זיהוי ואפיון הגורמים גרורתי על ידי העברה גנטית לתוך הרומן RIP-התג; RIP-מס ערך מוסף דגם מאתר

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות ולאפיין גורמים גרורתיים על ידי העברת גנים ל-Novel RIP-Tag; דגם עכבר RIP-tva. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום גרורות הסרטן כגון זיהוי המניעים והמטרות הטיפוליות החדשניות. היתרון העיקרי של מודל עכברי זה של סרטן הוא זיהוי גורמים גרורתיים על ידי העברת גנים סומטיים ללגיונות מבשרי תאי בטא בלבלב.

התחל בקצירת צלחת אחת של 15 סנטימטר של וירוס המייצרת תאי DF1 לכל עכבר כדי להידבק. ראשית, אספו את המדיום מכלי ה-15 סנטימטר המשולבים. לאחר מכן הסר פסולת תאים על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה בצנטריפוגה מקוררת מראש למשך 10 דקות ב-1650 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, העבירו את הסופרנטנט הנגיפי לצינורות אולטרה-צנטריפוגה פוליאלומר. סובב אולטרה-צנטריפוגה למשך 1.5 שעות ב-9540 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס. הסר כמה שיותר סופרנטנט מצינורות האולטרה-צנטריפוגה.

לאחר מכן הוסף PBS לצינור האולטרה-צנטריפוגה כדי ליצור את התרחיף הנגיפי הסופי של 100 מיקרוליטר למנה של 15 סנטימטר. כסו את הצינורות בסרט מעבדה והשעו מחדש את הגלולה הנגיפית הבלתי נראית על ידי מערבולת למשך שתי דקות במהירות בינונית. לאחר מכן נדנד את צינורות האולטרה-צנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה או לילה.

לאחר הדגירה, העבירו את התרחיף הנגיפי לצינור מיקרו-צנטריפוגה והמשיכו לטיטר את הנגיף. התחל את הליך הטיטרציה על ידי הבטחת תאי DF1 היושבים ב-12 צלחות תרבית רקמות באר הגיעו למפגש של 30%. יש צורך בצלחת אחת של שתים עשרה בארות לכל קביעת טיטר נגיפי.

התחל דילול סדרתי פי עשרה של הסופרנטנטים הוויראליים על ידי ערבוב תחילה של חמישה מיקרוליטרים של סופרנטנט ויראלי עם 495 מיקרוליטר של מצע גידול בצינור מיקרוצנטריפוגה כדי ליצור דילול של עשר עד השני. מערבולת קצרה לכמה שניות. לאחר מכן העבירו 40 מיקרוליטר מהעשרה לדילול השני ל-360 מיקרוליטר של מדיום גידול בצינור מיקרו-צנטריפוגה לדילול העשרה עד השלישי.

מערבולת קצרה לכמה שניות. המשך בתהליך זה כדי לדלל לעשר לרביעי ולעשר לחמישי. לאחר מכן יש 2.25 מיליליטר של מצע גידול לכל אחד מחמישה צינורות פוליסטירן של שישה מיליליטר.

ותייגו אותם עשר לשישי, עשר לשביעי, עשר לשמיני, עשר לתשיעי ועשר לעשירי בהתאמה. מערבבים 0.25 מיליליטר מהדילול העשירי עד החמישי עם 2.25 מיליליטר של מדיום גידול בצינור הפוליסטירן של שישה מיליליטר לדילול העשר עד השישי. מערבולת קצרה לכמה שניות.

חזור על ההליך עבור עשר עד השביעי, עשר עד השמיני, עשר עד התשיעי ועשרה עד העשירי. לאחר מכן הסר את מדיום התרבות המקורי מתאי DF1 ב -12 לוחות הבאר. והוסף מיליליטר אחד של נגיף מדולל לכל באר בכפול.

אפשרו לתאים לגדול ב-37 מעלות צלזיוס ו-5 CO2 למשך שבעה ימים לפחות. התחל את הליך ההדבקה על ידי הרדמה ראשונה של עכבר RIP-Tag RIP-tva בן שבעה שבועות. יש למרוח חומר סיכה לעיניים על שתי העיניים כדי למנוע ייבוש בקרנית.

גלח את השיער מחלל החזה של עכבר RIP-Tag RIP-tva, מקם את העכבר על גבו כשהחזה פונה כלפי מעלה על נייר ספסל מעבדה סופג על גבי מחמם בטוח להתכרבל. בצע צביטה בבוהן כדי לבדוק אם החיה אינה מגיבה וכדי לאשר את אפקט ההרדמה המלאה. הארך את הגפיים הקדמיות ואבטח אותן בעזרת סרט.

סמן את חזהו של העכבר להזרקה. סמן את המיקום באמצע הדרך בין החריץ החזה לחלק העליון של תהליך ה-xiphoid, ומעט שמאלה מבחינה אנטומית של עצם החזה. לאחר מכן שפשפו את דופן החזה הקדמית עם קרצוף יוד פובידון או קרצוף כלורהקסידין, ואחריו 70% אלכוהול איזופרופיל או ספוג גזה ספוג אתנול 70%.

שאבו 50 מיקרוליטר אוויר למזרק אינסולין סטרילי בקוטר 28.5 כדי ליצור מרווח בין הבוכנה למניסקוס של מזרק 500 מיקרוליטר. ערכו 100 מיקרוליטר נגיף. המרחב האווירי ללא נוזל על הקיר הוא קריטי לראיית הדופק הלבבי.

שמור את המחט זקופה, החזק את עור העכבר מתוח ביד אחת והכנס את המחט למיקום המסומן. כאשר מופיע דופק דם אדום בוהק במזרק, הפסק לקדם את המחט וקבע את עומק המחט בעכבר ביד אחת. השתמש ביד השנייה כדי לדחוף בזהירות ובאטיות את הבוכנה כדי להעביר את התרחיף הנגיפי לאורך תקופה של כ-60 שניות.

יש לספק 10-20 מיקרוליטר בכל פעם שמופיע דופק דם אדום בוהק במזרק. הכניסה הרציפה של דם מחומצן אדום לרכזת המחט השקופה מעידה על מיקום נכון של המחט לחדר השמאלי. לאחר הדחיפה האחרונה של השלל כדי לספק תרחיף ויראלי ולפני שתראה את פעימת הדם האדומה הבאה, משוך במהירות את המחט החוצה מחלל החזה.

הפעל לחץ עדין על מקום ההזרקה למשך דקה אחת לפחות כדי להפחית את הדימום. לאחר מכן העבר בזהירות את העכבר על כרית חימום או מתחת למנורת חום עד שהוא בהכרה מלאה. עכברי RIP-Tag RIP-tva נדבקו בנגיף הרטרו RCASBP-Bcl-xL המצוין בגיל שבעה שבועות והורדמו בגיל 16 שבועות.

תצלום זה מציג צביעה מייצגת של סינפטופיזין של גידולים נוירואנדוקריניים גרורתיים בלבלב בבלוטות הלימפה בלבלב. כאן עכברי RIP-Tag RIP-tva נדבקו ב- RCASBP-RHAM B. תמונה זו מציגה את צביעת הסינפטופיזין המייצגת של גידולים נוירואנדוקריניים גרורתיים בלבלב בבלוטות הלימפה בלבלב. כאן נראה צביעת סינפטופיזין בכבד לאחר הזרקת נגיף RCASBP-RHAMM B.

חשוב לזכור שהכותרת של יותר מעשר עד שמונה יחידות זיהומיות למיליליטר נדרשת לזיהום in vivo של תאי TVA מתרבים בעכבר RIP-Tag RIP-tva ורקטור רטרו ויראלי RCASBP יכול לספק CDNA עד 2.5 קילובסיסים. לאחר פיתוח מודל עכבר זה, הוא סלל את הדרך לשינוי פרדיגמה שמצא כי BCL-xL למעשה מקדם גרורות סרטניות ללא תלות בתפקוד האנטי-אפופטוטי שלו.