PIP על שבב: מחקר ללא תווית של אינטראקציות חלבון- phosphoinositide

המטרה הכוללת של בדיקת PIP-on-a-chip היא להעריך אינטראקציות של ממברנת חלבון בצורה כמותית ללא תוויות. אינטראקציות בין קרום החלבון הן הלב של כל כך הרבה תהליכים של התא והפתוגנים שלו, אולם הטכניקות לחקר האינטראקציות האלה הן מעטות. היתרונות של טכניקה זו הם נפח פשוט נמוך, ללא דרישות תיוג ליגנד או קולטנים בשילוב עם היכולת לבדוק אינטראקציות ממברנה בצורה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית.

מטרות טיפוליות רבות של נגיפים הן חלבוני ממברנה, מחקרים של חלבוני מטרה אלה מבוצעים לרוב בתמיסה באמצעות חומרי ניקוי. הטכניקה שלנו מספקת אלטרנטיבה רלוונטית יותר מבחינה ביולוגית. אמנם תראו שבדיקה זו מסוגלת לנטר את האינטראקציות של חלבונים עם ממברנות, אך למעשה מדובר בבדיקה רב-תכליתית למדי וניתן להשתמש בה כדי לנטר אינטראקציות של קרום ברזל, קרום מולקולות קטנות ואפילו אינטראקציות של ממברנת פפטיד.

כדי להתחיל, מערבבים פולידימתילסילוקסן או PDMS פרה-פולימר ואת חומר הריפוי ביחס של 10:1, בסירת פלסטיק גדולה. הסר את התערובת בוואקום למשך שעה אחת עם עוצמת הוואקום של 500 טור או פחות. הנח את מאסטר הסיליקון המכיל שכפולים מרובים של אותו מיקרו-תבנית SU8 בסירת פלסטיק גדולה ושפך פנימה את ה-PDMS של ה-degas, ולאחר מכן רפא אותו בתנור יבש בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

למחרת, קלף בעדינות את ה-PDMS ממאסטר הסיליקון בעזרת הידיים. סמן את הגבולות של כל תבנית מיקרו במלבנים באמצעות אזמל כירורגי וסרגל. לאחר מכן, חותכים את ה-PDMS לבלוקים, מחוררים 16 חורים בשני הקצוות של כל מיקרו ערוץ עם אגרוף ביופסיה, כדי ליצור חורים בקוטר 1.0 מילימטר.

פיפטה חישבה נפחים של פוספטידילכולין, פוספטידילינוזיטול 4, 5-ביספוספט ובדיקה פלואורסצנטית רגישה ל-pH לבקבוקון אוורור זכוכית יחיד של 20 מיליליטר. יבש את התערובת בזרם גז חנקן בתוך מכסה המנוע הכימי למשך 10 דקות או עד שהממס מתאדה וסרט השומנים הדק נוצר בתחתית הבקבוקון. לאחר מכן, יבש את התערובת בוואקום למשך שלוש שעות לפחות בחוזק ואקום של 10 מיליטור כדי להסיר כל שאריות ממס אורגני

החזר את סרט השומנים המיובש עם חמישה מיליליטר של מאגר רץ, הנח את השומן המיובש באמבט אולטראסוני בתדר פעולה של 35 קילו-הרץ למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הקפיאו את תרחיף השלפוחית עם חנקן נוזלי ואמבט מים של 40 מעלות צלזיוס כדי לקבל שלפוחיות חד למינריות. חזור על הפשרת ההקפאה 10 פעמים, הוציא את מתלה השלפוחית לקרום פוליקרבונט בקצה מסלול של 0.1 מיקרון, באמצעות מכבש שומנים להעשרה לשלפוחיות חד-למינריות קטנות.

חזור על האקסטרוזיה 10 פעמים. בדוק את הכניסות והיציאות של בלוק ה-PDMS לאיתור חסימה על ידי התזת מים נטולי יונים דרך החורים באמצעות בקבוק שטיפת מים, ולאחר מכן יבש את בלוק ה-PDMS בגז חנקן. לאחר מכן, הנח את בלוק ה-PDMS ואת החלקת המכסה שנוקה מראש בתוך תא הדגימה של מערכת פלזמת החמצן.

חשוף את בלוק ה-PDMS ואת החלקת הכיסוי עם פלזמת חמצן למשך 45 שניות עם הגדרות ההספק של 75 וואט, מהירות זרימת החמצן ב-10 סנטימטרים מעוקבים לדקה ועוצמת הוואקום של 200 מיליטור. לאחר מכן, הנח את משטח התבנית של בלוק ה-PDMS במגע עם החלקת הכיסוי מיד לאחר הטיפול בפלזמת החמצן. לחץ בעדינות כדי להסיר בועות אוויר באתרי מגע.

הנח את המכשיר על פלטה חמה בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות כדי לשפר את ההדבקה. השתמש במגבון רטוב נטול מוך עם 100% אתנול כדי להסיר חלקיקי אבק מהחלק העליון והתחתון של המכשיר. לאחר מכן, הדביקו את המכשיר על גבי שקופית מיקרוסקופ זכוכית.

העבירו 100 מיקרוליטר של פוספטידילינוזיטול 4, 5-ביספוספט המכילים שלפוחיות חד-למינריות קטנות לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה של 0.65 מיליליטר. התאם את ה-pH של התמיסה לכ-3/2 על ידי הוספת 6.4 מיקרוליטר של 0.2 חומצה הידרוכלורית רגילה. פיפטה 10 מיקרוליטר של תמיסת השלפוחית החד-למינרית הקטנה מותאמת ה-pH לכל תעלה דרך הכניסה ומפעילה לחץ דרך הפיפטה עד שהתמיסה מגיעה ליציאה.

נתק את הקצה מהפיפטה והשאיר אותו מחובר למכשיר. לאחר חזרה על שלב זה עבור כל ערוץ, דגרו את המכשיר למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, יש לבצע הזרקת שלפוחיות לתעלות מיקרו מיד לאחר הרכבת המכשיר. בינתיים, חותכים סטים של צינורות כניסה ויציאה, בעזרת פינצטה, מחברים את ערכת צינורות היציאה למכשיר ולאחר מכן מדביקים את המכשיר על במת מיקרוסקופ.

טבלו קצה אחד של צינור הכניסה המוגדר ב-25 מיליליטר של מאגר רץ הכלול בצינור חרוטי והדביקו אותו כדי לוודא שהצינור מאובטח. באמצעות שקע מעבדה, הנח את הצינור החרוטי על קרקע גבוהה יותר מהמכשיר על מנת לדחוף את התמיסה דרך תעלות המיקרו באמצעות זרימת כוח הכבידה. עבור כל צינור כניסה, השתמש במזרק כדי לשאוב מיליליטר אחד של מאגר רץ מהקצה החופשי של הצינור.

הסר את קצה הפיפטה מהכניסה והכנס את הקצה החופשי של צינור הכניסה לתוך המכשיר. חזור על תהליך זה כדי לחבר את כל חלקי צינורות הכניסה למכשיר. מאגר זורם זורם דרך התעלות מסייע בהסרת עודפי שלפוחיות לא קרועות ולאזן את השכבה הדו-שכבתית לתנאי ניסוי.

לאחר מכן, פתח את תוכנת בקרת המיקרוסקופ. בחלונית השמאלית, לחץ על לשונית המיקרוסקופ ובחר את המטרה פי 10. לחץ על שידור חי ואז סמלי התמונה של Alexa 568 בסרגל הכלים, באמצעות כפתורי הכוונון העדינים והגסים, התמקדו בערוצי המיקרו.

סרוק דרך המכשיר כדי לבדוק את איכות ה-SLB והערוצים. לאחר מכן, לחץ על סמל התמונה הסגורה של תריס FL בסרגל הכלים, לחץ על הכרטיסייה רכישה ותחת התאמות בסיסיות, בחר זמן חשיפה. הגדר את זמן החשיפה ל-200 אלפיות השנייה.

בחלונית השמאלית, לחץ על רכישה רב מימדית. בתפריט המסננים, בחר את הערוץ האדום. לאחר מכן, לחץ על תפריט ה-Timelapse, הגדר את מרווח הזמן לחמש דקות, משך הזמן ל-30 דקות ותפריט ה-lapse.

בחר בכלי העיגול תחת כרטיסיית המדידה וצייר עיגול בכל ערוץ. לחץ לחיצה ימנית בזמן בחירת העיגול ובחר מאפיינים. תחת לשונית הפרופיל, סמן את כל T כדי להציג את עוצמת הקרינה כפונקציה של זמן.

ודא שעקומה זו מגיעה לרמה המעידה על שיווי משקל לפני שתמשיך לשלב הבא, הורד את תמיסת החיץ לקרקע שווה למכשיר, כדי לעצור את הזרימה. בזה אחר זה, נתק כל צינור יציאה והחל 200 מיקרוליטר מכל דילול חלבון לתעלת היציאה באמצעות פיפטה. אל תפעיל לחץ כלשהו, תן לכוח המשיכה לעשות את העבודה.

נתק את הקצה מהפיפטה והשאיר אותו מחובר למכשיר המיקרו נוזלי. חזור על תהליך זה עבור כל ערוץ וודא כי בועות אוויר אינן מוכנסות לתעלות במהלך תהליך זה. לאחר מכן, הורד את צינור הכניסה לקרקע מתחת למכשיר המיקרופלואידי כדי להתחיל להזרים את החלבון דרך תעלות המיקרו.

הדביקו את הקצה החופשי של הצינור למיכל פסולת. זרם את הדילולים של תחום ההומולוגיה של פלקסטרין למשך 30 דקות. בחלונית השמאלית של התוכנה, תחת הכרטיסייה Timelapse, לחץ על התחל, כדי להתחיל שוב בהדמיה.

מוצג כאן, תצוגה מייצגת של פוספטידילינוזיטול 4, 5-ביספוספט המכיל SLBs בתוך תעלות מיקרו. לפני, ואחרי, הוספת תחום ההומולוגיה של פלקסטרין בריכוזים שצוינו. עוצמות הקרינה מהקו שנסרק על פני תעלות מיקרו משורטטות כפונקציה של מרחק ופיקסלים עבור פוספטידילכולין, פוספטידילינוזיטול 4 פוספט ופוספטידילינוזיטול 4, ניסויי קשירה 5-ביספוספט.

לאחר מכן, לנרמל נתוני קשירה מניסויים בודדים, משורטט כפונקציה של פוספוליפאז C דלתא 1 פלקסטרין ריכוז תחום הומולוגיה ומתאים לאיזוטרם מחייב כדי לחלץ קבועי אסוציאציה לכאורה. השוואה בין קבועי האסוציאציה לכאורה, מראה כי תחום ההומולוגיה של פוספוליפאז C דלתא 1 פלקסטרין מקיים אינטראקציה עם פוספטידילינוזיטול 4, 5-ביספוספט באופן ספציפי, כצפוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור שלפוחיות חד-למינריות קטנות, ליצור התקנים מיקרופלואידיים, ליצור שכבות דו-שכבתיות של שומנים נתמכות בתוך המכשירים המיקרופלואידיים הללו, כאינטראקציות קשירת קרום החלבון שלך, תוך שימוש בבדיקה זו עם גישת PIP-on-a-chip שלנו.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלוש שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו התאוששות פלואורסצנטית לאחר הלבנת פוטו על מנת להעריך את ההשפעה של קשירת קרום החלבון על הדיפוזיה הרוחבית של השומנים. טכניקה זו סוללת את הדרך לחקר אינטראקציות ממברנת חלבון עם מכלול השומנים המצויים בתאים במקום אחד בכל פעם, לכן גישה זו תשפיע באופן נרחב על הביוכימיה והביולוגיה של התא של אינטראקציות ממברנת החלבון.