ניתוח תפוקה גבוהה של התנהגות גינקולוגיות וזמינותו האי דרוזופילה

המטרה הכללית של בדיקת האי (Island Assay) היא להעריך התנהגות מוטורית בסיסית של *Drosophila melanogaster* באמצעות עיבוד נתונים אוטומטי וכימות אובייקטיבי. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לזהות רגולטורים מרכזיים של התנהגות מוטורית, כגון גנים המעורבים בהפרעות תנועה. כמו כן, ניתן להשתמש בה לבחינת תרופות שעשויות להביא לתיקון של פגמים אלו.

היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת כימות בסבירות גבוהה (high throughput) של התנהגות לוקומוטורית של Drosophila, מה שהופך טכניקה זו למתאימה לסריקות רחבות היקף. החלטנו לפתח מתודולוגיה זו כדי להיות מסוגלים לנתח מספר גדול של מודלים למחלות. היינו זקוקים לניתוח אוטומטי של נתוני תמונה כדי להפוך זאת לאפשרי.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא מועילה מאוד. מספר שלבים בעיבוד הבטא הם קריטיים, ועשויים להיות קשים עבור משתמשים חדשים, במיוחד עבור אלו שאינם מכירים את חבילות התוכנה שבשימוש. ראשית, הכינו מינימום של שלושה מבחנות עבור כל תנאי ניסויי כשחזרות ביולוגיות.

כל קובץ צריך להכיל כ-15 זבובים מאותו מין ובגיל דומה. חשוב שהזבובים יהיו בעלי כנפיים שלמות. צרו את התיקיות לאחסון הניסויים.

ייצרו אלו במבנה ספריות המוגדר על ידי התנאים והחזרות. אם, לדוגמה, בניסוי יש שני גנוטיפים עם חמש חזרות לכל אחד, צרו תיקייה ראשית עם תאריך הניסוי, ובתוך תיקייה זו, צרו תיקיית משנה לכל גנוטיפ. לאחר מכן, בתוך תיקיות הגנוטיפים, צרו תיקיות משנה עבור כל חזרה.

בשלב הבא, הגדירו את מכשיר הבדיקה. הוסיפו מים קרים עם כמות קטנה של סבון למגש הרחצה ומקמו את הפלטפורמה במרכז האמבטיה, אם היא עדיין לא מקובעת בה. כסו את המגש ואת הפלטפורמה בקופסה שקופה.

כדי להאיר את הפלטפורמה, מקם מעליה נורה קרה, כגון נורות LED רגילות של 12 וולט. מקם גם מצלמת רשת המחוברת למחשב ישירות מעל הפלטפורמה. במחשב, פתח את תוכנת הקלטת התמונות.

ממערכת התפריטים, בחרו במצלמת הרשת המתאימה כהתקן הלכידה. הניחו זבוב מת על משטח העבודה כדי לכוון את הגדרות הווידאו. כווןו את הבהירות, הניגודיות והצבע בתוכנה כך שהזבוב המת ייראה שחור על רקע לבן.

בשלב הבא, התאימו את הגדרות סרט ה-time lapse כך שהסרטים יישמרו כקבצי AVI. לאחר מכן, דפדפו לספריה שבה יש לשמור את הנתונים והגדירו את שם הסרט. שמרו שינויים אלה.

לצורך דחיסת נתוני התמונה, בחרו בקוד Intel IYUV. הגדירו את מהירות ההקלטה לפרימה אחת בכל 0.1 שניות והתאימו את קצב ההשמעה המתאים ל-10 תמונות לשנייה. לבסוף, עברו להגדרות המתקדמות ובחרו באפשרות Create a bmp image for each captured frame.

לאחר מכן, דפדפו לספריה שבה בחרתם לאחסן את קובצי ה-AVI ולחצו על אישור. לפני התחלת הפעולה, ודאו שהאי הוא ריק ונקי. לאחר מכן, התחילו את ההקלטה בממשק צילומי ה-time lapse של תוכנת הקלטת התמונות.

קחו מבחנה המכילה זבובים והקישו עליה שתיים או שלוש פעמים כדי להפיל את כל הזבובים לתחתית. לאחר מכן, הסירו במהירות את הפקק מהמבחנה והקישו בעוצמה את הזבובים על הפלטפורמה. כולם צריכים להגיע לפלטפורמה בערך באותו הזמן.

המתינו עד 30 שניות עד שהזבובים יעזבו את הפלטפורמה, ולאחר מכן הפסיקו את ההקלטה. במידת הצורך, הסירו ידנית את הזבובים שנותרו על הפלטפורמה. לפני המעבר לניסוי הבא, ודאו כי הגדרתם מחדש את הספריה שבה יישמר סט הנתונים הבא.

המשימה הראשונה היא להפיק ערימות (stacks) והשלכות (projections) של סדרת התמונות שנאספה. בתוכנת Fiji, פתחו את ה-Drosophila Island Assay. בחלון החדש, הזינו את המזהה של סדרת התמונות הראשונה.

בשלב הבא, בחרו רק את תת-המאקרו ליצירת ערימה והקרנה (create stack and projection). לחצו על אישור, והפנו את המחשב לתיקייה המכילה את כל תתי-התיקיות עם ניסויי ה-Island Assay הבודדים. לאחר עיבוד הנתונים, יופיעו שני קבצים חדשים בכל תת-תיקייה ניסויית בודדת.

המשימה הבאה היא להגדיר את המיקום המדויק של הפלטפורמה בתמונות. פתח את הממשק הגרפי ובחר בתיבת הסימון להגדרת פלטפורמה (define platform). לאחר מכן, בחר את הספריה שבה מאוחסנות תיקיות המשנה של הניסוי.

תמונת ההקרנה ושני חלונות ייפתחו. בתמונה הראשונה, שרטט פוליגון מעל רציף האי באמצעות כלי בחירת הפוליגון. אין לכלול בבחירה זו את קו הגבול בפרימטר של הרציף.

הוסיפו את הבחירה לחלון מנהל ה-ROI על ידי לחיצה על add בחלון מנהל ה-ROI. לאחר הוספת הבחירה למנהל ה-ROI, היא תופיע כסט של ערכים. לאחר מכן, לחצו על okay בחלון define the platform.

התוכנה תעבור לתמונת ההיטל הבאה השמורה בתיקייה. המשיכו להחיל את אותו ROI עבור הפלטפורמה על תמונת ההיטל הבאה על ידי בחירת ה-ROI השמור במנהל ה-ROI ואישור ROI זה בחלון הגדרת הפלטפורמה. לפני המעבר לתמונת ההיטל הבאה, ודאו שהפלטפורמה לא זזה במהלך הניסוי.

אם מיקום הפלטפורמה השתנה, לחצו לחיצה שמאלית במרכז הבחירה וגררו אותה למיקום הנדרש. אם תיבת הבחירה אינה תואמת לפלטפורמה, לחצו לחיצה שמאלית מחוץ לבחירה והגדירו בחירה חדשה עבור הפלטפורמה באמצעות כלי הפוליגון. הוסיפו בחירה חדשה זו למנהל ה-ROI.

לאחר מכן, אששו את הבחירה החדשה על ידי לחיצה על אישור בחלון הגדרת הפלטפורמה (define platform), והמשיכו בפרוצדורה עד שכל התמונות יכללו פלטפורמות שהוגדרו כראוי. המשימה האחרונה לפני עיבוד הנתונים היא הגדרת הגודל המינימלי עבור זבוב. דבר זה מוסבר בפרוטוקול הכתוב.

כדי לכמת את הזבובים הבורחים מהפלטפורמה, ראשית, הגדירו את גודל הזבוב המינימלי. לאחר מכן, ציינו את מספר הזבובים המקסימלי בקובץ בתוך הסדרה הניסויית. הפעילו את פונקציית הניתוח (analyze), ובעקבות ההנחיה, בחרו את הספרייה הראשית של הניסוי.

לאחר הרצת המאקרו, שימו לב שקובץ תוצאות חדש ומערכת תמונות (image stack) חדשה הופיעו בכל תיקייה. פתחו קבצים אלו כדי לוודא שהפרוצדורה בוצעה כהלכה. הפעילו את חבילת התוכנה R או RStudio ופתחו את סקריפט הניתוח של ה-Island Assay כדי לעבד את כל הניסויים בו-זמנית.

יש לערוך את הסקריפט בצורה נכונה כדי שהניתוח יצליח. בשורה 16 של הסקריפט, הכניסו את הנתיב לספרייה הראשית המכילה את הניסויים המיועדים לניתוח. בשורה 19, הכניסו את הנתיב לתיקייה שבה יש לשמור את קבצי פלט הניתוח.

המיקום האחרון חייב להיות שונה מהספריה המכילה את נתוני התמונה המיועדים לניתוח. כעת, הפעילו את הסקריפט מסרגל הכלים והמשיכו בניתוח התוצאות. ניתוח הסקריפט Island Assay מייצא גרף קווי עבור כל תנאי ניסוי.

הגרף מציג את אחוז הזבובים שנותרו על הפלטפורמה לאורך זמן עבור כל חזרה של אותו תנאי. גרף הקווים המיוצא, escape response:all conditions, מסכם את הממוצע ואת השגיאה הסטנדרטית של הממוצע (SEM) של תגובת בריחת הטיסה עבור 12 התנאים הניסיוניים הראשונים המופיעים בתיקייה הראשית. השטח תחת העקומה עבור כל חזרה ניסיונית מחושב כדי לקבוע האם התנאים הניסיוניים שונים זה מזה באופן מובהק.

השטח תחת העקומה והערך החציוני עבור כל תנאי ניסוי מיוצאים כגרף. בהתאם למספר התנאים הקיימים בתיקייה הראשית, הסקריפט יבצע מבחן Welch T-test דו-זנבי ללא התאמה עבור שני תנאים, או ANOVA עם תיקון Tukey עבור יותר משני תנאים. כל הנתונים המספריים שחושבו על ידי ניתוח Island Assay של הסקריפט מיוצאים ונשמרים גם הם כקבצי csv או txt בתיקיית פלט הנתונים.

אטקסיה טלנגיקטזיה (Ataxia telangiectasia) היא הפרעת תנועה תורשתית רצסיבית אוטוסומלית הנגרמת כתוצאה ממוטציות בגן ATM. המחלה מאופיינת בהופעה מוקדמת של אטקסיה צריבלית (cerebellar ataxia). השפעת השתקת גלובלית (ubiquitous knockdown) של האורתולוג של ATM בזבוב נבחנה באמצעות בדיקת האי (Island Assay) ונשוות לבקרות.

בסיכומו של דבר, השתקה נרחבת של Tefu, ההומולוג של ATM בזבובים, הפחיתה באופן משמעותי את ביצועי התנועה בבדיקת האי (Island Assay) בהשוואה לבקרי הרקע הגנטי. ניתוח ידני של נתוני בדיקת האי שהוקלטו הניב את אותה תוצאה כמו הניתוח האוטומטי. לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לכם הבנה טובה כיצד לבצע את בדיקת האי, כיצד להריץ את המאקרו של בדיקת האי ב-Drosophila, וכיצד להפעיל את הסקריפט לניתוח בדיקת האי.

בעת ביצוע פרוטוקול זה, חשוב לזכור כי איכות סגמנטציית התמונהה קשורה לאיכות הסרטונים. ככל שהניגודיות (contrast) גבוהה יותר, כך הניתוח יהיה חלק יותר. לאחר פיתוחה, טכניקה זו מסללת את הדרך עבור חוקרים לבחון יכולת תנועה ב-Drosophila בתפזורת גבוהה (high throughput).

לאחר שימוש במערך בדיקה זה, ניתן להשתמש בבדיקות אחרות, כגון בדיקות של גיאוטקסיס שלילי, כדי לחקור לעומק פגמים במכשור התנועה.