זמן לשגות Confocal הדמיה של נוירונים נודדים תרבות פרוסה Organotypic של המוח עכבר עובריים באמצעות באוטרו Electroporation

פרוטוקול זה מספק הוראות תצפית ישירה של נוירונים קליפת המוח נודדת. ב electroporation ברחם , תרבות פרוסות organotypic, הדמיה confocal זמן לשגות משולבים ישירות באופן דינמי ללמוד את ההשפעות של overexpression או downregulation של גנים של עניין נודדים נודדות ולנתח את ההבחנה שלהם במהלך הפיתוח.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לצפות ישירות בתאי עצב נודדים רדיאלית בתרבית פרוסות אורגנוטיפית שהוכנה ממוח עוברי אלקטרופוטרי על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית של זמן-lapse. שיטה זו יכולה לסייע בחקר היבטים מרכזיים של התפתחות ניאו-קורטקס. הוא מאפשר לחקור את המנגנונים המולקולריים המעורבים בקיטוב נוירונים ובנדידה רדיאלית של נוירונים למיקומם הסופי במוח.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לנתח את התכונות הדינמיות של נוירונים נודדים כולל פרופילי מהירות, מהירות הגירה ממוצעת וכן שינויים בכיוון הנדידה. התחל בהנחת עכבר בהריון מורדם כראוי במצב שכיבה על צלחת חימום. בדוק אם אין רפלקס דוושה.

ואז, כסו בזהירות את העיניים בג'לי נפט כדי למנוע את התייבשותן. לאחר מכן, פרשו בעדינות את הגפיים וקבעו אותם לצלחת החימום בעזרת סרט כירורגי. עקרו את הבטן על ידי ספוגית עם אתנול 70% ואחריו תמיסת יוד, ואז הניחו גזה סטרילית, בה נעשה חתך לחתך הבטן, מעל הבטן.

הרטיבו את הגזה בתמיסת נתרן כלורי בקטריוסטטית. לאחר הערכה מחדש של התפתחות ההרדמה הכירורגית, על ידי אובדן רפלקס הדוושה, השתמש במלקחיים משוננים של מיקרו אדסון ובמספריים עדינים בזווית כדי לחתוך את העור כ -1.5 סנטימטרים לאורך קו האמצע של הבטן. לאחר מכן, חותכים את השריר הבסיסי לאורך הלינאה אלבה.

אחוז בקרן הרחם בין העוברים בעזרת מלקחיים טבעתיים והנח אותה בעדינות על הגזה הלחה מבלי להפריע לשליה או לכלי האספקה. לאחר מכן, מקם בזהירות עובר כדי לתת מבט ברור על החדר הצדדי המוצג כצל בצורת סהר המקביל לסינוס הסגיטלי. אתר ההזרקה נמצא באמצע קו בין העין הפיגמנטית למפגש הסינוסים שבו הסינוס הסגיטלי מסתעף לשני סינוסי העברה.

לאחר הזיהוי, דחף את מחט המיקרו-הזרקה דרך דופן הרחם ולתוך החדר הצדדי. לאחר מכן, השתמש במיקרו-מזרק המופעל עם דוושת רגל כדי להזריק 1-2 מיקרוליטר של תמיסת DNA עם חמישה עד 10 פולסים. ניתן לעקוב אחר הזרקה מוצלחת על ידי תמיסת ה-DNA הצבעונית שאמורה למלא את מערכת החדרים.

לאחר מכן, הנח אלקטרודות מסוג פינצטה כך שהמסוף החיובי יהיה באותו צד של החדר המוזרק והמסוף השלילי נמצא בצד הנגדי של החדר המוזרק מתחת לאוזן ראש העובר. הרטיבו את אתר האלקטרופורציה בכמה טיפות של תמיסת נתרן כלורי בקטריוסטטית והפעילו חמישה פולסים של זרם חשמלי באורך של 50 אלפיות השנייה במרווחים של 950 אלפיות השנייה. בועות באלקטרודה השלילית מצביעות על זרם חשמלי.

60 עד 90 מיליאמפר מספיקים בדרך כלל לאלקטרופורציה מוצלחת. זרמים נמוכים יותר לא יעבירו ביעילות נוירונים בעוד שזרמים גבוהים יותר עלולים להוביל למוות עוברי. לאחר חזרה על ההליך עבור כל עובר של קרן הרחם הראשונה, הנח אותו בעדינות בחזרה לחלל הבטן.

לאחר תפירת שכבת השריר והעור, יש לחטא בזהירות בתמיסת יוד ולהסיר בעדינות את ג'לי הנפט מהעיניים באמצעות ספוגיות תאית. הנח את העכבר מתחת למנורת אינפרא אדום עד שהוא מתעורר. לאחר המתת חסד של הנקבה ההרה בשיטה מאושרת, הסר את הרחם המכיל את העוברים והנח אותו בצלחת פטרי בגודל 10 סנטימטרים עם HBSS מלא קר כקרח.

מנקודה זו ואילך, שמור את כל התמיסות, העוברים והמוחות על הקרח. תוך כדי עבודה תחת סטריאומיקרוסקופ, השתמש במלקחיים עדינים ובזוג מספריים קפיציים של Vannas Tubingen כדי להפריד כל עובר מהרחם. העבירו את העוברים לצלחת פטרי אחרת המכילה HBSS מלא קר כקרח.

בצע חתך בגובה גזע המוח וחתוך לאורך קו האמצע הסגיטלי. מקלפים את העור והסחוס המכסים את המוח. לאחר מכן, חתכו את גזע המוח ממש מאחורי ההמיספרות והוציאו את המוח מהגולגולת.

העבירו את המוח בעזרת מרית מיקרו כף לצלחת של 12 בארות המכילה HBSS שלם קר כקרח. אספו את כל המוחות מהמלטה בצלחת של 12 בארות. לאחר מכן, השתמש בסטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לסנן את המוחות בצלחת 12 הבארות עבור בהירות התפרחת כמו גם את גודל האזור האלקטרופוט.

בחר שניים עד ארבעה מוחות עם אותות פלואורסצנטיים בהירים ואת קליפת המוח הסומטוסנסורית המשוערת להמשך עיבוד. לאחר מכן, יוצקים תמיסת אגרוז מותכת של 3% עם נקודת התכה נמוכה לתבנית הטבעה חד פעמית מתקלפת. השתמש במרית מיקרו כף כדי להסיר את המוח מצלחת 12 הבארות ולנקז בזהירות עודפי HBSS מלא מסביב למוח באמצעות נייר טישו עדין.

הנח את המוח בעדינות בתמיסת האגרוז. לאחר מכן, השתמש במחט בגודל 20 כדי לדחוף אותה לתחתית התבנית ולהתאים בזהירות את מיקומה. עבור חתכים קורונליים, כוונו את המוח כשנורות הריח פונות כלפי מעלה.

שמור את התבנית על קרח עד שתמיסת האגרוז מתמצקת ואז המשך לחתוך את המוח. השתמש בסכין גילוח נקי כדי לקצץ עודפי אגרוז סביב המוח ולהשאיר כמילימטר אחד של אגרוז מכל הצדדים למעט פקעות הריח שבהן יש להשאיר שניים עד שלושה מילימטרים של אגרוז. לאחר מריחת כמות קטנה של דבק ציאנואקרילט על דגימה, תקן את גוש האגרוז הגזום כשנורות הריח פונות כלפי מטה.

העבירו את שלב הדגימה לתא החיתוך של מיקרוטום להב רוטט המכיל HBSS שלם קר כקרח ומקמו את המוח עם הצד הגבי שלו לכיוון הלהב. חותכים פרוסות מוח בעובי 250 מיקרון המכילות את האזור האלקטרופוטרי עם משרעת נמוכה עד בינונית ומהירות חתך איטית מאוד. בדרך כלל מתקבלות ארבע עד שש פרוסות עם אות פלואורסצנטי בהיר מכל מוח שהצליח לאלקטר אותו.

אחוז בשפת האגרוז של קטע אחד בעזרת מלקחיים עדינים ומשוך את הפרוסה אל מרית מיקרו כף כפופה. באופן זה, העבירו בזהירות את פרוסות המוח לצלחת בת שש בארות המכילה HBSS שלם קר כקרח. הרטיבו את תוספות הממברנה המצופות למינין עם 100 מיקרוליטר של HBSS שלם.

לאחר מכן, העבירו בזהירות את הפרוסות על הממברנות בעזרת מרית המיקרו כף הכפופה והמלקחיים. דחפו בעדינות את הפרוסה מהמרית אל הממברנה, ואז מקמו בעזרת מלקחיים. ממשיכים להעביר את הפרוסות הנותרות.

ניתן להניח עד חמש פרוסות על תוספת קרום אחת. הסר עודף HBSS שלם בעזרת פיפטה. לאחר מכן, בעזרת מלקחיים, הניחו בזהירות את תוספות הממברנה עם הפרוסות לצלחת בת שש בארות המכילה 1.8 מיליליטר מדיום תרבית פרוס.

בחרו פרוסת מוח להדמיה על-ידי הצגת הפרוסות דרך מיקרוסקופ הפוך. בחר פרוסה עם נוירונים בודדים בהירים ב-SVZ העליון הנודדים רדיאלית לכיוון פני הערימה של הפרוסה. נוכחותם של תהליכים פלואורסצנטיים עדינים של תאי גליה רדיאליים המשתרעים על פני כל הלוח המצומד מעידה על פיגום גליה רדיאלי שלם המשמש נוירונים מצומדים נודדים.

העבירו את תוספת הממברנה עם פרוסה נבחרת לכלי עם תחתית זכוכית בקוטר 50 מילימטר המכיל שני מיליליטר של מדיום תרבית פרוסות. הכניסו את המנה לתא האקלים של המיקרוסקופ הקונפוקלי. הגדר את הרזולוציה ל- 512 על 512 פיקסלים.

הגדל את מהירות הסריקה מ-400 הרץ ל-700 הרץ כדי להגדיל את קצב הפריימים מכ-1.4 לכ-2.5 פריימים לשנייה. השתמש בממוצע לא יותר מפעמיים. הגדר מחסנית Z דרך האזור האלקטרופוטרי בגודל צעד של 1.5 מיקרון.

התחל את סדרת קיטועי הזמן על ידי לקיחת מחסנית Z כל 30 דקות. ההגדרות המתוארות מאפשרות רזולוציה ובהירות מספיקות של התמונה תוך שמירה על נזק נמוך לתמונה במהלך הרכישה. הסרטון הזה מראה נוירונים בקליפת המוח E16.5 נודדים מהאזורים התת-חדריים ללוח קליפת המוח.

ב- Bcl11a פלוקס טרנסגני מותנה לאחר אלקטרופורציה של פלסמיד הבקרה IRES-GFP ביום העוברי 14.5. הסרט מורכב מ-108 פריימים בקצב של חמישה פריימים לשנייה. סרגל קנה המידה מייצג 100 מיקרון.

אלקטרופורציה של וקטור פלסמיד DNA המכיל Cre-IRES-GFP השפיעה על נדידת נוירונים בקליפת המוח במוח מותנה של Bcl11a. כפי שניתן לראות כאן, מעט מאוד תאי עצב עוברים את אזור הביניים כדי להגיע ללוח קליפת המוח. הסרטון הזה מראה את הקיטוב של תאי עצב בקליפת המוח מבקרה עם תווית GFP משמאל בהשוואה לתאי עצב ממוטציה Bcl11a מימין.

עקבות מונפשים אלה של שליטה מייצגת בנוירונים מוטנטיים Bcl11a התקבלו מסדרות זמן-lapse של תרביות פרוסות E16.5 ברזולוציה של שעה. שוב, נתונים ממוח הבקרה מוצגים משמאל, ונתונים מהמוח האלקטרופוטרי Cre-IRES-GFP מוצגים מימין. כפי שניתן לראות מאוסף זה של עקבות מייצגים מתרביות פרוסות מוטנטיות של בקרה ו-Bcl11a, הנוירונים המוטנטיים Bcl11a עוברים לעתים קרובות שלבים חוזרים ונשנים של מהירות נדידה מופחתת ושינוי כיוון אקראי כפי שמסומן על ידי ראשי החץ האדומים.

ניתן לחשב פרופילי מהירות מעקבות של נוירונים נודדים. כפי שניתן לראות כאן, לחלק גדול יותר מהנוירונים המוטנטיים של Bcl11a יש מהירויות נדידה איטיות יותר בהשוואה לקבוצת הביקורת. ניתן לחשב את זווית הסטייה מנתוני המעקב.

כפי שניתן לראות מהיסטוגרמה זו, הנוירונים המוטנטיים Bcl11a המיוצגים על ידי הפסים השחורים מציגים זוויות סטייה גדולות יותר בהשוואה לביקורת. לאחר השליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך פחות משעתיים כל אחת עבור אלקטרופורציה ברחם והכנת תרבית פרוסות מוח אורגנוטיפיות. ניתן להתאים הליך זה בקלות לביצוע ניתוח חלקי של גנים מעניינים בנוירונים קליפת המוח הנודדים רדיאלית על ידי רווח ואובדן תפקוד כמו גם ניסויים בכלי הדם.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לצפות ישירות בנוירונים נודדים רדיאלית בתרבית פרוסות אורגנוטיפית שהוכנה ממוחות עובריים אלקטרופוטיים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית של זמן-lapse.