלה יכולות לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי גוסטציה, כגון כיצד טועמים מקודדים על ידי אוכלוסיות של נוירונים של קולטני טעם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת הקלטות in vivo עבור נוירונים טסטטוריים מרובים לפני, במהלך ואחרי גירויים טסטנטיים המועברים במדויק.

אנשים חדשים בשיטה זו עשויים למצוא אותה מאתגרת מכיוון שהליך הדיסקציה מורכב. בשל כך, אנו מקווים שההדגמה החזותית של השיטה תעזור. טכניקות אלה פותחו על ידי סם רייטר כשהיה סטודנט לתואר שני במעבדה שלי, יחד עם אלחנדרה, קוי סון ידגים את ההליכים הללו.

שלושה ימים לאחר האקלוזיה, בחר עש משני המינים בעל מראה בריא בדרך כלל. הכנפיים צריכות להיות מורחבות במלואן, והפרובוסקיס והאנטנות צריכות להיות מעוצבות היטב ושלמות. במכסה אדים, הכנס את העש שנבחר לצינור ריסון עד לחשיפת הראש.

לאחר מכן, שתק את העש על ידי הכנסת נייר טישו לקצה השני של הצינור. כעת, באמצעות אוויר בלחץ המועבר ממזרק, הסר את השיער מהראש החשוף. לאחר מכן, הניחו את הצינור על משטח חימר בצלחת פטרי.

כוון את הצד הגבי של הראש כלפי מעלה. לאחר מכן, הגן על האנטנות ועל החוטם. ראשית, הכינו כיסויים לכל מבנה מקצות פיפטה של 200 מיקרוליטר שנחתכו לאורכים של חצי סנטימטר.

כדי לתפעל את החוטם, הכינו וו מחתיכת חוט. הרחב את הפרובוסקיס לאחד הכיסויים עד שהחלק הפרוקסימלי ביותר של הפרובוסקיס מוגן. אבטח את הצינור לחלק הגבי של קפסולת הראש באמצעות שעוות בטיק מוצקה.

לאחר מכן, גיליון בזהירות את האנטנות ואבטח את הצינורות בשעוות בטיק. כעת, ייצב את המוח על ידי חיתוך שריר מדחס האבזם. תחת מיקרוסקופ הדיסקציה, השתמש בכלי מיקרו-דיסקציה כדי לפתוח את קפסולת הראש על ידי ביצוע חתך קטן ממש מתחת לחרטום.

כדי לאשר שהשריר נחתך, הצע תמיסת סוכרוז לשני שליש הדיסטלי של החרטום, ובמשך חמש דקות וודא שהחוטם אינו מתארך. לאחר מכן, סגור את קפסולת הראש באמצעות שכבה של שעוות בטיק מומסת. כדי להחדיר את המוח במי מלח, בנו שעווה סביב הצד הגחוני של הראש.

בעזרת שעווה חשמלית, התחל לבנות שעווה לאורך החלק הקדמי של הראש הנע לכיוון החלק האחורי. שמור את צינורות הפרובוסקיס והאנטנות בתוך הגביעונית. המשיכי לבנות את הגביעונית כלפי חוץ ומעלה עד שהיא מגיעה לגובה העיניים.

בעזרת מלקחיים, קחו את מישוש השפתיים והצמידו אותם לכוס השעווה באמצעות שעווה מומסת. לאחר מכן, אטמו את כל הפתחים בכוס השעווה ובצינורות באמצעות שכבת דבר על אפוקסי בינארי. מערבבים את האפוקסי בעזרת קיסם.

ראשית, כסי את המשטחים החיצוניים והפנימיים של הגביעונית. שנית, מלאו את החלק של צינור הריסון המקיף את הצוואר כך שהראש יוחזק בצורה יציבה יותר. לאחר 20 דקות, בדקי אם יש דליפות בגביעונית

כדי להתחיל בניתוח המוח, חתכו תחילה את מישוש השפתיים. כדי לפתוח את הצד הגחוני של קפסולת הראש, חתכו את הקוטיקולה לאורך החלק האחורי והקדמי של הראש וסביב העיניים. לאחר מכן, חתוך לאורך החלק האחורי של הראש ובצע חתכים נוספים לאורך החלק הקדמי של הראש ליד החרטום.

לאחר מכן, הרם בעדינות את דש הציפורן בעזרת מלקחיים כדי לחשוף את המוח. כעת, בצע את הצעד הקריטי ביותר, וחשוף את ה-SEZ ואת העצבים המקסילריים. הסר לאט ובזהירות רקמת שומן ואת קנה הנשימה.

שטפו את המוח לעתים קרובות במי מלח טריים. היזהר מאוד, כי קל מאוד לרסק את העצבים המקסילריים. כאשר ה-SEZ והעצבים המקסילריים נראים סוף סוף, הם יכוסו במעטפת דקה.

כדי להסיר את המעטפת הזו, יש לנקז את עודפי המלח ולאחר מכן להחליש את הנדן על ידי מריחת תמיסת קולגנאז דיספאז של 10%. לאחר השרייה של חמש דקות, יש לשטוף את התמיסה מספר פעמים במי מלח. לאחר מכן, לאחר מספר שטיפות במי מלח, הסר בעדינות את הנדן באמצעות מלקחיים דקים במיוחד.

לבסוף, אבטח קו טפטוף מי מלח לתוך הזילוף. סעיף זה מתאר כיצד לבנות מערכת הצגת טעימות ולהשתמש בה. המערכת מורכבת ממבחנה עם מספר פתחים.

הפתחים מספקים כניסה לחרטום של החיה, סעפת הטעמים, חיישן צבע, והם מאפשרים לפלור לעבור דרך מים. כדי לבנות מערכת זו, הכינו תחילה מבחנה לחוטם. צור חור בגודל פרובוסקיס בעזרת מלחם.

לאחר מכן, בנה קטע מוקרן בתוך הצינור כדי להחזיק את הפרובוסקיס במקומו. חותכים חמישה מילימטרים מעל החור, מניחים שם את הרשת עם שעווה ומחברים מחדש את הצינורות באמצעות שעווה ואפוקסי. השתמש במערכת זלוף בלחץ כדי לספק את הטעמים.

חבר כמה שפופרות טסטנט שצריך לסעפת. כדי לחבר את צינור הפלט של הטסטנט, צור חור כסנטימטר אחד מעל הרשת, ולאחר מכן אבטח אליו את צינור הפלט עם אפוקסי. בכל טעם, כלול צבע מלאכותי שיזוהה על ידי חיישן צבע.

חבר חיישן צבע למנגנון בחור של חצי סנטימטר סביב הרשת, ואבטח אותו שם באמצעות אפוקסי. השתמש במשאבה פריסטלטית כדי לספק מים מזוקקים למערכת באמצעות צינורות סיליקון. אוספים את מי השפכים בעזרת מיכל גדול.

השתמש במשאבה פנאומטית כדי להעביר את הטעמים עם נשיפות אוויר. כעת, התחל לשאוב מים נקיים דרך הצינור, והעביר פולסים של טסטנט כדי לבדוק את חיישן הצבע. כעת, טען את הזיקוק שני שליש מחוטם העש לתוך מבחנת הבדיקה.

בעזרת מלקחיים מרחיבים את הפרובוסקיס ודוחפים אותו בעדינות לתוך החור. לאחר מכן, אטמו את הפרובוסקיס במקומו עם שעווה דנטלית רכה ושכבת אפוקסי. כעת, חבר את קו הזלוף המלח והגדר את זרימת הזילוף.

לאחר מכן, טבלו את האלקטרודה הקרקעית של טטרודת החוט המעוותת לתוך אמבט המלח. לאחר מכן, בעזרת מיקרומניפולטור, מקם את הטטרודה ליד העצב המקסילרי, וקדם אותו לאט לתוך העצב. לאחר זיהוי אותות זינוק, הניחו לתכשיר להתייצב לפחות 10 דקות לפני ביצוע ההקלטות.

הקלטות נעשו מתאי עצב של קולטני טעם לפני, במהלך ואחרי מתן טסטנט באמצעות הפרוטוקול המתואר. ההתחלה וההיסט של פעימה של שנייה אחת של כל טעם נוטרו על ידי חיישן הצבע. הטעמים עוררו קוצים שזוהו על ידי כל אחד מארבעת הערוצים.

בתוך רכבות הספייק, ניתן היה לצפות בפוטנציאל פעולה אינדיבידואלי. תוכנת מיון ספייקים שימשה כדי להקצות את הקוצים הללו לנוירונים ייחודיים. התגובה של שלושה נוירונים שונים של קולטני טעם לשישה טעמים המועברים ברצף חושפת רמות שונות של פעילות בסיסית וסלקטיביות לטעמים.

כמו כן, לתגובות היה תזמון שונה. חלקם נעולים למשך הגירוי, בעוד שאחרים מחזיקים מעמד מעבר לגירוי. הקלטות תוך-תאיות יכולות להתבצע גם מאקסונים של קולטני טעם באמצעות אלקטרודות זכוכית חדות קונבנציונליות.

ההקלטות התוך-תאיות היו דומות מאוד לתגובות שנצפו בטכניקת הטטרודה המתוארת, אך הקלטות הטטרודה היו קלות יותר לביצוע, עמידות יותר וחזקות יותר. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות מסוגל לחשוף את העצבים המקסילריים ואת האזור התת-וושטי במנדי-קאסקסטה, ולהיות מסוגל לבנות מערכת העברת טסטנט עם שליטה זמנית מדויקת. בזמן ביצוע פרוטוקול זה, יש ללבוש כפפות בטיחות במעבדה ומסכת פנים מכיוון שהאבקה העדינה שנשפכת על ידי מנדי-קאסקסטה עלולה להיות אלרגנית.

לאחר השליטה, ניתן להשלים הליך זה תוך שלוש וחצי שעות. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע הקלטות בו זמנית ממספר אזורי מוח כדי לענות על שאלות נוספות כגון, כיצד תגובות נוירונים של קולטני טעם לטעמים משתנות כאשר הן מועברות לנוירוני המטרה הפוסט-סינפטיים.