פרוטוקול עבור HER2 דגים באמצעות מקבע-קישור קרוס, ללא פורמלין רקמות כדי לשלב את היתרונות של הקפאה-שימור קיבוע פורמלין
25 בדצמבר 2017
קרינה פלואורסצנטית מקומיים הכלאה (דגים) נדרש לעיתים קרובות בשילוב עם histopathology ואבחון מולקולרי לבחירה של טיפול ברפואה אישית. מקבע הרומן רקמת-קישור קרוס, ללא פורמלין המאפשר באיכות גבוהה מורפולוגיות, מולקולרית וניתוחים דגים מן הדגימה זהה על ידי תוספת של שלב קיבוע שאחרי לפני דגים מוצג.
רפואה מותאמת אישית דורשת את סוגי הניתוח השונים מהיסטולוגיה קלאסית ועד לניתוח מולקולרי, וטכניקות שונות באתרן מבוצעות על גידול כדי לבחור את הטיפול הטוב ביותר. טכניקות החקירה מאפשרות טכנולוגיות אנליטיות שונות מדגימה אחת. אנו מדגימים כאן, על ידי שימוש בקיבוע שאינו צולב בשלב הפשוט שלאחר קיבוע הפורמלין שאתה יכול להשתמש בפרוטוקולים שפותחו במקור ואומתו עבור חומר משובץ פרפין פורמלי וקבוע, ניתן להשתמש מדגימת התא המניבה מורפולוגיה טובה, איכות RNA טובה ותוצאות טובות עבור הכלאה מלאה יותר באתר.
תנאי ההכלאה האופייניים אינם מתאימים לרקמות קבועות נטולות פורמלין כדי לייצר תוצאות FISH. גילינו כי לא החדירה אלא זמן התיקון הכימי הוא קריטי להשגת תוצאות FISH דומות מרקמה קבועה בפקטין. רק הקטע המשמש ל-FISH הוא רשמי וקבוע לאחר מכן.
הרקמה הקבועה הנותרת נטולת פורמלין מאפשרת ניתוח מולקולרי מעולה ביחס לרקמת FFP, כפי שהודגם על ידי RTPCR. ההליך שהדגמנו על ידי דניאלה פאבסט, הטכנאית מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, חתכו את דגימות רקמת סרטן השד בעזרת אזמל סטרילי לשני חצאים, כל אחד בעובי ארבעה מילימטרים כדי להבטיח כמות רקמה מספקת.
השתמש בגודל מקסימלי של 4x15x15 millimiters לקיבוע באמצעות תמיסת פורמלין חוצצת סטנדרטית, או באמצעות קיבוע רקמות חלופי ללא פורמלין. הניחו מחצית מדגימת הגידול בקלטת רקמה סטנדרטית, וטבלו אותה ב-SBFS. הנח את החצי השני של דגימת הגידול בתמיסת הקיבוע האלטרנטיבית למשך 24 שעות עם יחס נפח לנפח של ארבעה חלקים קיבוע וחלק אחד רקמה.
לאחר מכן, העבירו את הדגימות הקבועות לחלופין לתמיסת המייצב למשך שעתיים עד 72 שעות על ידי פתיחת המיכל, סיבוב קלטת הרקמות ב-180 מעלות וטבילתה. לאחר מכן, הניחו את קלטות הרקמה עם הדגימות הקבועות ב-SBFS במיכל מלא באתנול 70% למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר שאריות SBFS. לאחר עיבוד והטמעה של רקמות כמתואר בפרוטוקול הטקסט, השתמש במיקרוטום כדי לחתוך שלושה מקטעים מיקרוניים של בלוקים FFPE ו-NCFPE.
הניחו חלק מכל סוג של קטע באמבט מים קרים. הרם את החלק הצף בעזרת מכחול דק על מגלשת מיקרוסקופ עדינה, והעביר אותו לאמבט מים חמים. הרם שוב את החלקים המתוחים בעזרת המברשת על שקופית המיקרוסקופ ללא קמטים.
התכוננו גם לבידוד RNA כדי לבצע PCR שעתוק הפוך על אותה דגימה על ידי הנחת חלק מכל סוג של קטע לבקבוקון תגובה. לצורך דה-פרפיניזציה של קטעי רקמות, אנו מרטיבים את החלקים צעד בטמפרטורת החדר בצנצנות הצביעה עם 250 מיליליטר של ריאגנטים שונים. תחילה הנח את החלקים ב-100% קסילן פעמיים למשך 15 דקות, ולאחר מכן העבר את החלקים ל-96% אתנול פעמיים למשך 15 דקות.
לאחר מכן, העבירו את החלקים דרך אחוזים נמוכים יותר של אתנול, ודגרו על כל תמיסה למשך שתי דקות. לבסוף, העבירו את החלקים למזוקק פעמיים למשך 10 דקות. בצע קיבוע לאחר שקופיות NCFPE על ידי הכנסתן לצנצנת מכתים חדשה מלאה ב- SBFS למשך 24 שעות בטמפרטורת החדר.
השאירו את הצנצנת במכסה האדים במהלך 24 השעות שלאחר הקיבוע. באופן מפתיע, כל הזמנים שלאחר הקיבוע של יותר מ-18 שעות נתנו תוצאות דומות לאלו שהושגו עם חומר פרפין פורמלי וקבוע. הסר את עודפי ה-SPFS מהשקפים על ידי שטיפתם במי מלח עם פוספט למשך 10 דקות שלוש פעמים.
לאחר מכן יש לשטוף את הכביסה השנייה במים מזוקקים למשך 10 דקות פעמיים. לאחר מכן, הניחו את צנצנת הצביעה המכילה 250 מיליליטר תמיסת טיפול מקדים בחום לימון באמבט מים של 98 מעלות צלזיוס. מניחים את ה-FFPE המיובש בשקופיות NCFPE קבועות לאחר הקיבוע לתוך הצנצנת, ומדגרים למשך 15 דקות.
לאחר מכן, שטפו את השקופיות במים מזוקקים במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר בצנצנת מכתים חדשה. לפרוטאוליזה, הנח את המגלשות להכלאה מבוקרת טמפרטורה ב-37 מעלות צלזיוס. מרחו מיד את תמיסת הפפסין המוכנה לשימוש בטיפה על חלקי הרקמה עד שהם מכוסים לחלוטין.
לאחר מכן, דגרו במשך תשע דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במערכת ההכלאה. לאחר מכן, הניחו את השקופיות בצנצנת המכילה מאגר כביסה SSC, ודגרו למשך חמש דקות. מניחים את השקופיות במים מזוקקים למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.
בצע ייבוש של החלקים בסדרה של אלכוהולים מדורגים, כל אחד למשך דקה אחת. לאחר סדרת ההתייבשות, יש לייבש את החלקים באוויר. לצורך הכלאה, פיפטה 10 מיקרוליטר של בדיקת HER2 ו-sun 17 המשולבת על חלקי הרקמות המיובשות, מכסים כל דגימה בהחלקת כיסוי ואוטמים אותה במלט גומי.
קוד מנטרל את הגשושית ואת ה-DNA של הדגימה במערכת ההכלאה ב-75 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. מערכת ההכלאה יורדת אוטומטית ל-37 מעלות צלזיוס, וההכלאה נמשכת בן לילה. למחרת, הסר בזהירות את מלט הגומי והכיסוי מחליק גם עם מלקחיים לאחר הכלאה והגנה.
דגרו את הגדלים בצנצנת מכתים המכילה 37 מעלות צלזיוס מאגר 1X A מחומם מראש למשך חמש דקות. לאחר מכן, שטפו את השקופיות באמצעות מאגר כביסה 1X שחומם מראש פעמיים למשך חמש דקות בחום של 27 מעלות צלזיוס. לאחר מכן ייבשו את המגלשות ב-70%90% ו-100% אתנול בדקה אחת לכל ריכוז.
יבש את הדגימות באוויר והגן עליהן מפני אור. לצורך מכתים, יש למרוח 30 מיקרוליטר של תמיסת DAPI על האזור ההיברידי, ולהימנע מבועות. מכסים את החלקים בתלוש כיסוי לפני הדגירה של החלקים למשך 15 דקות, מוגנים מפני אור.
הסר בזהירות עודפי תמיסת DAPI על ידי לחיצה עדינה על השקף בין ניירות המסנן. אחסן את השקופיות בטמפרטורה של שתיים עד שמונה מעלות צלזיוס בחושך עד שבועיים עד להערכה במיקרוסקופיה קונפוקלית. רכוש את התמונות עם פילטרים לערוצים ירוקים וכתומים.
המשך לפירוש נתונים והערכת איכות ה-RNA כמתואר בפרוטוקול הטקסט. מוצגת כאן ההשוואה הישירה של התוצאה שהתקבלה מהמדגם הפורמלי והקבוע, והמדגם הקבוע שאינו צולב שתוקן לאחר מכן. האותות בעוצמה דומה, וגם הרקע דומה.
בתאים בין-פאזיים רגילים, יש מספר שווה של אותות אדומים וירוקים המתאימים ללוקוס HER2 וללוקוס הייחוס sen 17 מה שמראה שאין הגברה בגן HER2. מוצגת כאן תוצאה של מקרה אחר שבו הגן HER2 מוגבר, ויש אות הרבה יותר חזק ורחב ללוקוס HER2 מאשר לגן הייחוס. תופעה זו ניכרת ברקמה הקבועה הפורמלית והקבועה, והלא צולבת.
גרף זה מציג את יעילות ההגברה עבור אורכי האמפליקונים השונים של ה-GAPDH mRNA. עבור פורמלין, יש צורך בכ-23 מחזורים, ועבור חומר קבוע שאינו צולב, זה מצטמצם ל-20 מחזורים. ההבדל ניכר יותר באמפליקונים ארוכים יותר, מה שמצביע על כך שגם הפיצול וגם השינוי הכימי מופחתים באופן ניכר על ידי שימוש בקיבוע שאינו צולב.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ניתן להשתמש במפתח מאושר על ידי ה-FDA לחומר FFPN על חומר קבוע שאינו צולב על ידי הוספת שלב פשוט לאחר קיבוע בהליך הקדם-אנליטי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שרק הקטע המשמש להכלאה מלאה באתרו מיועד לקיבוע לאחר פורמלין, ואילו הבלוק הנותר מקובע בקיבוע שאינו מקושר, ולכן ניתן להשתמש בו לספקטרום רחב של אנליזה מולקולרית. פרוטוקול זה שימושי במיוחד בהקשר של רפואה מותאמת אישית מודרנית כאשר יש לבצע ניתוחים מרובים מגידולים קטנים יחסית, ועיבוד דגימות רקמה לפרוטוקולים שונים אינו אפשרי.
יתר על כן, לשימוש בקיבוע שאינו צולב יש יתרון בכך שהוא שומר על תכונות רקמות כמו שימור בהקפאה. זה מונע את הצורך בהקפאת חנקן נוזלי, ושמירה על שרשרת קירור בהקשר כימי. הבדלים אלה באיכות ה-RNA אינם ברורים, כך שכאשר משתמשים במבחני בקרת איכות RNA קלאסיים כגון מספרי שלמות RNA, מכיוון שבדיקות אלו אינן מעצבות לחלוטין באיכות RNA המבודדת מחומר קבוע ומשובץ פרפין.
סקירה כללית
מחקר זה מציג מקבע רקמות חדשני, ללא פורמלין וללא קישור צולב, המאפשר ניתוחים מורפולוגיים, מולקולריים ו-FISH באיכות גבוהה מאותה דגימה. השיטה מאפשרת גישות של רפואה מותאמת אישית על ידי שילוב טכניקות אנליטיות שונות מדגימת גידול אחת.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה
- דיאגנוסטיקה מולקולרית
רקע
- רפואה מותאמת אישית דורשת ניתוחים מגוונים לצורך בחירת הטיפול האופטימלי.
- הibrדיזציה אין-סיטו פלואורסצנטית (FISH) היא קריטית לאבחנה מולקולרית.
- שיטות קיבוע מסורתיות עלולות לפגוע באיכות הרקמה עבור ניתוחים שונים.
- שיטת קיבוע חדשה מוצעת כדי לשפר את איכות התוצאות.
מטרת המחקר
- להדגים את יעילותו של מקבע שאינו יוצר קשרי הצלבה עבור FISH.
- להשוות תוצאות מרקמות מקובעות בפורמלין ומרקמות מקובעות ללא פורמלין.
- לספק פרוטוקול המשלב ניתוחים מרובים מדגימה אחת.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- דגימות רקמה של סרטן השד חולקו וקובעו בשיטות שונות.
- שלבי פוסט-קיבוע בוצעו כדי לשפר את תוצאות ה-FISH.
- פרוטוקולים סטנדרטיים לבידוד RNA ולהיברידיזציה הותאמו.
- מיקרוסקופיה קונפוקלית שימשה להדמיה ולניתוח התוצאות.
תוצאות עיקריות
- הקיבוע הלא-מצלב הניב מורפולוגיה ואיכות RNA טובות.
- תוצאות ה-FISH היו דומות לאלו שהתקבלו מרקמות מקובעות בפורמלין.
- ניתוח מולקולרי עדיף הודגם באמצעות שיטת הקיבוע החדשה.
- זמני קיבוע לאחר הטיפול שעלו על 18 שעות הניבו תוצאות אופטימליות.
מסקנות
- שיטת הקיבוע החדשנית מאפשרת ביצוע ניתוחים באיכות גבוהה מאותה דגימת רקמה.
- גישה זו תומכת ברפואה מותאמת אישית באמצעות שילוב של מספר טכניקות אבחנתיות.
- תיקוף נוסף של השיטה עשוי להרחיב את יישומה במסגרות קליניות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג ניהולי
פרוטוקול זה מאפשר שימור כפול של מורפולוגיית הרקמה והשלמות המולקולרית מדגימה בודדת, ובכך פותר צוואר בקבוק מרכזי בתהליכי עבודה של רפואה מותאמת אישית, שבהם מספר בדיקות אבחנתיות מתחרות על כמות מוגבלת של רקמת גידול. על ידי מתן אפשרות לביצוע אנליזת FISH על חתכים שעברו קיבוע משני בפורמלין, תוך שימור שאר הבלוק לבדיקות מבוססות RNA, הפרוטוקול תומך באבחון היסטופתולוגי ומולקולרי מקבילי ללא צורך בפיצול הדגימה. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי באימות המטרה על ידי הפחתת שונות פרה-אנליטית ומאפשרת השוואה ישירה של סטטוס HER2 עם נתונים טרנסקריפטומיים מאותו גידול.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר הערכה בו-זמנית של הגברה של גן HER2 ושל איכות ה-RNA מחתכי רקמה סמוכים, ובכך תומך בהסרת סיכונים מכניסטית של היפותזות טיפוליות.
- ערך תפעולי: מפחית את צריכת הרקמה על ידי ביטול הצורך בבלוקים נפרדים של FFPE ובלוקים קפואים עבור היסטופתולוגיה ואנליזה מולקולרית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מספק סבב עבודה סטנדרטי התואם ל-FISH, השומר על עוצמת האות ועל שקיפות הרקע בדומה לבקרי FFPE, ובכך מבטיח את הדירות הבדיקה.
- ערך תפעולי: מאפשר התאמה של פרוטוקולי FISH קיימים באמצעות שלב פשוט של קיבוע משני, ובכך מצמצם את מאמצי התיקוף מחדש עבור מעבדות אבחנתיות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: משמר את איכות ה-RNA ברמה גבוהה יותר מ-FFPE, מה שמאפשר יישומים המשכיים כגון RT-PCR לאישור סממנים ביולוגיים לצד תוצאות FISH.
- ערך תפעולי: תומך בפרופיל מולקולרי אורך רב מרקמות ארכיוניות על ידי מניעת קשירה צולבת (cross-linking) של חומצות גרעין, המעכבת את יעילות ההגברה.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי על ידי מתן אפשרות לתיקוף מטרות מבוסס FISH בשלב מוקדם של התהליך, תוך שימור החומר עבור יישומים של -omics בהמשך, ובכך היא יוצרת מעבר רציף מבדיקת השערות לזיהוי מובילים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות על ידי מתן אפשרות למתאם ישיר בין אותות HER2 FISH לבין נתוני ביטוי גנים מאותה דגימה.
- סקרינג: מספקת תוצאי FISH כמותיים הדומים לאלו של FFPE, מה שמאפשר הערכה מהימנה של מצב הגברה של המטרה במודלים פרה-קליניים.
- אנליטיקה: מספקת יחסי אותות של HER2/chromosome 17 ומדדי שלמות של RNA, המנחים החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) בתעדוף מטרות.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין שלב הגילוי לעבודה פרה-קלינית על ידי שמירה על יכולת ניתוח מולקולרית של הרקמה לאחר FISH, ובכך מקלה על סטרטיפיקציה מונחית-ביומארקרים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר להכנת רקמות, הישמה על פני אינדיקציות אונקולוגיות הדורשות שילוב של FISH ופרופילינג מולקולרי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בתיקוף המטרה על ידי הפחתת תוצאות שגויות שליליות הנובעות מפירוק RNA ומאפשר אינטגרציה של נתונים רב-מודאליים.
- ערך תפעולי: משפר את יעילות ניצול הרקמה, דבר קריטי עבור דגימות גידולים נדירות או קטנות בשלבי הגילוי המוקדמים.
- ערך אסטרטגי: מפחית סיכונים בבחירת המטרה על ידי סנכרון נתוני היסטופתולוגיה, FISH ונתונים מולקולריים מתוך הקשר ביולוגי יחיד.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון באמצעות קריאות אבחנתיות תואמות המפחיתות עמימות ביולוגית.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בהיסטולוגיה, FISH וביולוגיה מולקולרית לניהול זרימות עבודה של קיבוע כפול.
- תלוי בגישה לפורמלין, למקבע שאינו יוצר קשרי גומלה (non-cross-linking fixative) ולציוד היברידיזציה סטנדרטי.
- דורש סטנדרטיזציה של משך זמן הקיבוע המשני (>18 שעות) בין צוותים כדי להבטיח תוצאות FISH ברי השוואה.
- שיקולי התאמה כוללים תיקוף של חדירות הגשש ויציבות האות ברקמה שקובעה במקבע שאינו יוצר קשרי גומלה לפני קיבוע משני בפורמלין.
- מגבלה מעשית: רק החיתוך המשמש ל-FISH עובר קיבוע משני בפורמלין; שאר הבלוק נותר בלתי מתאים לבדיקות שעברו אופטימיזציה ל-FFPE הדורשות קישור צולבי נרחב.
