Name: אינדוקציה ואבחון של גידולים ב תסיסנית אפיתלציה דיסק Imaginalia (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: חקור שיטה לאינדוקציה ואבחון של גידולים בדיסקים אימגינליים של Drosophila באמצעות מערכת GAL4-UAS. פרוטוקול זה מאפשר סיווג של שלבי התפתחות הגידול ומספק מודל אמין למחקר סרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לג &#39;ואוגן על קריאה ביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ JSPS KAKENHI מענק מספרים 26891025, 15H01500 ו Takeda מדע הקרן מענק מחקר YT

1. לטוס צלבים ואינדוקציה משובטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל הזבובים בבקבוקון 12 שעות לפני איסוף זבובים בתולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את הזבובים בבקבוקון על ידי הזרקת גז CO 2 ומקום עף על גבי כרית זבוב CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 10 - 20 נשים בתולה ו -10 גברים מן CO 2 לטוס כרית לתוך בקבוקון טרי דגירה ליום 1 ב 25 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת זבובים אלה לתוך בקבוקון טרי דגירה במשך 12 שעות ב 25 ° C. הערה: להשליך את הבקבוקון הראשון כמו נקבות בתולה לא להניח מספיק ביצים ביום הראשון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור משפר- GAL4 שורות, להסיר את הזבובים למבוגרים דגירה בקבוקון על 25 מעלות צלזיוס עד לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור אינדוקציה של שיבוטים פסיפס על ידי להעיף החוצה- GAL4, להסיר את הזבובים המבוגרים דגירה בקבוקון עבור 2 - 4 ימים על 25 מעלות צלזיוס. זמן דגירה לפני הלם חום תלויה המטרה הניסויית. הלם חום 2 ימים לאחר הביצה בתצהיר (א.ד.) מייצר שיבוטי פסיפס בשנייה לא בוגר- אפיתיל דמיוני. הלם חום לאחר 3 או 4 ימים א.ד. מייצר שיבוטים פסיפס ב מובחן מוקדם עד אמצע השלישי epithelia הדמיון. הערה: חשוב לבחון את ההשפעה של תזמון חום שהשתנה על פנוטיפים טומוריגניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור אינדוקציה של שיבוטים פסיפס על ידי להעיף החוצה- GAL4, הלם חום הבקבוקון על ידי טבילה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 10 - 45 דקות ואחריו הדגירה של 2-3 ימים על 25 מעלות צלזיוס. הערה: מידע על זמן הזעזוע החום, העיתוי וזמן הדגירה בכל ניסוי מוצג באיור האגדות. </li></ol> 2. דיסקציה של הזחלים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף נודדים instar השלישי עם מקל עץ או מלקחיים קהה, גנוטיפ אותם על ידי סמנים ניאון המתאים ( למשל , EGFP) תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי פלואורסצנטי ומניחים אותם צלחת לנתיחה עם PBS (פוספט שנאגרו מלוחים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הזחלים PBS ידי pipetting עם 2 מ&quot;ל pipettes העברת פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">צבוט את מרכז הזחל עם מלקחיים אחת ולקרוע את הגוף לשניים עם מלקחיים אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קמצוץ את הפה של החצי הקדמי עם מלקחיים אחד לדחוף את הפה לכיוון הגוף עם מלקחיים אחרים כדי להפוך את הגוף פנימה החוצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חומרים מיותרים כגון בלוטות הרוק או גופים שומן עם מלקחיים. </li></ol> 3. קיבוע נוגדן מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את החלק הקדמי גזור של הגוף הזחל (כולל דיסקים כנפיים דמיוני) כדי צינור פלסטיק 1.5 מ&quot;ל לתקן 1 מ&quot;ל של פתרון תקן (פורמלדהיד 4% ב PBS) במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך עם סיבוב עדין. זהירות: פורמלדהיד הוא רעיל ויש לו פוטנציאל מסרטן. ללבוש כפפות מגן ובגדים כדי למנוע מגע עם העור. הערה: בחלק זה, כל השלבים מתרחשים על נוטאטור בטמפרטורת החדר בחושך, אלא אם צוין אחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון תקן וזורקים. לשטוף את הרקמות עם 1 מ&quot;ל של PBT (0.3% Tritב X-100 ב PBS) שלוש פעמים במשך 15 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את PBT ולהוסיף 1 מ&quot;ל של PBTG (0.2% אלבומין בסרום שור 5% בסרום עירום נורמלי PBT) לחסימת ו nutate 1 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBTG ולהוסיף פתרון נוגדן ראשוני בדילול נאות עם PBTG (ראה טבלה חומרים ) ו nutate לילה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון נוגדן ראשוני לשטוף את הרקמות עם 1 מ&quot;ל PBT שלוש פעמים במשך 15 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBT ולהוסיף פתרון נוגדנים משני כראוי בדילול מלא עם PBTG (1: 400). Nutate עבור 2 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון נוגדנים משני לשטוף את הרקמות עם 1 מ&quot;ל של PBT פעמיים במשך 15 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי הכתם F- אקטין, להסיר PBT ולהוסיף פתרון Phalloidin בדילול נאותה PBS (1:40). ואז nutate במשך 20 דקות. הסר את הפתרון Phalloidin לשטוף את הרקמות עם 1 מ&quot;ל של PBT פעמיים במשך 15 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להדוף DNA גרעיני, להסיר PBT ולהוסיף DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole) פתרון (0.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של DAPI ב PBS). ואז nutate 10 דקות. זהירות: DAPI יש פוטנציאל מסרטן. ללבוש כפפות מגן ובגדים כדי למנוע מגע עם העור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון DAPI לשטוף את הרקמות עם 1 מ&quot;ל של PBT פעמיים במשך 15 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף פעם 1 מ&quot;ל של PBS במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS ולהוסיף 500 μL של גליצרול 100% כמו המדיום מראש הרכבה. </li></ol> 4. הרכבה על גבי שקופיות מיקרוסקופ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הרקמות המוכתמות בשקופית מיקרוסקופ באמצעות פיפטה העברת פלסטיק 2 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הרקמות טיפות של המדיום גובר על שקופית מיקרוסקופ אחר עם מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את קצה הרקמה גזור עם מלקחיים אחת ולמשוך משם דיסקים antennal העין עם מלקחיים אחרים. הערה: לשמור על המוח גזור למקום אותם ליד הדיסק דימיון כנף. המוח לפעול כפלטפורמה המונעת את coverslip מ מוחצת את האגף דיסקים דמיוניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבודד את הדיסק כנפיים הדימיון להחזיק בקצה של רקמה גזור עם מלקחיים אחד בעדינות לגרד את קיר הגוף ולקרוע את הדיסקים עם מלקחיים אחרים. הערה: אם קשה למצוא דיסקיות דימויים כנפיים, לקלף את קנה הנשימה מן האחורי אל הצד הקדמי. כנפיים דיגיטליות כנפיים מקל על קנה הנשימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לכסות את הדיסקים הדמיוניים עם coverslip וחותמת עם לק. חנות ב 4 ° C. </li></ol> 5. מיקרוסקופיה confocal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לרכוש תמונות confocal באמצעות מיקרוסקופ confocal להגדיר תמונה פרמטרים הרכישה כולל טווח של גל פליטה, עוצמת לייזר, רווח, היסט, מהירות סריקה גודל התמונה 24 . הערה: לקבלת הליך מפורט של הגדרות רכישת תמונות, עיין במדריך ההוראות המצורף על ידי כל יצרן מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ללכוד שיתוף יחידקטעים nfocal של דיסק שלם אגף כולו, להשתמש בעדשה אובייקטיבית 20X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש 3-ממדי תמונות על ידי Z- מחסנית סריקה בגודל צעד של 0.5 - 1.0 מיקרומטר באמצעות עדשות 40X או 60X. הערה: כדי לנתח פנוטיפים סלולריים ברזולוציה גבוהה, גודל התמונה צריך להיות גדול מ 512 x 512 פיקסלים. </li></ol> 6. ניתוח תמונה באמצעות ImageJ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיג &#39;י, קוד פתוח ImageJ התוכנה התמקדה ביולוגי ניתוח התמונה (https://fiji.sc/) 25 , לרכוש ולנתח confocal z- מחסנית תמונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לרכוש חלקים אנכיים, לפתוח את z- ערימת תמונות ImageJ ובחר פריט בתפריט &quot;תמונה / ערימות / Reslice.&quot; הערה: ניתן לבחור בציר XZ או בציר YZ בתפריט Reslice. סעיף אנכי ניתן להשיג גם בכיוון שרירותי על ידי ציור קו ישר או מלבן על התמונה z- מחסנית. </li></ol> 7. אבחון פנוטיפים ניאופלסטיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את האנכימקטעים (XZ או ציר YZ) המתקבל קבוצה אחת של z- מחסנית תמונות ולנתח פנוטיפים מורפולוגיים מכתים נוגדן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור אבחון של פנוטיפים הגידול, בעיקר להתמקד בשלוש נקודות הבאות: (1) אם מסה התא, כולל שיבוטים מציאה, סוטה מן השכבה אפיתל הראשי, (2) אם לוקליזציה subcellular של חלבונים jnctional משתנה מסה זו התא , ו (3) אם הקוטר של מסת התא הזה הוא גדול מ 4 תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיווג פנוטיפים הגידול לפי תרשים זרימה המתואר בתרשים 1 . </li></ol>

<ol><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10647931">The hallmarks of cancer.</a> Cell. 100 (1), 57-70 (2000).</li>
<li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).</li>
<li>Struhl, G., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organizing+activity+of+wingless+protein+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organizing activity of wingless protein in Drosophila.</a> Cell. 72 (4), 527-540 (1993).</li>
<li>Potter, C. J., Turenchalk, G. S., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+in+cancer+research.+An+expanding+role%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophila in cancer research. An expanding role.</a> Trends Genet. 16 (1), 33-39 (2000).</li>
<li>Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tumor+invasion+and+metastasis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila.</a> Dis Model Mech. 4 (6), 753-761 (2011).</li>
<li>Tipping, M., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+model+for+context-dependent+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a model for context-dependent tumorigenesis.</a> J Cell Physiol. 229 (1), 27-33 (2013).</li>
<li>Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+polarity+and+proliferation+control%3A+links+from+the+Drosophila+neoplastic+tumor+suppressors%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Epithelial polarity and proliferation control: links from the Drosophila neoplastic tumor suppressors.</a> Genes Dev. 18 (16), 1909-1925 (2004).</li>
<li>Humbert, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+tumourigenesis+by+the+Scribble%2FDlg%2FLgl+polarity+module%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Control of tumourigenesis by the Scribble/Dlg/Lgl polarity module.</a> Oncogene. 27 (55), 6888-6907 (2008).</li>
<li>Huang, L., Muthuswamy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarity+protein+alterations+in+carcinoma%3A+a+focus+on+emerging+roles+for+polarity+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Polarity protein alterations in carcinoma: a focus on emerging roles for polarity regulators.</a> Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 41-50 (2010).</li>
<li>Brumby, A. M., Richardson, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((scribble+mutants+cooperate+with+oncogenic+Ras+or+Notch+to+cause+neoplastic+overgrowth+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">scribble mutants cooperate with oncogenic Ras or Notch to cause neoplastic overgrowth in Drosophila.</a> EMBO J. 22 (21), 5769-5779 (2003).</li>
<li>Igaki, T., Pastor-Pareja, J. C., Aonuma, H., Miura, M., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+tumor+suppression+and+epithelial+maintenance+by+endocytic+activation+of+Eiger%2FTNF+signaling+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Intrinsic tumor suppression and epithelial maintenance by endocytic activation of Eiger/TNF signaling in Drosophila.</a> Dev Cell. 16 (3), 458-465 (2009).</li>
<li>Tamori, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+Lgl+and+Mahjong%2FVprBP+in+cell+competition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Involvement of Lgl and Mahjong/VprBP in cell competition.</a> PLoS Biol. 8 (7), e1000422(2010).</li>
<li>Cordero, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+Ras+diverts+a+host+TNF+tumor+suppressor+activity+into+tumor+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Oncogenic Ras diverts a host TNF tumor suppressor activity into tumor promoter.</a> Dev Cell. 18 (6), 999-1011 (2010).</li>
<li>Yamamoto, M., Ohsawa, S., Kunimasa, K., Igaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ligand+Sas+and+its+receptor+PTP10D+drive+tumour-suppressive+cell+competition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ligand Sas and its receptor PTP10D drive tumour-suppressive cell competition.</a> Nature. 542 (7640), 246-250 (2017).</li>
<li>Vaughen, J., Igaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slit-Robo+Repulsive+Signaling+Extrudes+Tumorigenic+Cells+from+Epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Slit-Robo Repulsive Signaling Extrudes Tumorigenic Cells from Epithelia.</a> Dev Cell. 39 (6), 683-695 (2016).</li>
<li>Tamori, Y., Suzuki, E., Deng, W. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+Tumors+Originate+in+Tumor+Hotspots%2C+a+Tissue-Intrinsic+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Epithelial Tumors Originate in Tumor Hotspots, a Tissue-Intrinsic Microenvironment.</a> PLoS Biol. 14 (9), e1002537(2016).</li>
<li>Ohsawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+oncogenic+neighbors+by+JNK-mediated+engulfment+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Elimination of oncogenic neighbors by JNK-mediated engulfment in Drosophila.</a> Dev Cell. 20 (3), 315-328 (2011).</li>
<li>Menéndez, J., Pérez-Garijo, A., Calleja, M., Morata, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tumor-suppressing+mechanism+in+Drosophila+involving+cell+competition+and+the+Hippo+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A tumor-suppressing mechanism in Drosophila involving cell competition and the Hippo pathway.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14651-14656 (2010).</li>
<li>Hogan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+interface+between+normal+and+transformed+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the interface between normal and transformed epithelial cells.</a> Nat Cell Biol. 11 (4), 460-467 (2009).</li>
<li>Kajita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+with+surrounding+normal+epithelial+cells+influences+signalling+pathways+and+behaviour+of+Src-transformed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Interaction with surrounding normal epithelial cells influences signalling pathways and behaviour of Src-transformed cells.</a> J Cell Sci. 123 (Pt 2), 171-180 (2010).</li>
<li>Norman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Scribble+causes+cell+competition+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Loss of Scribble causes cell competition in mammalian cells.</a> J Cell Sci. 125 (1), 59-66 (2012).</li>
<li>Wagstaff, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+cell+competition+kills+cells+via+induction+of+lethal+p53+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mechanical cell competition kills cells via induction of lethal p53 levels.</a> Nat Commun. 7, 1-14 (2016).</li>
<li>Kajita, M., Fujita, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EDAC%3A+Epithelial+defence+against+cancer-cell+competition+between+normal+and+transformed+epithelial+cells+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">EDAC: Epithelial defence against cancer-cell competition between normal and transformed epithelial cells in mammals.</a> J Biochem. 158 (1), 15-23 (2015).</li>
<li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+is+believing%3F+A+beginners%27+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Jory, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+6%2C300+genomic+fragments+for+cis-regulatory+activity+in+the+imaginal+discs+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A survey of 6,300 genomic fragments for cis-regulatory activity in the imaginal discs of Drosophila melanogaster.</a> Cell Rep. 2 (4), 1014-1024 (2012).</li>
<li>McGuire, S. E., Le, P. T., Osborn, A. J., Matsumoto, K., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+rescue+of+memory+dysfunction+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal rescue of memory dysfunction in Drosophila.</a> Science. 302 (5651), 1765-1768 (2003).</li>
<li>Rodrigues, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+STAT+regulates+growth+and+induces+competitive+interactions+independently+of+Myc%2C+Yorkie%2C+Wingless+and+ribosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Activated STAT regulates growth and induces competitive interactions independently of Myc, Yorkie, Wingless and ribosome biogenesis.</a> Development. 139 (21), 4051-4061 (2012).</li>
<li>Khan, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+neoplasia+in+Drosophila+entails+switch+to+primitive+cell+states%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Epithelial neoplasia in Drosophila entails switch to primitive cell states.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), E2163-E2172 (2013).</li>
<li>Pagliarini, R. A., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+in+Drosophila+for+metastatic+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior.</a> Science. 302 (5648), 1227-1231 (2003).</li>
<li>Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster%3A+a+model+and+a+tool+to+investigate+malignancy+and+identify+new+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster: a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics.</a> Nat Rev Cancer. 13 (3), 172-183 (2013).</li>
<li>Patel, P. H., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+design%3A+how+Drosophila+tumors+remodel+their+neighborhood%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Tissue design: how Drosophila tumors remodel their neighborhood.</a> Semin Cell Dev Biol. 28, 86-95 (2014).</li>
<li>Nakajima, Y. -I., Meyer, E. J., Kroesen, A., McKinney, S. A., Gibson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+junctions+maintain+tissue+architecture+by+directing+planar+spindle+orientation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epithelial junctions maintain tissue architecture by directing planar spindle orientation.</a> Nature. 500 (7462), 359-362 (2013).</li>
<li>Colombani, J., Andersen, D. S., Léopold, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+peptide+Dilp8+coordinates+Drosophila+tissue+growth+with+developmental+timing%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Secreted peptide Dilp8 coordinates Drosophila tissue growth with developmental timing.</a> Science. 336 (6081), 582-585 (2012).</li>
<li>Garelli, A., Gontijo, A. M., Miguela, V., Caparros, E., Dominguez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaginal+discs+secrete+insulin-like+peptide+8+to+mediate+plasticity+of+growth+and+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaginal discs secrete insulin-like peptide 8 to mediate plasticity of growth and maturation.</a> Science. 336 (6081), 579-582 (2012).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

מערכת GAL4-UAS הוא אחד הכלים הגנטיים החזקים ביותר עבור ביטוי גנים ממוקד תסיסנית 26 ומאפשר מאוד אינדוקציה תא הגידול וניתוח ב vivo 4 . מערכת זו מאפשרת את הדור של שיבוטים נושאת מציאה של גנים מדכאי גידול או overexpression של אונקוגנים בתוך רקמת אפיתל wild-type, מצב דומה מאוד בשלבים הראשונים של סרטן האדם שבו תאים פרו תאים סרטניים מוקפים בתאי אפיתל נורמלי. GAL4 קווי הנהג מוסדר על ידי רצפים משפר כגון GAL4 משפר קווי מלכודת ...

רקמות אפיתל הן מערכות מאורגנות מאוד, כי יש יכולת הומיאוסטית יוצאת דופן לשמור על הארגון שלהם באמצעות פיתוח מחזור התא. מערכת זו עצמית מאורגנת, עם זאת, הוא שיבשו בהדרגה במהלך התפתחות הגידול. בתחילת התפתחות הגידול, תאים מוטציה בודדים הנובעים הפעלה אונקוגן או גידולים סרטניים inactivation להתגלות בתוך שכבת אפיתל. כאשר זה השתנה &quot;Pro-הגידול התא&quot; מתחמק בסביבה מדכאת, משבש ארגון אפיתל, ומתחיל התפשטות בלתי מבוקרת, tumorigenesis מתרחשת 1 . במהלך העשורים האחרונים, התקדמות טכנולוגית יוצאת דופן בגנטיקה וביולוגיה מולקולרית עשו התקדמות מדהימה על מחקר הסרטן. במיוחד, מחקרים שנעשו לאחרונה באמצעות כלי ניתוח פסיפס גנטית ב תסיסנית melanogaster , כגון FLP-FRT (flippase recombinase / flippase recombinase היעד) recombin מיטוטיAtion 2 ו flip-out-GAL4-UAS (במעלה מפעיל רצף) מערכות 3 , תרמו רבות להבנה טובה יותר של המנגנונים הגנטיים המעורבים היווצרות גרורות של גידולים 4 , 5 , 6 . מחקרים של קבוצת גני תסיסנית גידול משתיק משומרים, זחלי ענק קטלניים (LGL), דיסקים גדולים (dlg), ולקשקש (scrib), הדגישו את הקשר הקריטי בין הפסד של ארגון אפיתל התפתחות גידולים, כמו גנים אלה ממלאים תפקידים מרכזיים ב ויסות קוטביות תא אפית, ותאי תאים ברקמות אפיתל 7 . בעוד שדיסקופיית הדיסקופיליה היא בדרך כלל אפיתיל מונוליר, מוטציות הומוזיגיות בכל אחד משלושת הגנים האלה גורמים לתאים לאבד מבנה וקוטביות,לשכור, overproliferate, ובסופו של דבר להרכיב multorayered המוני אמורפיים כי הפתיל עם רקמות סמוכות 7 . כמו כן, הפרעה של גנים אלה יונקים מעורב בפיתוח של גידולים ממאירים 8 , 9 . הפנוטיפים הניאופלסטיים המוצגים על ידי הרקמות המוטנטיות הובילו לסיווגם של שלושה גנים אלה כגנים משמרים, נויפלסטיים, מדכאי גידולים (nTSG) 7 , 8 . עם זאת, כאשר תאים הומוזיגיים nTSG מוטציה הם שנוצר באופן ספורדי בפיתוח wild-type דימויים דמיוניים באמצעות רקומבינציה מיטבית FLP-FRT בתיווך, תאים מוטציה מסולקות מן הרקמה דרך אפקטוזיס C- יוני K- מסוף (JNK), אפופטוזיס תלויים 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , שחול 15 , 16 , או engulfment ו phagocytosis על ידי השכנים 17 . ב אפיתל זה מוזאיקה גנטית, אפופטוזיס הוא זוהה בעיקר בתאי מוטציה nTSG הממוקם בגבול שיבוט, דבר המצביע על כך תאים נורמליים סמוכים מפעילה אפופטוזיס של תאים nTSG מוטציה 10 , 11 , 12 , 18 . מחקרים שנערכו לאחרונה בתאי יונקים אישרו כי חיסונים אלה התומכים בתאי גזע של תאים פרו-סרטניים הם מנגנון הגנה עצמית אפיתלי משומר מבחינה אבולוציונית נגד סרטן 19 , 20 , 21 , 22 , 23 . מחקר שנערך לאחרונה תסיסנית דיסקים דמיוניים, לעומת זאת, הראה כי פסיפס nTSG-knockdown שיבוט גורם גידולים ניאופלסטיים specifאיזורים של כנפיים דימויים דימויים 16 . היווצרות ראשונית של הגידול נמצאה תמיד באזור &quot;ציר&quot; הפריפריאלי ולא נצפתה באזור המרכזי של &quot;שקיק&quot; של אפיתל הדיסק של האגף, דבר המצביע על כך שהפוטנציאל הטומוריגני של תאי NTSG-knockdown תלוי בסביבה המקומית. אזור שקיק מרכזי פונקציות כמו &quot;coldspot הגידול&quot; שבו תאים Pro הגידול אינם מראים overgroastic דיספלסטי, ואילו באזור ציר ההיקפי מתנהג כמו &quot;נקודה חמה&quot; 16 . ב &quot;coldspot&quot; אזורים שקיק, תאים nTSG-knockdown delaminate מן הצד הבסיסי ועוברים אפופטוזיס. לעומת זאת, כמו &quot;נקודה חמה&quot; תאים הציר להחזיק רשת של מבנים cytoskeletal חזקים על הצדדים הבסיסיים שלהם, תאים nTSG-knockdown delaminate מן הצד האפי של אפיתל וליזום צמיחת יתר של טומוריגנית 16 . לכן, ניתוח של פנוטיפים הגידול בדיסקים דמיוניים דורש consi זהירשל רגישות ספציפית לאזור לגירויים טומוריגניים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול כדי לעורר היווצרות הגידול neoplastic בתקליטורים כנף תסיסנית הדיסק באמצעות מערכת GAL4-UAS- RNAi שבו תאים nTSG-knockdown נוצרים epithelia דיסק epaghelia רגיל. למרות אלו מערכות ניסיוניות שימושיים ללמוד את השלבים המוקדמים של סרטן, שיטה סיווג ברור להעריך את השלבים של התקדמות הגידול ב epithelia דיסק דמיוני לא תוארה בבירור לפני. לכן, אנו מציעים גם שיטת אבחון לסווג פנוטיפים המשובטים הגידול המושרה epithelia דיסק האגף לשלוש קטגוריות: hyperplasia (הצטברות של מספר מופרז של תאים מופיעים נורמלי עם התפשטות מוגברת), דיספלסיה (רקמה prealignant מורכב להופיע באופן חריג תאים), ו neoplasia (גידול שפיר או ממאיר המורכב של תאים בעלי מראה חריג דפוס התפשטות לא נורמלי).

<table><tbody><tr><td><חזק>ריאגנטים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מי מלח פוספט (PBS)</td><td>Wako</td><td>162-19321</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Wako</td><td>168-11805</td><td></td></tr><tr><td>פורמלדהיד</td><td>Wako</td><td>064-00406</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>סיגמא</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>סרום עיזים רגיל</td><td>סיגמא</td><td>G6767</td><td></td></tr><tr><td>מדיום הרכבה, Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>עכבר-אנטי-Dlg 4F3</td><td>מחקרים התפתחותיים Hybridoma Bank</td><td>4F3 anti-discs גדול, RRID:AB_528203</td><td>לדלל ב-PBTG, 1:40</td></tr><tr><td>עכבר-anti-MMP1</td><td>מחקרים התפתחותיים Hybridoma Bank</td><td>3A6B4, RRID:AB_579780</td><td>3 מעורב 1:1:1 ולדלל ב-PBTG, 1:40</td></tr><tr><td>עכבר-אנטי-MMP1</td><td>מחקרים התפתחותיים Hybridoma Bank</td><td>3B8D12, RRID:AB_579781</td><td>3 מעורב 1:1:1 ודילול ב-PBTG, 1:40</td></tr><tr><td>עכבר-אנטי-MMP1</td><td>מחקרים התפתחותיים Hybridoma Bank</td><td>5H7B11, RRID:AB_579779</td><td>3 מעורב 1:1:1 ודילול ב-PBTG, 1:40</td></tr><tr><td>mouse-anti-atubulin</td><td>Developmental מחקרים Hybridoma Bank</td><td>AA4.3, RRID:AB_579793</td><td>לדלל ב-PBTG, 1:100</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 Phalloidin</td><td>Molecular בדיקות</td><td>A22283</td><td>מדוללות ב-PBS, 1:40</td></tr><tr><td>נוגדן IgG נגד עכברים עזים, Alexa Fluor 546</td><td>בדיקות מולקולריות</td><td>A11030</td><td>מדוללות ב-PBTG, 1:400</td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק</td><td>><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td>Comments</td></tr><tr><td>Fly זנים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sd-Gal4</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#8609</td><td>משולב מחדש עם UAS-EGFP</td></tr><tr><td>upd-Gal4</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#26796</td><td>משולב מחדש עם UAS-EGFP</td></tr><tr><td>UAS-lgl-RNAi</td><td>Vienna Drosophila RNAi center</td><td>#51247</td><td></td></tr><tr><td>UAS-scrib-RNAi</td><td>Vienna Drosophila RNAi center</td><td>#105412</td><td></td></tr><tr><td>UAS-RasV12</td><td>מרכז המניות בלומינגטון דרוזופילה</td><td>#64196</td><td></td></tr><tr><td>UAS-Yki3SAמרכז</td> <td>המניות בלומינגטון דרוזופילה</td><td>#28817</td><td></td></tr><tr><td>hsFLP</td><td>מרכז המניות בלומינגטון דרוזופילה</td><td>#6</td><td></td></tr><tr><td>Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4)</td><td>בלומינגטון דרוזופילה Stock Center</td><td>#4780</td><td>משולב מחדש עם UAS-EGFP</td></tr><tr><td>UAS-EGFP</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#5428</td><td>X chromosome</td></tr><tr><td>UAS-EGFP</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#6658</td><td>third chromosome</td></tr><tr><td>UAS-Dicer2</td><td>Bloomington מרכז מניות דרוזופילה</td> <td>#24650</td><td>כרומוזום שני</td></tr><tr><td>UAS-Dicer2</td><td>מרכז מניות בלומינגטון דרוזופילה</td> <td>#24651</td><td>כרומוזום שלישי</td></tr><tr><td>vkg-GFP</td><td>Morin et al. 2001</td><td></td><td>מלכודת חלבון GFP</td></tr></tbody></table>

אינדוקציה ואבחון של גידולים ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; אפיתלציה דיסק imaginalia

Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia

בשלבים המוקדמים של הסרטן, תאים מוטנטיים שהשתנו מראים תקלות ציטולוגיות, מתחילים בשגשוג בלתי מבוקר, ומפריעים בהדרגה לארגון הרקמות. תסיסנית melanogaster התפתחה כמערכת מודל ניסיוני פופולרי ביולוגיה של סרטן ללמוד את המנגנונים הגנטיים והתאים של tumorigenesis. בפרט, כלים גנטיים עבור דיסוזופיל דימיוני דיסקים (לפתח epithelia בזחלים) לאפשר יצירת תאים Pro- הגידול הופכים ברקמה אפיתל רגיל, מצב דומה לשלבים הראשונים של סרטן האדם. מחקר שנערך לאחרונה על tumorigenesis בדיסקופיית כנפיים תסיסנית , לעומת זאת, הראה כי ייזום הגידול תלוי cytoarchitecture המהותית ואת הסביבה microenviron המקומית, דבר המצביע על כך חשוב לשקול את האזור ספציפי רגישות לגירויים tumorigenic בהערכת פנוטיפים הגידול בדמיון דיסקים. כדי להקל על ניתוח פנוטיפי של הגידול progressiב דיסקים דמיוני, כאן אנו מתארים פרוטוקול ניסויים גנטיים באמצעות מערכת GAL4-UAS כדי לגרום לגידולים ניאופלסטיים בדיסקים דמיון כנף. בנוסף, אנו מציגים שיטת אבחון כדי לסווג את פנוטיפים של נגעים משובצים המושרה epithelia דמיוני, כמו שיטת סיווג ברור להפלות בשלבים שונים של התקדמות הגידול (כגון היפרפלזיה, דיספלזיה, או neoplasia) לא תוארה קודם לכן. שיטות אלה עשויים להיות חלים באופן נרחב על ניתוח המשוב של פנוטיפים הגידול באיברים שונים תסיסנית .

כדי להדגים היווצרות הגידול נאופלסטיות המושרה בניסוי ידי RNAi בתיווך nTSG-מציאה ב דיסקים דמותי תסיסנית הכנף, שלושה נהגים GAL4 שונים שימשו להביע כטב&quot;מ RNAi עבור LGL או scrib: (1) SD-GAL4, אשר מניע ביטוי כטב&quot;מ חזקה כיס כנף והבעה קלה באזורי הצירים ( איור 2 ו איור 3 א ); (2) מעדכן GAL4, אשר כוננים בתת הצירים של ציר, כולל ב...

ניתוח פסיפס משוכפל ב תסיסנית הדיסק epithelia הדימוי הוא מודל מודל חזק ללמוד את המנגנונים הגנטיים והתאים של tumorigenesis. כאן אנו מתארים פרוטוקול כדי לגרום לגידולים בדיסקופיית כנף תסיסנית באמצעות מערכת GAL4-UAS, ולהציג שיטת אבחון לסווג את פנוטיפים הגידול.

אינדוקציה ואבחון של גידולים ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; אפיתלציה דיסק Imaginalia

In the early stages of cancer, transformed mutant cells show cytological abnormalities, begin uncontrolled overgrowth, and progressively disrupt tissue ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לייצר שיבוטים פסיפסיים (mosaic clones) תומוריגניים בדיסקים דמיוניים (imaginal discs) של Drosophila בשלבי התפתחות, ולאחר מכן לסווג את הנגעים השיבוטיים לשלבים שונים של התפתחות הגידול. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח במידול סרטן, כגון כיצד להשרות גידולים באופן עקבי, וכיצד לסווג את שלב ההתקדמות.היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהזרקת הגידול בדיסקים של התוואי של כנף ה-Drosophila מתבצעת באמצעות גנטיקה פשוטה של זבובים, וכי סיווג של שלבי התפתחות הגידול הוא אבחנה פשוטה. לצד קנטה מורימוטו, שידגים את הפרוצדורה, תצטרף קימיקו מורימוטו, טכנאית מהמעבדה שלי. נתחיל בהקמת ההכלאה הגנטית.12 שעות לפני איסוף הבתולות להכלאה, הסירו את כל הזבובים הבוגרים מבקבוקונים המכילים בובות בשלות. למחרת, הכינו הכלאה להפקת צאצאים עם פסיפס גנטי (mosaic). העבירו 12 עד 20 בתולות ו-10 זכרים לבקבוקון חדש, והדגירו אותם למשך יום אחד בטמפרטורה של 25 degrees Celsius.לאחר 24 שעות, העבירו את הזבובים למבחנה חדשה והשליכו את המבחנה הראשונה שבה שהו. לאחר 12 שעות נוספות, יתחילו להופיע ביצים. במרווחי זמן של 12 שעות העבירו את הבוגרים למבחנות חדשות, והשתמשו בצאצאים עבור הניסוי.לאחר הדגרה של מבחנות הביצים למשך יומיים עד ארבעה ימים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס, יש להעביר את הזחלים הלולאות הלום (heat-shock) למשך עשר עד 45 דקות, באמצעות מקבץ מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, להשראה של שיבוטי פסיפס באמצעות flip-out GAL4. הלום חום ביום השני של ההתפתחות ייצור שיבוטים בדיסקים לא בשלים. הלום חום ביום השלישי או הרביעי של ההתפתחות ייצור שיבוטים בדיסקים בשלבים מאוחרים יותר.לאחר הלם החום, החזירו את המבחנות לאינקובטור בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס, עד שזחלי הגיל השלישי יהיו זמינים. לתחילת העבודה, השתמשו במקל עץ, או בפינצטה קהה, כדי להעביר זחלי גיל שלישי נודדים לתוך צלחת פטרי עם PBS. לאחר מכן, בצעו להם גנוטיפיקציה תחת תאורה פלואורסצנטית כדי לזהות את הסמנים הפלואורסצנטיים המתאימים עבור זחלי פסיפס.לפני ההמשך, יש לשטוף את הפסילומיות ב-PBS. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ דיסקציה, השתמשו בשני זוגות פינצטות כדי ללחוץ על מרכז הפסילה ולקרוע את הגוף לשניים. לאחר מכן, לחצו על הווים של הפה, תוך דחיפת הפה לכיוון הגוף, כדי להפוך את הגוף מהפוך.לאחר מכן, הסירו חומרים מיותרים, כגון בלוטות הרוק וגופי השומן. הזחלים מוכנים כעת לקיבוע ולצביעה בנוגדנים, כפי שמפורט בפרוטוקול הכתוב. העבירו את דגימות הרקמה הצבועות לזכוכית מיקרוסקופ באמצעות פיפטת העברה פלסטית של 2 mL.לאחר מכן, בעזרת פינצטה, העבירו כל זחל בנפרד לתוך טיפות של מדיום קיבוע (mounting medium) על עלית מיקרוסקופ. כעת, בעזרת פינצטה, בודדו את הדיסקים האימגינליים (imaginal discs). התחילו בקיבוע קצה הרקמה המפוצעת, ומשכו את המוח ואת דיסקי העין-מחוש (eye-antennal discs) בעזרת פינצטה שנייה.שמרו את המוחות מוכנים לשימוש. כעת אתרו את הדיסקים האימגינליים של הכנף. הדיסקים האימגינליים של הכנף דבוקים לצד הלטראלי של הרקמה שהופרדה.בשלב הבא, קבעו את הרקמה באמצעות פינצטה אחת, וגרדו בעדינות את דיסקיות הכנף. לאחר מכן, מקמו את המוחות סמוך לדיסקיות הכנף, כדי להגן עליהם ממעיכה על ידי זכוכית הכיסוי. כעת, כסו בעדינות את המבנים באמצעות זכוכית כיסוי, ואטמו את זכוכית הכיסוי בעזרת לק לציפורניים.יש לשמור את הפיתה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר רכישת תמונות ה-Z-stack באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, פתח אותן ב-ImageJ והשתמש בפקודת Reslice כדי ליצור חתכים וירטואליים. ניתן ליצור אותם על ציר ה-X-Z, ציר ה-Y-Z או במישור מותאם אישית.כדי ליצור את המישור המותאם אישית, שרטטו קו ישר, או מלבן, על תמונת ה-Z-stack, ועקבו אחר ההנחיות כדי לגרום למחשב להפיק את החתך שלו. השתמשו בחתכים אלו כדי לאבחן את הרקמה עבור פנוטיפים של גידולים. ראשית, זהו את מסות התאים שסוטות, או מראות צמיחה מ ngoài, מהשכבה האפיתליאלית העיקרית.לאחר מכן, עבור כל מסה, קבעו האם הלוקליזציה התת-תאית של חלבוני הצומת נראית תקינה. שיקולים נוספים כוללים את גודל המסה, וכל סימן להגברה של פרוליפרציית תאים בתוך המסה. באופן זה, מזוהה סוג הגידול.בדוגמה זו סווגו ארבעה שיבוטים, באמצעות חתכים אנכיים שנוצרו על ידי תוכנת ההדמיה. שניים סווגו כדיספלזיה, מכיוון שחלבון ה-DLG המסומן נמצא במיקום שגוי. שיבוט B קטן מגודל של ארבעה תאים, ושיבוט C אינו חורג מהאפיתל.לפיכך, לא B ולא C סווגו כנאופלזמה (גידול). שני השבטים הנוספים הראו גם הם לוקליזציה שגויה של DLG, ויצרו מסות תאים גידוליות מחוץ לאפיתל. מאחר וגודלם של שבטי הגידולים המודחים הללו היה יותר מארבעה תאים בקוטר, סווגו שבטים אלו כנאופלסטיים.באמצעות השיטות המתוארות, בוצע knockdown לגן LGL באזורי כרית הכנף (wing-pouch) והציר (hinge), באמצעות RNAi המונחה על ידי sd-GAL4. בביקורות שבהן היה חסר הטרנסגן של ה-RNAi, לא נצפו שינויים מורפולוגיים בדיסקיות הכנף בשלב instar השלישי. בביצוע ה-knockdowns, נצפו בבירור עיוותים אפיתליאליים וצמיחות יתר תומוריגניות בחלקים מסוימים של הציר.עם זאת, לא נצפתה צמיחה מוגברת דיספלסטית באזור כיס הכנף (wing-pouch). ממצא זה התאם באופן הפוך לביטוי של MMP1 באזורים אלו: חלבון המקנה יכולת גרורתית. כדי לנטר את התקדמות הצמיחה של הגידול שגורמה על ידי השתקה (knock-down) של LGL, הופקו דיסקים של כנף בעלי קלונים ספורדיים המבטאים LGL-RNAi, כפי שתואר.יומיים לאחר הלם חום של זחלים בשלב הטרום-בליעה השני (second-instar), חלק משיבוטי ה-knock-down באזור הציר (hinge region) הראו סטייה מהצד האפיקלי של השכבה האפיתליאלית. ארבעה ימים לאחר השראת הלם החום, נגעי דיספלזיה באזור הציר הפכו ברורים, דבר המרמז כי שיבוטי LGL knock-down, שהוזזו מהצד האפיקלי, שוכפלים בתוך הלומן. שבעה ימים לאחר השראת הלם החום, צמיחות יתר תומורוגנית שלטה באזורי הציר.בעת שימוש במערכות flip-out GAL4, חשוב לזכור לבחון את ההשפעה של תזמון שונה של הלם חום על הפנוטיפים הקלונאליים, מכיוון שהפוטנציאל התומוריגני של תאי הדיסק האימגינלי עשוי להיות תלוי באירועי סיגנלינג אנדוגניים של שלב הפיתוח, או בדיפרנציאציה תאית.

induction-diagnosis-tumors-drosophila-imaginal-disc

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

פרוטוקול זה מדגים את הטכניקה לנתיחה משמש לבידוד דיסקים דמותי מן הזחלים תסיסנית בשלב instar 3. שיטות לתיקון רקמות אחרי אומר והסרה של הזרוע, רגל, עין ודיסקים הם הוכיחו ישירות על שקופיות מיקרוסקופ להדמיה הבאים.

Dissection של דיסקים דמותי מן הזחלים 3 תסיסנית Instar

Hemocytes תסיסנית לפזר מעל מכלול של העובר המתפתח. פרוטוקול זה מדגים כיצד הר התמונה באמצעות העברות אלה עוברים עם hemocytes שכותרתו fluorescently.

הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

תסיסנית גלמי אימונוהיסטוכימיה בטן

בעת צביעת דיסקים דמיוניים של דרוזופילה, לעיתים קרובות מתבצעת דיסקציה גסה בה הדיסקים חשופים אך נשארים מחוברים לגוף. לאחר המוכתמים, הדיסקים המעניינים מבודדים ומורכבים. הפרוטוקול לדוגמה מדגים הליך לדיסקציה והרכבה של דיסק דמיוני בכנף.

דרוזופילה דיסקציה דמיונית של הזחל: שיטה להתבוננות בהתפתחות אפיתליה

שיתוף פעולה בין אונקוגן הופעל כמו RAS V12 ומוטציות בגנים קוטביות תא כמו שרבטה, לגרום לצמיחת גידול בדרוזופילה שבו תאים סרטניים גם להציג התנהגויות פולשנית. הנה פרוטוקול פשוט לאינדוקציה והתבוננות בגידולים שפירים ופולשנית מוצג.

פרוטוקול גנטי אינדוקציה ויזואליזציה של גידולים שפירים ופולשני בסוג cephalic מכלולי<em&gt; Melanogaster דרוזופילה</em

המבנים הבוגרים של דרוזופילה נגזרים ממבנים דמויי שק הנקראים דיסקים דמיוניים. ניתוח דיסקים אלה מספק תובנה לגבי תהליכים התפתחותיים רבים כולל קביעת רקמות, קביעת גבול תאים, התפשטות תאים, מפרט גורל התא וקוטביות תאים מישוריים. פרוטוקול זה משמש להכנת דיסקים דמיוניים למיקרוסקופ אור/פלורסנט.

נתיחה וImmunostaining של דמותי דיסקים מ Melanogaster דרוזופילה

פרוטוקול זה מדגים כיצד ליצור מסומן פלורסנטי, גידולים המשובטים מוגדר גנטית בעין תסיסנית / דיסקים דמותי מחושים (EAD). הוא מתאר כיצד לנתח את EAD והמוח מן הזחלים instar השלישי וכיצד לעבד אותם לחזות ולכמת שינויים בהתבטאות גנים הפולשנות הגידול.

ה<em&gt; תסיסנית</em&gt; דגם גידול דיסק דמותי: ויזואליזציה וכימות של ביטוי גנים סרטניים הפולשנות שימוש פסיפסים גנטי

כאן אנו מתארים הליך ללכידת תמונות חיות של גסטרולציה של דרוזופילה. זה אפשר לנו להבין טוב יותר את ההתכווצות האפיקלית הכרוכה בהתפתחות מוקדמת ולנתח עוד יותר מנגנונים השולטים בתנועות התאים במהלך שינוי מבנה הרקמה.

הדמיה של שינוי צורה של התא ותנועתו ב תסיסנית Gastrulation שימוש Reporter DE-cadherin זבובים טרנסגניים

פרוטוקול זה מיועד הדמיה וניתוח של הדינמיקה של כיוון התאים ואת צמיחת רקמות בתוך הבטן הדרוזולה epithelia כמו זבוב הפרי עובר מטמורפוזה. המתודולוגיה המתוארת כאן ניתנת להחלה על חקר שלבים, רקמות ומבנים תת-סלולאריים שונים בדרוזופילה או באורגניזמים אחרים במודל.

הדמיה וניתוח של כיוון רקמות ודינמיקה בפיתוח הדרוזולה אפיתליה במהלך שלבי pupal

אנו מתארים פרוטוקול למדידת מגעים בין תאים בשכבות אפיתל סמוכות בדיסקים דמיוניים חיים של כנפי דרוזופילה באמצעות גישה מבוססת בנייה מחדש של GFP.

מערכת ביטוי כפול מבוססת השלמת GFP להערכת מגע תא-תא בתיווך ציטונמים בדיסקים דמיוניים חיים של כנף דרוזופילה

מאמר זה מתאר פרוטוקול יעיל לפירוק דיסק דמיוני וצביעת נוגדנים, שהוא חסכוני עם מגיבים ומקל על טיפול בדיסקים דמיוניים במספרים קטנים.

כריתה בקנה מידה קטן וצביעת נוגדנים של דיסקים דמיוניים באנטנות העיניים והכנף מ-Drosophila melanogaster

חקור שיטה לאינדוקציה ואבחון של גידולים בדיסקים אימגינליים של Drosophila באמצעות מערכת GAL4-UAS. פרוטוקול זה מאפשר סיווג של שלבי התפתחות הגידול ומספק מודל אמין למחקר סרטן.

אינדוקציה ואבחון של גידולים ב

גלה סרטונים נוספים