המדידה בו זמנית HDAC1 ופעילות HDAC6 הלה תאים באמצעות UHPLC-MS

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לקבוע את פוטנציאל עיכוב ה-HDAC של תרכובות ולזהות סלקטיביות כלפי HDAC6 או HDAC1 בתאים באמצעות בדיקת ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום גילוי התרופות כגון קביעה אם מעכב HDAC הוא סלקטיבי עבור HDAC6 על פני HDACs Class I בתאים חיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא דורשת שלב דגירה יחיד עם תאים, מעכבים וסובסטרטים סלקטיביים על מנת לקבוע את העוצמה כנגד שני איזופורמים של HDAC בו זמנית.

ההשלכה של טכניקה זו משתרעת לקראת גילוי מוקדם של תרופות של מעכבי HDAC סלקטיביים מכיוון שהיא מזהה אם סלקטיביות HDAC6 נשמרת בתאים חיים תוך הימנעות ממבחני אצטילציה של חלבון אנדוגני. למרות ששיטה זו מעריכה את הסלקטיביות של מעכבי HDAC בתאי HeLa, ניתן ליישם אותה גם על קווי תאים אחרים כגון תאים ראשוניים ותאי גידול אחרים כולל דגימות קליניות. תרבית תאי HeLa ל-80% מפגש בבקבוק תרבית תאים T75 במצע חיוני מינימלי בתוספת סרום בקר עוברי 10%, פניצילין G וסטרפטומיצין.

שטפו את התאים פעמיים עם חמישה מיליליטר של מי מלח עם חוצץ פוספט של Dulbecco. לאחר מכן, שאפו את המאגר והוסיפו מיליליטר אחד של מגיב דיסוציאציה של תאים. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות כדי לנתק את התאים.

לאחר חמש דקות, הוסף תשעה מיליליטר של מדיום תרבית MEM לתאים והשהה מחדש היטב את תרחיף התאים. העבירו את התאים לצינור חדש של 15 מיליליטר ולאחר מכן ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר. התאם את צפיפות תרחיף התאים ל-60,000 תאים למיליליטר ב-MEM.

לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של תרחיף התאים לבקרה ולבדוק בארות של תחתית סטרילית ושטוחה, תרבית רקמות שטופלה בצלחת 96 בארות. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית MEM לבארות הריקות של צלחת 96 הבאר. דגרו על צלחת 96 בארות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.

שאפו את המדיום של הבארות של צלחת 96 הבאר. בזמן שאיבת המדיום, הימנע מניתוק והוצאת תאים מהבאר. ניתן להשיג זאת על ידי שימוש בקצב שאיפה נמוך והנחת בזהירות של קצות השאיפה בפינה התחתונה של משטח הבאר.

לאחר מכן, הוסף 25 מיקרוליטר של תרכובות הבדיקה פעמיים ב-MEM לבארות הבדיקה, כולל Trichostatin A, MS275 ו-Tubastatin A.הוסף 25 מיקרוליטר של MEM לבארות הבקרה והריקות. לאחר מכן, הוסף 25 מיקרוליטר מתערובת המצע לבארות הבקרה והבדיקה. לאחר מכן, הוסף 25 מיקרוליטר של MEM לבארות הריקות.

דגרו את צלחת 96 הבארות ב-37 מעלות צלזיוס למשך שמונה שעות באינקובטור לח של 5% פחמן דו חמצני. כדי לבצע ליזה של תאים, הוסף תחילה 10 מיקרוליטר של פי שישה מאגר RIPA בתוספת מעכב פרוטאז לכל באר של צלחת 96 הבארות. עצור את התגובה על ידי הוספת 160 מיקרוליטר אצטוניטריל קר לכל באר וערבב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.

מניחים את הצלחת במקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. מוציאים את הצלחת מהמקפיא ומעבירים 220 מיקרוליטר מתכולת כל באר לצלחת תחתונה לא סטרילית וחרוטית של 96 בארות. צנטריפוגה את הצלחת בחום של 5, 000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

לאחר צנטריפוגה, העבירו 200 מיקרוליטר של סופרנטנט לצלחת 96 בארות התואמת למערכת UHPLC. לאחר מכן, אטמו את הצלחת בנייר כסף איטום חום מתקלף באמצעות אוטם צלחות. הכן את מערכת ספקטרומטריית המסה של כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד על ידי מילויה במערכת הפאזה הניידת.

הנח את צלחת 96 הבאר לתוך מנהל דוגמאות המכיל מחזיק צלחת. הפעל את הדוגמאות בהתאם לתנאי UHPLC ESI MS/MS שנמצאים בטקסט. כדי לבצע ניתוח נתונים, שלב את אזור השיא של כל מצע ואת המוצר המפוזר שלו עם תוכנת האינטגרציה המתאימה של UHPLC.

עבור כל מצע, חשב את יחס שטח השיא של deacetylated לאצטילציה בכל כרומטוגרמה. כלול את דוגמאות הבדיקה והבקרה. לבסוף, חשב את אחוז עיכוב ה-HDAC של כל דגימת בדיקה לפי המשוואה בפרוטוקול הטקסט.

הכרומטוגרמה UHPLC-MS של דגימה מוצגת כאן. הפסגות המתאימות למצעים שנוספו לתאים מתגלות על פי מעברי המסה שלהם כמתואר בטבלה הראשונה של הפרוטוקול הכתוב. MOCPAC עובר דה-אצטילציה על ידי HDAC1 כדי לספק את שיא ה-MOCPAC הלא אצטילטי.

באופן דומה, BATCP עובר דה-אצטילציה על ידי HDAC6 כדי לספק את שיא ה-BATCP הלא אצטילטי. לבסוף, MAL מספק את שיא ה-MAL הנטול אצטילציה המשקף את הדאצטילציה של מספר HDACs אנדוגניים באופן לא ספציפי. מוצג כאן, האיור עם הכרומטוגרמה שהתקבל עם ריכוזים שונים של מעכב HDAC Trichostatin A.A הערכת תגובת מינון של מעכבי HDAC סטנדרטיים.

הערכים המשולבים שהתקבלו מ-MOCPAC ו-dMOCPAC שימשו לחישוב העוצמה של מעכבים סטנדרטיים כנגד HDAC1. בעקבות חישובי IC 50, MS275, מעכב HDAC סלקטיבי מסוג I, הראה ערכי IC 50 נמוכים יותר עבור HDAC1 מאשר טובסטטין A, מעכב HDAC6 ידוע. מצד שני, הערכים המבודדים מ-BATCP ו-dBATCP שימשו לחישוב עוצמת התקנים כנגד HDAC6.

הפעם, טובסטטין A סיפק ערך IC 50 נמוך יותר מ-MS275, מה שאישר את פרופיל הסלקטיביות האיזופורמית שלהם. טריכוסטטין A הוא מעכב חזק ולא סלקטיבי. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 72 שעות אם היא מבוצעת כראוי כולל זמן הטיפול בתאים וניתוח צלחת 96 הבארות.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שזמני הדגירה המצוינים כאן הם עבור תאי HeLa. אם נעשה שימוש בקו תאים אחר, יש למטב זאת. בעקבות הליך זה, ניתן למדוד פעילות מעכבת HDAC סלקטיבית של איזופורמים אחרים כל עוד קיימים סובסטרטים ספציפיים.

אל תשכח שעבודה עם ממיסים אורגניים וכימיקלים אחרים עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש ללבוש משקפי הגנה, כפפות וחלוק מעבדה בזמן ביצוע הליך זה.