זמן לשגות Confocal הדמיה של נוירונים נודדים תרבות פרוסה Organotypic של המוח עכבר עובריים באמצעות

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא תצפית ישירה על נוירונים הנודדים רדיאלית בתרבית פרוסות אורגנוטיפית שהוכנה ממוח עוברי שעבר אלקטרופורציה, באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של צילום במרווחי זמן (time-lapse). שיטה זו יכולה לסייע בחקר היבטים מרכזיים של התפתחות הנאוקורטקס. היא מאפשרת חקירה של המנגנונים המולקולריים המעורבים בפולריזציה של נוירונים ובנדידה רדיאלית של נוירונים למיקומם הסופי בתוך המוח.

היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לנתח את התכונות הדינמיות של נוירונים נודדים, כולל פרופילי מהירות, מהירות נדידה ממוצעת וכן שינויים בכיוון הנדידה. התחל בהנחת עכברה בהריון שעברה הרדמה מתאימה בתנוחת גב על פלטת חימום. בדוק את היעדרו של רפלקס כף הרגל.

לאחר מכן, כסו בזהירות את העיניים בבזלין כדי למנוע מהן להתייבש. לאחר מכן, פרסו בעדינות את הגפיים וקבעו אותן ללוח החממה באמצעות סרט הדבקה כירורגי. סטרילו את הבטן על ידי שפשוף עם 70%ethanol ולאחר מכן תמיסת יוד, ואז הניחו מעל הבטן גזה סטרילית, שבה בוצע חתך עבור החתך הבטני.

הרטיבו את הגזה בתמיסת נתרק כלוריד עם חומר בקטריוסטטי. לאחר הערכה חוזרת של התפתחות ההרדמה הכירורגית, על ידי אובדן רפלקס כף הרגל, השתמשו בפינצטת מיקרו Adson משוננת ובמספריים דקים זוויתיים כדי לחתוך את העור בכש 1.5 סנטימטרים לאורך קו האמצע של הבטן. לאחר מכן, חתכו את השריר שמתחת לעור לאורך ה-linea alba.

אחזו בקרן הרחם בין העוברים באמצעות פינצטה טבעתית והניחו אותה בעדינות על הגזה לחה, ללא הפרעה לשליות או לכלי הדם המזינים. לאחר מכן, מקמו בזהירות עובר באופן שיאפשר תצפית ברורה על החדר הצדי, הנראה כצל בצורת סהר המקביל לסינוס הסגיטלי. אתר ההזרקה נמצא במרכז הקו שבין העין הפיגמנטית למפגש הסינוסים, במקום שבו הסינוס הסגיטלי מתפצל לשני סינוסים מעבירים.

לאחר הזיהוי, דחפו את מחט המיקרו-הזרקה דרך דופן הרחם ואל תוך החדר הצדי. לאחר מכן, השתמשו במיקרו-מזרק המופעל באמצעות דוושה כדי להזריק 1-2 µL של תמיסת DNA בחמישה עד 10 פולסים. ניתן לעקוב אחר הצלחת ההזרקה באמצעות תמיסת ה-DNA הצבעונית, שצריכה למלא את מערכת החדרים.

לאחר מכן, מקמו אלקטרודות מסוג פינצטה כך שההדק החיובי יהיה באותו צד של החדר המוזרק וההדק השלילי יהיה בצד הנגדי של החדר המוזרק, מתחת לאוזן של ראש העובר. הרטיבו את נקודת האלקטרופורציה בכמה טיפות של תמיסת sodium chloride בקטריוסטטית והשלימו חמישה פולסי זרם חשמלי במשך 50-millisecond במרווחים של 950-millisecond. בועות באלקטרודה השלילית מעידות על מעבר זרם חשמלי.

זרם של 60 עד 90 מילי-אמפרים מספיק בדרך כלל לאלקטרופורציה מוצלחת. זרמים נמוכים יותר לא יבצעו טרנספקציה יעילה לנוירונים, בעוד שזרמים גבוהים יותר עלולים להוביל למות העוברים. לאחר חזרה על הפרוצדורה עבור כל עובר בקרן הרחם הראשונה, החזירו אותה בעדינות לחלל הבטן.

לאחר תפירת שכבת השריר והעור, חטאו בזהירות בתמיסת יוד והסירו בעדינות את הוזלינל מהעיניים באמצעות מקלוני צמר גפן של תאית. הניחו את העכבר תחת מנורת אינפרא-אדום עד להתעוררותו. לאחר ביצוע המתנזיה לנקבה ההרה בשיטה מאושרת, הוציאו את הרחם המכיל את העוברים והניחו אותו בצלחת פטרי של 10 סנטימטרים עם HBSS מלא קר מאוד.

מהשלב זה ואילך, יש לשמור את כל התמיסות, העובריים והמוחות על קרח. בעת העבודה תחת מיקרוסקופ סטריאו, השתמשו בפינצטה בעלת קצה דק ובמספרי קפיץ מסוג Vannas Tubingen כדי להפריד כל עובר מהרחם. העבירו את העוברים לצלקרת פטרי אחרת המכילה HBSS מלא קר במידה של קרח.

בצעו חתך בגובה גבעול המוח וחתכו לאורך הקו האמצעי הסגיטלי. קלפו את העור והסחוס המכסים את המוח. לאחר מכן, חתכו את גבעול המוח מיד מאחורי ההמיספרים והוציאו את המוח מהגולגולת.

העבירו את המוח באמצעות שפתוּל-כף מיקרוסקופי לפלטת 12 בארות המכילה HBSS מלא ומקורר להקרעה. אספו את כל המוחות מהשגרה אל פלטת 12 הבארות. לאחר מכן, השתמשו במיקרוסקופ סטריאופלואורסצנטי כדי לסרוק את המוחות בפלטת 12 הבארות לצורך בדיקת עוצמת הפלואורסצנציה וכן גודלו של האזור שעבר אלקטרופורציה.

בחרו שניים עד ארבעה מוחות בעלי אותות פלואורסצנטיים בהירים ואזור קליפת המוח הסומטוסנסורית המשוער לעיבוד המשכי. לאחר מכן, שפכו תמיסת אגרוז 3% בנקודת התמסכות נמוכה מומסת לתוך תבנית הטמעה חד-פעמית הניתנת לקילוף. השתמשו בשפשף מיקרו-כף כדי להוציא את המוח מלוח 12 הבארים, וסננו בזהירות HBSS מלא עודף מסביב למוח באמצעות נייר רקמה עדין.

הניחו את המוח בעדינות לתוך תמיסת האגרוז. לאחר מכן, השתמשו במחט בכיל 20 כדי לדחוף אותו לתחתית התבנית וכוונו את מיקומו בזהירות. עבור חתכים קורונליים, כוונו את המוח כך שהבצולבים הריחיים יפנו כלפי מעלה.

שמרו את התבנית על קרח עד שהתמיסה של האגרוז תתגבש, ולאחר מכן המשיכו לחיתוך המוח. השתמשו בלהב תער נקי כדי להסיר את עודפי האגרוז מסביב למוח, כך שיישאר כשנימה אחת של אגרוז מכל הצדדים, למעט הפקעות הריח (olfactory bulbs) שבהן יש להשאיר שני עד שלושה מילימטרים של אגרוז. לאחר מריחה של כמות קטנה של דבק ציאנואקרילט על דגימה, קבעו את בלוק האגרוז החתוך כאשר הפקעות הריח פונות כלפי מטה.

העבירו את במת הדגימה לתא החיתוך של מיקרוטום בעל להב רוטט המכיל HBSS מלא ומקורר לטמפרטורת קרח, ומקמו את המוח כך שהצד הגבי שלו פונה כלפי הלהב. חתכו פרוסות מוח בעובי 250 micron הכוללות את האזור שעבר אלקטרופורציה, תוך שימוש באמפליטודה נמוכה עד בינונית ובמהירות חיתוך איטית מאוד. בדרך כלל מתקבלות ארבע עד שש פרוסות עם אות פלואורסצנטי בהיר מכל מוח שעבר אלקטרופורציה בהצלחה.

תפוס את שולי האגרוז של נתח אחד באמצעות פינצטה בעלת קצה דק ומשוך את הפרוסה על גבי שפשול מיקרו מסוג כף כפופה. באופן זה, העבר בזהירות את פרוסות המוח לצלחת בעלת שישה בארות המכילה HBSS מלא קר מאוד. הרטב סרטים (inserts) של ממברנה מצופה בלמינין עם 100 µL של HBSS מלא.

לאחר מכן, העבירו בזהירות את הפרוסות אל הממברנות באמצעות שפכטל מיקרו כפוף ופינצטה. דחפו בעדינות את הפרוסה מהשפכטל אל הממברנה, ואז מיקמו אותה באמצעות הפינצטה. המשיכו להעביר את שאר הפרוסות.

ניתן להניח עד חמש פרוסות על גבי תבנית ממבנה אחת (membrane insert). יש להסיר את עודפי ה-HBSS המלא בעזרת פיפטה. לאחר מכן, בעזרת פינצטה, יש להניח בזהירות את תבניות הממבנה עם הפרוסות לתוך פלטת שש בארות המכילה 1.8 milliliters של מצע גידול לפרוסות.

בחר פרוסת מוח לצילום על ידי התבוננות בפרוסות באמצעות מיקרוסקופ הפוך. בחר פרוסה שבה נראים נוירונים בודדים ובהירים ב-SVZ העליון, הנודדים רדיאלית לעבר פני השטח של הפרוסה. נוכחותם של זרועות פלואורסצנטיות עדינות של תאי גליא רדיאלית, המשתרעות לכל אורך הפלטה הקונג'וגטית, מעידה על פיגום גליא רדיאלית תקין המשמש את הנוירונים הקונג'וגטיים הנודדים.

העבירו את תא הממברנה עם הפרוסה הנבחרת לצלחית עם תחתית זכוכית בקוטר 50 מילימטר המכילה שני מיליליטר של מדיום לתרבית פרוסות. הניחו את הצלחית בתא האקלים של המיקרוסקופ הקונפוקאלי. הגדירו את הרזולוציה ל-512 על 512 פיקסלים.

העלה את מהירות הסריקה מ-400 hertz ל-700 hertz כדי להגדיל את קצב הפריימים מכ-1.4 לכ-2.5 פריימים לשנייה. השתמש בממוצע של לא יותר מפעמיים. הגדר Z-stack דרך האזור שעבר אלקטרופורציה עם גודל צעד של 1.5 microns.

התחילו את סדרת צילומי ה-time-lapse על ידי ביצוע Z-stack בכל 30 דקות. ההגדרות המתוארות מאפשרות רזולוציה ובהירות תמונה מספקות, תוך שמירה על נזק פוטו-כימי נמוך במהלך הרכישה. סרט זה מציג נוירונים קורטיקליים ביום העוברי E16.5 הנודדים מהאזורים הוונטריקולריים והסוב-וונטריקולריים אל הלוח הקורטיקלי.

בטרנסגנית המותנית Bcl11a floxed לאחר אלקטרופורציה של פלסמיד הבקרה IRES-GFP ביום עוברי 14.5. הסרטון מורכב מ-108 פריימים בקצב של חמישה פריימים לשנייה. סרגל המقياس מייצג 100 מיקרון.

אלקטורפורציה של וקטור פלסמיד DNA המכיל Cre-IRES-GFP השפיעה על נדידת נוירונים קורטיקליים במוחות עם Bcl11a floxed מותנה. כפי שניתן לראות כאן, נוירונים מעטים מאוד נעים מעבר לאזור הביניים (intermediate zone) כדי להגיע ללוח הקורטקס (cortical plate). סרטון זה מראה את הקיטוב של נוירונים קורטיקליים מבקרה המסומנת ב-GFP משמאל, בהשוואה לנוירונים ממוטציה של Bcl11a מימין.

עקבות מונפשות אלו של בקרה מייצגת בנוירונים מוטנטיים של Bcl11a הותגו מסדרות של צילומי time-lapse של תרביות פרוסות E16.5 ברזולוציה של מרווחי זמן של שעה אחת. שוב, נתונים מהמוח של קבוצת הביקורת מוצגים משמאל ונתונים מהמוח שעבר electroporation של Cre-IRES-GFP מוצגים מימין. כפי שניתן לראות מאספפת עקבות מייצגות זו מתרביות פרוסות של ביקורת ושל מוטנט Bcl11a, נוירוני מוטנט Bcl11a עוברים לעיתים קרובות שלבים חוזרים של מהירות נדידה מופחתת ושינוי כיוון אקראי, כפי שסומן על ידי חצי החצים האדומים.

ניתן לחשב פרופילי מהירות מעקבות של נוירונים נודדים. כפי שניתן לראות כאן, חלק גדול יותר של נוירוני מוטציה של Bcl11a מראים מהירויות נדידה איטיות יותר בהשוואה לקבוצות הביקורת. ניתן לחשב את זווית הסטייה מנתוני העקבות.

כפי שניתן לראות מהיסטוגרמה זו, נוירונים מוטנטיים של Bcl11a, המיוצגים על ידי הפסים השחורים, מראים זוויות סטייה גדולות יותר בהשוואה לבקרים. ברגע שהטכניקה נלמדת, ניתן לבצע אותה בפחות משעתיים עבור האלקטרופורציה ב-in utero ועבור הכנת תרבית של פרוסות מוח אורגנוטיפיות. ניתן להתאים הליך זה בקלות לביצוע ניתוח חלקי של גנים רלוונטיים בנוירונים קורטיקליים הנודדים רדיאלית, באמצעות תפקוד מוגבר או מופחת (gain and loss of function), וכן לניסויים וסקולריים.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לצפות באופן ישיר בנוירונים הנודדים רדיאלית בתרבית פרוסות אורגנוטיפית שהוכנה ממוחות עובריים שעברו אלקטרופורציה, וזאת באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של צילומי רצף (time-lapse).