שיטות חדשות לחקר קידוד גוסטוריאלי
29 ביוני 2017
אנו מציגים שלוש שיטות חדשות כדי ללמוד קידוד gustatory . בעזרת חיית מחמד פשוטה, המנדוקה סוקה ( Manduca ) , אנו מתארים פרוטוקול לנתיחה, השימוש tetrodes תאיים להקליט את הפעילות של נוירונים קולטן רב גוסטורי, ומערכת לאספקת ומעקב פולסים תזמון מדויק של טעימות.
המטרה הכוללת של שיטות אלה היא לחקור קידוד גוסטטורי במנדי קאסקסטה פשוטה של בעלי חיים על ידי רישום הפעילות של נוירונים קולטנים מרובים in vivo, תוך אספקה וניטור של פולסים מתוזמנים במדויק של טעמים. שיטות אלה יכולות לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי גוסטציה, כגון כיצד טועמים מקודדים על ידי אוכלוסיות של נוירונים של קולטני טעם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת הקלטות in vivo עבור נוירונים טסטטוריים מרובים לפני, במהלך ואחרי גירויים טסטנטיים המועברים במדויק.
אנשים חדשים בשיטה זו עשויים למצוא אותה מאתגרת מכיוון שהליך הדיסקציה מורכב. בשל כך, אנו מקווים שההדגמה החזותית של השיטה תעזור. טכניקות אלה פותחו על ידי סם רייטר כשהיה סטודנט לתואר שני במעבדה שלי, יחד עם אלחנדרה, קוי סון ידגים את ההליכים הללו.
שלושה ימים לאחר האקלוזיה, בחר עש משני המינים בעל מראה בריא בדרך כלל. הכנפיים צריכות להיות מורחבות במלואן, והפרובוסקיס והאנטנות צריכות להיות מעוצבות היטב ושלמות. במכסה אדים, הכנס את העש שנבחר לצינור ריסון עד לחשיפת הראש.
לאחר מכן, שתק את העש על ידי הכנסת נייר טישו לקצה השני של הצינור. כעת, באמצעות אוויר בלחץ המועבר ממזרק, הסר את השיער מהראש החשוף. לאחר מכן, הניחו את הצינור על משטח חימר בצלחת פטרי.
כוון את הצד הגבי של הראש כלפי מעלה. לאחר מכן, הגן על האנטנות ועל החוטם. ראשית, הכינו כיסויים לכל מבנה מקצות פיפטה של 200 מיקרוליטר שנחתכו לאורכים של חצי סנטימטר.
כדי לתפעל את החוטם, הכינו וו מחתיכת חוט. הרחב את הפרובוסקיס לאחד הכיסויים עד שהחלק הפרוקסימלי ביותר של הפרובוסקיס מוגן. אבטח את הצינור לחלק הגבי של קפסולת הראש באמצעות שעוות בטיק מוצקה.
לאחר מכן, גיליון בזהירות את האנטנות ואבטח את הצינורות בשעוות בטיק. כעת, ייצב את המוח על ידי חיתוך שריר מדחס האבזם. תחת מיקרוסקופ הדיסקציה, השתמש בכלי מיקרו-דיסקציה כדי לפתוח את קפסולת הראש על ידי ביצוע חתך קטן ממש מתחת לחרטום.
כדי לאשר שהשריר נחתך, הצע תמיסת סוכרוז לשני שליש הדיסטלי של החרטום, ובמשך חמש דקות וודא שהחוטם אינו מתארך. לאחר מכן, סגור את קפסולת הראש באמצעות שכבה של שעוות בטיק מומסת. כדי להחדיר את המוח במי מלח, בנו שעווה סביב הצד הגחוני של הראש.
בעזרת שעווה חשמלית, התחל לבנות שעווה לאורך החלק הקדמי של הראש הנע לכיוון החלק האחורי. שמור את צינורות הפרובוסקיס והאנטנות בתוך הגביעונית. המשיכי לבנות את הגביעונית כלפי חוץ ומעלה עד שהיא מגיעה לגובה העיניים.
בעזרת מלקחיים, קחו את מישוש השפתיים והצמידו אותם לכוס השעווה באמצעות שעווה מומסת. לאחר מכן, אטמו את כל הפתחים בכוס השעווה ובצינורות באמצעות שכבת דבר על אפוקסי בינארי. מערבבים את האפוקסי בעזרת קיסם.
ראשית, כסי את המשטחים החיצוניים והפנימיים של הגביעונית. שנית, מלאו את החלק של צינור הריסון המקיף את הצוואר כך שהראש יוחזק בצורה יציבה יותר. לאחר 20 דקות, בדקי אם יש דליפות בגביעונית
כדי להתחיל בניתוח המוח, חתכו תחילה את מישוש השפתיים. כדי לפתוח את הצד הגחוני של קפסולת הראש, חתכו את הקוטיקולה לאורך החלק האחורי והקדמי של הראש וסביב העיניים. לאחר מכן, חתוך לאורך החלק האחורי של הראש ובצע חתכים נוספים לאורך החלק הקדמי של הראש ליד החרטום.
לאחר מכן, הרם בעדינות את דש הציפורן בעזרת מלקחיים כדי לחשוף את המוח. כעת, בצע את הצעד הקריטי ביותר, וחשוף את ה-SEZ ואת העצבים המקסילריים. הסר לאט ובזהירות רקמת שומן ואת קנה הנשימה.
שטפו את המוח לעתים קרובות במי מלח טריים. היזהר מאוד, כי קל מאוד לרסק את העצבים המקסילריים. כאשר ה-SEZ והעצבים המקסילריים נראים סוף סוף, הם יכוסו במעטפת דקה.
כדי להסיר את המעטפת הזו, יש לנקז את עודפי המלח ולאחר מכן להחליש את הנדן על ידי מריחת תמיסת קולגנאז דיספאז של 10%. לאחר השרייה של חמש דקות, יש לשטוף את התמיסה מספר פעמים במי מלח. לאחר מכן, לאחר מספר שטיפות במי מלח, הסר בעדינות את הנדן באמצעות מלקחיים דקים במיוחד.
לבסוף, אבטח קו טפטוף מי מלח לתוך הזילוף. סעיף זה מתאר כיצד לבנות מערכת הצגת טעימות ולהשתמש בה. המערכת מורכבת ממבחנה עם מספר פתחים.
הפתחים מספקים כניסה לחרטום של החיה, סעפת הטעמים, חיישן צבע, והם מאפשרים לפלור לעבור דרך מים. כדי לבנות מערכת זו, הכינו תחילה מבחנה לחוטם. צור חור בגודל פרובוסקיס בעזרת מלחם.
לאחר מכן, בנה קטע מוקרן בתוך הצינור כדי להחזיק את הפרובוסקיס במקומו. חותכים חמישה מילימטרים מעל החור, מניחים שם את הרשת עם שעווה ומחברים מחדש את הצינורות באמצעות שעווה ואפוקסי. השתמש במערכת זלוף בלחץ כדי לספק את הטעמים.
חבר כמה שפופרות טסטנט שצריך לסעפת. כדי לחבר את צינור הפלט של הטסטנט, צור חור כסנטימטר אחד מעל הרשת, ולאחר מכן אבטח אליו את צינור הפלט עם אפוקסי. בכל טעם, כלול צבע מלאכותי שיזוהה על ידי חיישן צבע.
חבר חיישן צבע למנגנון בחור של חצי סנטימטר סביב הרשת, ואבטח אותו שם באמצעות אפוקסי. השתמש במשאבה פריסטלטית כדי לספק מים מזוקקים למערכת באמצעות צינורות סיליקון. אוספים את מי השפכים בעזרת מיכל גדול.
השתמש במשאבה פנאומטית כדי להעביר את הטעמים עם נשיפות אוויר. כעת, התחל לשאוב מים נקיים דרך הצינור, והעביר פולסים של טסטנט כדי לבדוק את חיישן הצבע. כעת, טען את הזיקוק שני שליש מחוטם העש לתוך מבחנת הבדיקה.
בעזרת מלקחיים מרחיבים את הפרובוסקיס ודוחפים אותו בעדינות לתוך החור. לאחר מכן, אטמו את הפרובוסקיס במקומו עם שעווה דנטלית רכה ושכבת אפוקסי. כעת, חבר את קו הזלוף המלח והגדר את זרימת הזילוף.
לאחר מכן, טבלו את האלקטרודה הקרקעית של טטרודת החוט המעוותת לתוך אמבט המלח. לאחר מכן, בעזרת מיקרומניפולטור, מקם את הטטרודה ליד העצב המקסילרי, וקדם אותו לאט לתוך העצב. לאחר זיהוי אותות זינוק, הניחו לתכשיר להתייצב לפחות 10 דקות לפני ביצוע ההקלטות.
הקלטות נעשו מתאי עצב של קולטני טעם לפני, במהלך ואחרי מתן טסטנט באמצעות הפרוטוקול המתואר. ההתחלה וההיסט של פעימה של שנייה אחת של כל טעם נוטרו על ידי חיישן הצבע. הטעמים עוררו קוצים שזוהו על ידי כל אחד מארבעת הערוצים.
בתוך רכבות הספייק, ניתן היה לצפות בפוטנציאל פעולה אינדיבידואלי. תוכנת מיון ספייקים שימשה כדי להקצות את הקוצים הללו לנוירונים ייחודיים. התגובה של שלושה נוירונים שונים של קולטני טעם לשישה טעמים המועברים ברצף חושפת רמות שונות של פעילות בסיסית וסלקטיביות לטעמים.
כמו כן, לתגובות היה תזמון שונה. חלקם נעולים למשך הגירוי, בעוד שאחרים מחזיקים מעמד מעבר לגירוי. הקלטות תוך-תאיות יכולות להתבצע גם מאקסונים של קולטני טעם באמצעות אלקטרודות זכוכית חדות קונבנציונליות.
ההקלטות התוך-תאיות היו דומות מאוד לתגובות שנצפו בטכניקת הטטרודה המתוארת, אך הקלטות הטטרודה היו קלות יותר לביצוע, עמידות יותר וחזקות יותר. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות מסוגל לחשוף את העצבים המקסילריים ואת האזור התת-וושטי במנדי-קאסקסטה, ולהיות מסוגל לבנות מערכת העברת טסטנט עם שליטה זמנית מדויקת. בזמן ביצוע פרוטוקול זה, יש ללבוש כפפות בטיחות במעבדה ומסכת פנים מכיוון שהאבקה העדינה שנשפכת על ידי מנדי-קאסקסטה עלולה להיות אלרגנית.
לאחר השליטה, ניתן להשלים הליך זה תוך שלוש וחצי שעות. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע הקלטות בו זמנית ממספר אזורי מוח כדי לענות על שאלות נוספות כגון, כיצד תגובות נוירונים של קולטני טעם לטעמים משתנות כאשר הן מועברות לנוירוני המטרה הפוסט-סינפטיים.
סקירה
מאמר זה מציג שלוש שיטות חדשניות לחקר קידוד חישת הטעם בחרק המנדובה סקסטה. הטכניקות כוללות פרוטוקול ניתוח, הקלטות חוץ תאיות של תאי עצב קולטני טעם, ומערכת למסירה ובקרה של גירויים בחומרי טעם.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה התנהגותית
- אלקטרופיזיולוגיה
רקע
- הבנת קידוד חישת הטעם חיונית לתובנות לגבי עיבוד חושי.
- החרק מנדובה סקסטה משמש כאורגניזם מודל פשוט למחקרים אלו.
- הקלטה ממספר רב של תאי עצב קולטני טעם יכולה להבהיר כיצד מידע טעם מקודד.
- מסירה מדויקת של חומרי טעם חיונית לתוצאות ניסוייות מדויקות.
מטרת המחקר
- לפתח שיטות להקלטות in vivo של נוירוני טעם.
- לחקור כיצד חומרי טעם מקודדים על ידי אוכלוסיות של נוירוני קולטני טעם.
- לספק הדגמה ויזואלית של טכניקות הניתוח וההקלטה.
שיטות ששימשו
- פרוטוקול ניתוח להכנת החרק להקלטות עצביות.
- שימוש בטטרודות חוץ תאיות להקלטת פעילות עצבית.
- מערכת למסירה ובקרה של פולסים מתוזמנים של חומרי טעם.
- כלי עזר ויזואליים כדי לסייע לחוקרים חדשים בתהליך הניתוח המורכב.
תוצאות עיקריות
- הקלטות in vivo מוצלחות ממספר רב של נוירוני קולטני טעם.
- הוכחת יעילותה של מערכת מסירת חומרי הטעם.
- השגת תובנות לגבי קידוד מידע טעם.
- הדגשת האתגרים והפתרונות בתהליך הניתוח.
מסקנות
- השיטות שפותחו הינן חיוניות לחקר קידוד חישת הטעם.
- הקלטות in vivo יכולות לשפר את ההבנה של עיבוד הטעם.
- מחקרים עתידיים יכולים לבנות על הטכניקות הללו כדי לחקור את תחום החישה הטעם עוד יותר.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Understanding gustatory coding mechanisms provides foundational insights for target validation in neuroscience drug discovery, particularly for compounds modulating feeding behavior or metabolic pathways. The ability to record population-level neuronal responses in vivo supports mechanistic de-risking by linking molecular interventions to functional neural outputs. These methods enable predictive confidence in early discovery by quantifying how tastants are encoded across gustatory receptor neuron populations before downstream signal processing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking tastant identity and concentration to specific patterns of electrical activity across gustatory receptor neuron populations.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct in vivo measurement of neuronal responses before, during, and after stimulus delivery, clarifying target engagement in sensory pathways.
- Scientific Value: Facilitates pathway characterization by revealing how individual neurons contribute to population-level coding, aiding in target selection for modulating feeding-related behaviors.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for assay standardization by enabling consistent extracellular recording of multiple gustatory receptor neurons using tetrode arrays.
- Operational Value: Enhances assay reproducibility through precise temporal control of tastant delivery and real-time monitoring via color sensor feedback, reducing variability in stimulus presentation.
- Scientific Value: Enables screening readiness by generating quantifiable spike train outputs that can be sorted to identify individual neuron responses, supporting reliable compound evaluation in taste-modulation studies.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports translational continuity by linking in vivo gustatory receptor neuron activity to downstream brain processing, allowing assessment of how sensory signals are transformed at postsynaptic targets.
- Operational Value: Addresses risk-adjusted advancement decisions by providing baseline neuronal response profiles that can be used to detect compound-induced alterations in coding fidelity.
- Scientific Value: Focuses on predictive de-risking by distinguishing between stimulus-locked and sustained neuronal responses, helping to differentiate direct sensory effects from secondary network adaptations.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing in early discovery to lead identification and preclinical validation, particularly for targets involved in chemosensory signaling and feeding behavior regulation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling researchers to determine how specific tastants are encoded by defined populations of gustatory receptor neurons, clarifying molecular receptive ranges.
- Screening: Describes assay readiness through stable tetrode recordings that yield consistent spike detection across channels, allowing comparison of neuronal responses under different conditions.
- Analytics: Highlights spike sorting as a key analytical output that assigns action potentials to unique neurons, enabling resolution of individual contributions to population coding.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by demonstrating how gustatory receptor neuron responses propagate to follower neurons in the brain, informing postsynaptic target validation.
- Enterprise Reuse: Positions the tetrode-based recording system as a reusable platform for longitudinal studies, as recordings are longer lasting and more robust than intracellular sharp electrode methods.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in how tastant identity and concentration are represented in neural activity patterns.
- Operational Value: Improves standardization and scalability through a perfusable preparation that supports repeated recordings and simultaneous multi-area monitoring.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decisions by providing objective, quantifiable neural readouts that correlate tastant delivery with electrophysiological outcomes, reducing reliance on behavioral proxies alone.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by identifying compounds that alter gustatory coding fidelity, enabling early detection of off-target sensory effects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in insect dissection, microsurgery, and electrophysiology to successfully expose maxillary nerves and subesophageal zone without damaging delicate structures.
- Dependent on specialized instrumentation including micromanipulators, tetrodes, perfusion systems, and color sensors for tastant delivery and monitoring.
- Necessitates cross-team standardization of dissection and wax-sealing protocols to ensure consistent preparation quality across users and laboratories.
- Involves adaptation considerations when extending the approach to other model systems, as the maxillary nerve accessibility and sheath removal techniques are species-specific.
- Includes practical limitations such as the intricate dissection process and allergenic scaling from the moth, which require safety precautions and may limit throughput.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:03
Preparing M. sexta for Brain Surgery
10:03
Conclusion
8:45
Results: Tetrode Recordings of Stimulated Gustatory Receptor Neurons
4:22
Revealing the Subesophageal Zone (SEZ) and Maxillary Nerves
6:00
Tastant Delivery System and Extracellular Tetrode Recording
