Name: בידוד של סוג אני ו II סוג pericytes של עכבר שרירי השלד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: למדו לבודד תת-אוכלוסיות של pericytes מסוג I ו-II משרירי השלד בעכברים באמצעות FACS. שיטה זו מאפשרת בידוד בו-זמני ללא שימוש ב-transgene NG2 dsRED ומסייעת בחקר הביולוגיה של pericytes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה באופן חלקי על ידי מענק קרן-A-FO של קרן Dystrophy Myotonic (MDF-FF-2014-0013) ומענק פיתוח המדען של איגוד הלב האמריקני (16SDG29320001).

Wildtype ו Nestin-GFP מהונדס עכברים היו שוכנו במתקן החיות באוניברסיטת מינסוטה. כל הניסויים הניסויים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש באוניברסיטת מינסוטה היו בהתאם NIH מדריך לטיפול ושימוש של חיות מעבדה. 1. ניוון שרירים בודד בידוד התא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים בוגרים (6-10 שבועות, הן זכר והן נקבה) עם tribromoethanol (250 מ&quot;ג / ק&quot;ג, IP) ו לעקר את עור הבטן שלהם עם אתנול 70%. הערה: Tribromoethanol שימש כאן במקום קטמין עבור הרדמה / המתת חסד, כמו ketamine ידוע אינטראקציה עם קולטני NMDA, אשר עלולה להשפיע על המחקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכברים במצב שכיבה להשתמש איזמל לבצע חתך אופקית על עור הבטן. לקלף את העור ביד, מושך בכיוונים מנוגדים לחשוף את השרירים hindlimb. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קולקלא את השרירים משני hindlimbs באמצעות מלקחיים ומספריים. אחסן אותם ב סטרילי פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) בתוספת 1% פניצילין סטרפטומיצין (P / S) על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את השרירים hindlimb גזור ב- PBS קר כקרח בתוספת 1% P / S פעמיים ולהעביר אותם צלחת סטרילית 10 ס&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לנתח את העצבים, כלי הדם, ורקמות החיבור מן השרירים באמצעות מלקחיים ומספריים תחת מיקרוסקופ לנתיחה בהגדלה 2X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דק קוצצים את השרירים לחתיכות קטנות (1-2 מ&quot;מ 3 ) באמצעות מספריים סטריליים להבים. אם יש צורך, להוסיף כמות קטנה של Dulbecco השתנה נשר בינוני (DMEM) כדי להבטיח כי השרירים לא יבשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכני לשבור את הרקמה על ידי pipetting למעלה ולמטה דרך פיפטה 10 מ&quot;ל סרולוגי 10 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טריים פתרון העיכול (DMEM בתוספת 0.2% סוג 2 collagenase) לתערובת. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות עם עדיןE-agitation ב 35 סיבובים / דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Triturate באמצעות מחט 18 G כדי homogenize את התערובת. ואז, צנטריפוגה ב XG 500 במשך 5 דקות. מחק supernatant ולאחר מכן resuspend גלולה 0.25% טריפסין / EDTA. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. חזור על צעד צנטריפוגה פעמיים נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ&quot;ל של DMEM בתוספת 20% בסרום שור עוברית (FBS) לפתרון צנטריפוגה ב XG 500 במשך 5 דקות. מחק supernatant ו resuspend גלולה במאגר תמוגה תא דם אדום (155 מ&quot;מ NH 4 Cl, 10 מ&quot;מ KHCO 3 , ו 0.1 מ&quot;מ EDTA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 500 במשך 5 דקות. מחק supernatant ו resuspend גלולה במיון מיון (20 מ&quot;מ HEPES, pH 7.0, 1 מ&quot;מ EDTA, ו 1% BSA ב Ca / Mg 2 + חינם PBS, pH 7.0). סנן את התערובת באמצעות מסננת תא 40 מיקרומטר להשיג ההשעיה תא בודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 500 במשך 5 דקות. מחק supernatant ו resuspend גלולה ב 1 מ&quot;ל של מיון המאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור אתמספר תא עם hemocytometer ו לדלל את ההשעיה תא בודד ל 5 x 10 6 / mL במאגר מיון. </li></ol> 2. תא מכתים ומיון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפקדים ואת המדגם כמתואר בטבלה 1 . כתם ההשעיה תא בודד עם נוגדנים בהתאמה על קרח במשך 30 דקות, כמתואר בטבלה 1 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 500 במשך 5 דקות ולשטוף את הכדורים פעמיים עם מיון המאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף DAPI לפתרונות תא בודד, כפי שצוין בטבלה 1. השתמש DAPI 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​DAPI (ריכוז סופי) עבור DAPI צבע אחד שליטה ו 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​DAPI עבור PDGFRβ-PE-FMO שליטה המדגם. שמור את כל הצינורות על הקרח לאורך הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את סדרן ואת התוכנה. סרוק והכניס שבב מיון 100 מיקרומטר כאשר תתבקש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את ההגדרה האוטומטית ( כלומר, יישור שבב, כיול אגל, כיול זרם צד, ועיכוב מיון calibratiב) על ידי טעינת חרוזי ההתקנה אוטומטית כאשר תתבקש לעשות זאת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר ההגדרה האוטומטית הושלמה, עבור לכרטיסייה &quot;ניסוי&quot;, לחץ על &quot;חדש&quot; ובחר את &quot;תבנית ריקה&quot; מתוך &quot;תבניות ציבוריות&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת &quot;הגדרות מדידה&quot;, הזן &quot;DAPI&quot; עבור &quot;FL1&quot;, &quot;Nestin-GFP&quot; עבור &quot;FL2&quot; ו &quot;PDGFRβ&quot; עבור &quot;FL3.&quot; בטל את הסימון של תיבות עבור &quot;FL4&quot; - &quot;FL6&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן את התיבות כדי להפעיל את הלייזרים 405, 488 ו- 561 ולחץ על &quot;צור ניסוי חדש&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את &quot;התחל פיצוי אשף&quot; ולאחר מכן פעל לפי &quot;אשף פיצוי&quot; התוכנה מבקשת להגדיר את הפיצוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את השליטה unstained ולחץ על &quot;התחל&quot;. לחץ על &quot;גלאי &amp; הגדרות סף&quot; ולהתאים את הרווח חיישן של FSC ו BSC גלאי למקום האוכלוסייה על הסולם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוֹדָעָהרק את רמות הרווח של FL1-FL3 ערוצי הקרינה למקום אוכלוסיות שליליות בצד שמאל של היסטוגרמות. לחץ על כפתור &quot;הקלטה&quot; כדי להקליט את הנתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען בודדים בצבע אחד אחד כאשר תתבקש. לחץ על &quot;התחל והקלט&quot; כדי להקליט את הנתונים. להתאים את השערים לאוכלוסיות חיוביות על היסטוגרמות. לחץ על &quot;הבא&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור אל &quot;חישוב מטריקס&quot; על הכרטיסייה &quot;פיצוי&quot; ולחץ על &quot;חישוב&quot; בלוח &quot;חישוב פיצוי הגדרות&quot; לבצע את הפיצוי. לחץ על &quot;סיום&quot; כדי לצאת מהאשף &quot;פיצוי&quot;. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את PDGFRβ-PE-FMO שליטה ולחץ על &quot;התחל&quot;. צייר שער מצולע (שער A) סביב התאים של עניין תחת העלילה &quot;כל האירועים&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ פעמיים בתוך שער A כדי ליצור מגרש ילדים. שנה את ציר Y ל- DAPI וצייר שער מצולע (שער B) סביב תאים חיים (DAPI) נמוכים . לחץ פעמיים על iNside שער B כדי ליצור מגרש הילד. לשנות את ציר ה- X כדי FSC-H ואת ציר Y ל- FSC-W ו לצייר שער מצולע (שער C) סביב singlets לחסל הכפולות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ פעמיים בתוך שער C כדי ליצור מגרש ילדים. שנה את ציר ה- X ל- Nestin-GFP ואת ציר ה- Y ל- PDGFRβ-PE. לחץ על כפתור &quot;הקלטה&quot; כדי להקליט את הנתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את המדגם וחזור על הצעדים 2.11-2.12. לאחר ההקלטה, לחץ על &quot;השהה&quot; כדי לשמור על המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את גבולות gating עבור PDGFRβ + ו Nestin-GFP + תאים המבוססים על PDGFRβ-PE-FMO שליטה. צייר השערים עבור האוכלוסייה PDGFRβ + Nestin-GFP - ו PDGFRβ + Nestin-GFP + אוכלוסיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת &quot;שיטת מיון&quot;, בחר &quot;2-way צינורות&quot; ולהקצות &quot;PDGFRβ + Nestin-GFP - &quot; ו &quot;PDGFRβ + Nestin-GFP + &quot; לתאי צינורות שמאל וימין, מחדשבצורה מדהימה. הרכבה מיון המיון מלא 15 מ&quot;ל צינורות איסוף על הבמה אוסף ולחץ על &quot;טען אוסף&quot; כפתור &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הלחצן &quot;המשך&quot; כדי לשמור על הדגימה פועלת. לחץ על &quot;התחל מיון&quot; כדי לאסוף PDGFRβ + Nestin-GFP - (סוג אני pericytes) ו PDGFRβ + Nestin-GFP + (סוג II pericytes) תאים. </li></ol> 3. לאחר מיון המיון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תאים מיון ב 500 xg במשך 5 דקות, resuspend גלולה ב 1 מ&quot;ל של מדיום pericyte (ראה טבלה חומרים ), ולספור את צפיפות התא באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סוג זרע אני ואת סוג II pericytes על פולי- D- ליזין (PDL) מצופה coverslips ב ~ 1 x 10 4 תאים / ס&quot;מ 2 . לגדול במדיום pericyte במשך 3 ימים על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 3, לבחון את המורפולוגיה pericyte (תחת בניגוד לעומת) אנדוגני Nestin-GFP ביטוי באמצעות מיקרו פלואורסצנטיהיקף (לייזר עירור: 488 ננומטר, מסנן עירור: 470/40 ננומטר, מסנן פליטה: 515/30 ננומטר). קחו תמונות תחת מטרה 20X (0.45 NA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את המדיום pericyte עם בינוני adipogenic (MSC העכבר הבסיס + בינוני adipogenic תוספת גירוי) ו myogenic (DMEM + 2% בסרום סוס) בינוני ליזום adipogenic ו myogenic בידול, בהתאמה, כפי שתואר לעיל 20 . שנה את המדיום כל 2-3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים ביום 17 (14 ימים לאחר בידול אדיפוגני / myogenic) ב paraformaldehyde 4% (PFA) במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. הערה: זהירות, PFA הוא מסרטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע immunocytocochemistry נגד perilipin (סמן adipocyte) ו- S- myosin (בוגר myotube / myofiber בוגרת), כפי שתואר בפרסומים קודמים 19 , 20 . <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים קבוע 3 פעמים PBS במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת חיץ חסימה (PBSבתוספת 5% סרום חמור, 3% BSA, ו 0.3% Triton X-100) ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 1 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עם antilodies perilipin (2 מיקרוגרם / מ&quot;ל) ו / או אנטי- S- מיוזין (2 מיקרוגרם / מ&quot;ל) נוגדנים ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים 3 פעמים PBS במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עם Alexa 555 חמור נגד ארנבת (4 מיקרוגרם / מ&quot;ל) ו / או Alexa555 חמור אנטי עכבר (4 ​​מיקרוגרם / מ&quot;ל) נוגדנים בטמפרטורת החדר למשך 1 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים 3 פעמים PBS במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר תאים immunostained עם המדידה הרכבה המכיל DAPI (ראה את טבלת החומרים). בחן perilipin ו- S- ביטוי myosin באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (עירור לייזר: 543 ננומטר, עירור 540/45 ננומטר ו 600/50 ננומטר פליטת) ולקחת תמונות תחת מטרה 40X (0.60 NA). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Rennert, R. C., Sorkin, M., Garg, R. K., Gurtner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+recruitment+after+injury%3A+lessons+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+medicine%22%5BJournal%5D)">Stem cell recruitment after injury: lessons for regenerative medicine.</a> Regenerative medicine. 7 (6), 833-850 (2012).</li>
<li>Sambasivan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax7-expressing+satellite+cells+are+indispensable+for+adult+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).</li>
<li>Relaix, F., Zammit, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells+are+essential+for+skeletal+muscle+regeneration%3A+the+cell+on+the+edge+returns+centre+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Satellite cells are essential for skeletal muscle regeneration: the cell on the edge returns centre stage.</a> Development. 139 (16), 2845-2856 (2012).</li>
<li>von Maltzahn, J., Jones, A. E., Parks, R. J., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax7+is+critical+for+the+normal+function+of+satellite+cells+in+adult+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Pax7 is critical for the normal function of satellite cells in adult skeletal muscle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16474-16479 (2013).</li>
<li>Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+absolute+requirement+for+Pax7-positive+satellite+cells+in+acute+injury-induced+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).</li>
<li>Kuang, S., Charge, S. B., Seale, P., Huh, M., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+Pax7+and+Pax3+in+adult+regenerative+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for Pax7 and Pax3 in adult regenerative myogenesis.</a> J Cell Biol. 172 (1), 103-113 (2006).</li>
<li>Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells%2C+connective+tissue+fibroblasts+and+their+interactions+are+crucial+for+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).</li>
<li>Morgan, J. E., Pagel, C. N., Sherratt, T., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+persistence+and+migration+of+myogenic+cells+injected+into+pre-irradiated+muscles+of+mdx+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">Long-term persistence and migration of myogenic cells injected into pre-irradiated muscles of mdx mice.</a> J Neurol Sci. 115 (2), 191-200 (1993).</li>
<li>Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+myoblast+transplantation+reveal+a+discrete+minority+of+precursors+with+stem+cell-like+properties+as+the+myogenic+source%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source.</a> J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).</li>
<li>Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invited+review%3A+myoblast+transfer%3A+a+possible+therapy+for+inherited+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Invited review: myoblast transfer: a possible therapy for inherited myopathies.</a> Muscle Nerve. 14 (3), 197-212 (1991).</li>
<li>Montarras, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+isolation+of+satellite+cells+for+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration.</a> Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).</li>
<li>Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+specification+of+side+population+cells+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle.</a> J Cell Biol. 159 (1), 123-134 (2002).</li>
<li>Tamaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle-derived+CD34%2B%2F45-+and+CD34-%2F45-+stem+cells+are+situated+hierarchically+upstream+of+Pax7%2B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle-derived CD34+/45- and CD34-/45- stem cells are situated hierarchically upstream of Pax7+ cells.</a> Stem Cells Dev. 17 (4), 653-667 (2008).</li>
<li>Dellavalle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+resident+in+postnatal+skeletal+muscle+differentiate+into+muscle+fibres+and+generate+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells.</a> Nat Commun. 2, 499(2011).</li>
<li>Mitchell, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+non-satellite+cell+muscle+resident+progenitor+during+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a non-satellite cell muscle resident progenitor during postnatal development.</a> Nat Cell Biol. 12 (3), 257-266 (2010).</li>
<li>Pannerec, A., Formicola, L., Besson, V., Marazzi, G., Sassoon, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+skeletal+muscle+resident+progenitors+and+their+cell+fate+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Defining skeletal muscle resident progenitors and their cell fate potentials.</a> Development. 140 (14), 2879-2891 (2013).</li>
<li>Dellavalle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+of+human+skeletal+muscle+are+myogenic+precursors+distinct+from+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells.</a> Nat Cell Biol. 9 (3), 255-267 (2007).</li>
<li>Kostallari, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+in+the+myovascular+niche+promote+post-natal+myofiber+growth+and+satellite+cell+quiescence%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Pericytes in the myovascular niche promote post-natal myofiber growth and satellite cell quiescence.</a> Development. 142 (7), 1242-1253 (2015).</li>
<li>Birbrair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+pericytes+in+skeletal+muscle+regeneration+and+fat+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Role of pericytes in skeletal muscle regeneration and fat accumulation.</a> Stem Cells Dev. 22 (16), 2298-2314 (2013).</li>
<li>Yao, Y., Norris, E. H., Mason, C. E., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminin+regulates+PDGFRbeta%28%2B%29+cell+stemness+and+muscle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Laminin regulates PDGFRbeta(+) cell stemness and muscle development.</a> Nat Commun. 7, 11415(2016).</li>
<li>Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes%3A+developmental%2C+physiological%2C+and+pathological+perspectives%2C+problems%2C+and+promises%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises.</a> Dev Cell. 21 (2), 193-215 (2011).</li>
<li>Dore-Duffy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes%3A+pluripotent+cells+of+the+blood+brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Pericytes: pluripotent cells of the blood brain barrier.</a> Curr Pharm Des. 14 (16), 1581-1593 (2008).</li>
<li>Dore-Duffy, P., Katychev, A., Wang, X., Van Buren, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS+microvascular+pericytes+exhibit+multipotential+stem+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">CNS microvascular pericytes exhibit multipotential stem cell activity.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 26 (5), 613-624 (2006).</li>
<li>Birbrair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+pericyte+subtypes+differ+in+their+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential.</a> Stem Cell Res. 10 (1), 67-84 (2013).</li>
<li>Gautam, J., Nirwane, A., Yao, Y. Laminin differentially regulates the stemness of type I and type II pericytes. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 28(2017).</li>
<li>Birbrair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes%3A+multitasking+cells+in+the+regeneration+of+injured%2C+diseased%2C+and+aged+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pericytes: multitasking cells in the regeneration of injured, diseased, and aged skeletal muscle.</a> Front Aging Neurosci. 6, 245(2014).</li>
</ol>

לכל המחברים אין ניגוד אינטרסים לחשוף.

Pericytes הם תאים multivotent perivascular 22 , 23 הממוקם על פני השטח abluminal של נימי 21 , 26 . בשרירי השלד, pericytes מסוגלים להבדיל לאורך נתיבים adipogenic ו / או myogenic 19 , 20 , 24 . מחקרים שנערכו לאחרונה חשפו שתי תת-קבוצות של פרסיטים, עם ביטוי סמן שונה והבדלים ברו...

ניוון שרירים הוא הפרעה ניוונית שרירית כי אין טיפולים יעילים עד כה. פיתוח טיפולים המקדמים התחדשות רקמות תמיד היה עניין רב. התחדשות רקמות ותיקון לאחר נזק תלוי בתאי גזע תושב / תאים אב 1 . תאי לוויין מחויבים תאים מבשר myogenic התורמים התחדשות שרירים 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . השימוש הקליני שלהם, לעומת זאת, הוא הקשו על ידי הגירה מוגבלת שלהם שיעור הישרדות נמוך לאחר ההזרקה, כמו גם על ידי יכולת ירידה שלהם בידול לאחר הגברה במבחנה 8 , 9 , 10 , 11 . בנוסף satelliתאי T, שרירי השלד מכילים גם אוכלוסיות תאים רבים אחרים עם פוטנציאל myogenic 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , כגון טסיות הנגזרות גורם גדילה ביתא (PDGFRβ) תאים interstitial אינטראקטיביים. ישנן ראיות מראה כי שריר הנגזרות PDGFRβ תאים + מסוגלים להבדיל לתאי myogenic ולשפר פתולוגיה שריר לתפקד 14 , 17 , 18 , 19 , 20 . PDGFRβ בעיקר תוויות pericytes 21 , אשר תאים perivascular עם pluripotency 22 , 23 . בנוסף PDGFRβ, סמנים רבים אחרים, כולל Neuron-Glial 2 (NG2) ו CD146, משמשים גם אניDentify pericytes 21 . עם זאת, יש לציין כי אף אחד מהסימנים הללו אינו ספציפי ל- pericyte 21 . מחקרים שנערכו לאחרונה חשפו שני תת-סוגים של פריסיטים בשרירים, הנקראים סוג I וסוג II, המבטאים סמנים מולקולריים שונים ומבצעים פונקציות שונות 19 , 24 , 25 . ביוכימית, סוג אני pericytes הם NG2 + Nestin - , ואילו סוג II pericytes הם NG2 + Nestin + 19 , 24 . באופן פונקציונלי, סוג אני pericytes יכול לעבור בידול אדיפוגני, תורם הצטברות שומן ו / או פיברוזיס, ואילו סוג II pericytes יכול להבדיל לאורך מסלול myogenic, תורם התחדשות שרירים 19 , 24 , 25 . תוצאות אלה מראות כי: (1) סוג אני pericytes עשוי bE ממוקד לטיפול בהפרעות ניווניות שומן / פיברוזיס, ו (2) סוג II pericytes יש פוטנציאל טיפולי רב עבור ניוון שרירים. חקירה נוספת ואפיון של אוכלוסיות אלה דורשות פרוטוקול בידוד המאפשר הפרדה מסוג I ו percytes סוג II ברמה גבוהה של טוהר. נכון לעכשיו, בידוד subpopulations pericyte מסתמך על NG2-DsRed ו Nestin-GFP עכברים מהונדסים פעמיים 19 , 24 . הזמינות של עכברים NG2-DsRed ואת האיכות של רוב הנוגדנים NG2 להגביל את השימוש הנרחב של שיטה זו. בהתחשב בכך שכל NG2 + pericytes גם להביע PDGFRβ בשרירי השלד 19 , 20 , 24 , אנו משער כי NG2 ניתן להחליף PDGFRβ לבידוד pericytes ו subpopulations שלהם. עבודה זו מתארת ​​פרוטוקול מבוסס FACSמשתמש מכתים PDGFRβ ואת האות Nestin-GFP. שיטה זו היא פחות תובענית עבור החוקרים כי: (1) זה אינו דורש את הרקע NG2-DsRed ו (2) הוא משתמש נוגדנים PDGFRβ זמינים מסחרית, אשר מאופיינים היטב. בנוסף, הוא מאפשר בידוד סימולטני של סוג I ו- II pericytes בטוהר גבוה, ומאפשר חקירה נוספת של ביולוגיה ופוטנציאל טיפולי של subpopulations אלה pericyte. בעקבות טיהור, תאים אלה יכולים להיות גדלים בתרבות, המורפולוגיות שלהם יכול להיות דמיינו. עבודה זו גם מראה כי סוג I ו percytes סוג II מבודד באמצעות שיטה זו, כמו אלה מטוהרים מן העכברים מהונדס פעמיים, הם אדיפוגניים ו myogenic, בהתאמה.

<table><tbody><tr><td>סדרן תאים</td><td>Sony</td><td>SH800</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי התקנה אוטומטית</td><td>Sony</td><td>LE-B3001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>Avertin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>Pericyte Growth Medium</td><td>ScienCell</td><td>1201</td><td></td></tr><tr><td>MSC בסיסי בינוני (עכבר)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5501</td><td></td></tr><tr><td>תוסף ממריץ אדיפוגני (עכבר)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5503</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Gibco</td><td>16000</td><td></td></tr><tr><td>סרום סוסים</td><td>Sigma</td><td>H1270</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז סוג 2</td><td>וורת'ינגטון</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>0.25% טריפסין/EDTA&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>PDL</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>PDGFR&beta;-PE נוגדן</td><td>eBioscience</td><td>12-1402</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן פריליפין</td><td>Sigma</td><td>P1998</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן S-מיוזין</td><td>DSHB</td><td>MF-20</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555-נוגדן נגד ארנב& נ.ב.פ;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-31572</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555-נוגדן נגד עכבר</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-31570</td><td></td></tr><tr><td>מדיום הרכבה עם DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP120</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A661</td><td></td></tr><tr><td>KHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>P184</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>18 גרם מחטים</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>10 מ"ל פיפטה סרולוגית</td><td>BD</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>OneComp eBeads</td><td>eBioscience</td><td>01-1111</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד של סוג אני ו ii סוג pericytes של עכבר שרירי השלד

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Pericytes הם תאים multipotent perivascular המציגים הטרוגניות באיברים שונים או אפילו בתוך הרקמה זהה. בשרירי השלד, יש לפחות שתי תת-אוכלוסיות (הנקראות סוג I וסוג II), המבטאות סמנים מולקולריים שונים ויש להן יכולות הבחנה שונות. באמצעות NG2-DsRed ו Nestin-GFP עכברים פעמיים מהונדס, סוג אני (NG2-DsRed + Nestin-GFP - ) וסוג II (NG2-DsRed + Nestin-GFP + ) פריסיטים היו מבודדים בהצלחה. עם זאת, הזמינות של עכברים אלה פעמיים מהונדס מונע את השימוש הנרחב של שיטה זו טיהור. עבודה זו מתארת ​​פרוטוקול חלופי המאפשר בידוד קל בו זמנית של סוג I ו pericytes סוג II של שרירי השלד. פרוטוקול זה מנצל את הקרינה המופעל תא מיון (FACS) טכניקה מטרות PDGFRβ, ולא NG2, יחד עם האות Nestin-GFP. לאחר בידוד, הקלד אני ו tyPe II pericytes להראות מורפולוגיות שונות. בנוסף, סוג I ו percytes סוג II מבודדים בשיטה חדשה זו, כמו אלה מבודד מן העכברים מהונדס פעמיים, הם אדיפוגניים ו myogenic, בהתאמה. תוצאות אלו מראות כי פרוטוקול זה ניתן להשתמש כדי לבודד subpopulations pericyte של שרירי השלד ואולי מתוך רקמות אחרות.

הפרמטרים של FACS, כולל עוצמת הלייזר ותגמול הערוץ, מתוקנים על סמך תוצאות הבקרה הבלתי מבוקרת ובקרות בצבע יחיד. PDGFRβ-PE-FMO שליטה משמש לקבוע את gating עבור האוכלוסייה PDGFRβ-PE + ( איור 1 א ). בין PDGFRβ-PE תאים, שתי אוכלוסיות המייצג Nestin-GFP + ו Nestin-GFP - תאים מופרדים בבירור ( איור 1 א ). גבולות Gating עבור PDGFRβ-PE + Nestin-GFP +</sup...

עבודה זו מתארת ​​פרוטוקול מבוסס FACS המאפשר בידוד קל בו זמנית של סוג I ו pericytes סוג II של שרירי השלד.

בידוד של סוג אני ו II סוג pericytes של עכבר שרירי השלד

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד תתי-אוכלוסיות של פריציטים (pericytes) משרירים שלד באמצעות FACS. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מרכזיות בתחום הביולוגיה של הפריציטים, כגון מהו ההבדל הביולוגי בין פריציטים מסוג I לפריציטים מסוג II? היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שהוא מאפשר בידוד סימולטני של פריציטים מסוג I ומסוג II ללא שימוש בטרנסגן NG2 dsRED.היישומים של פרוטוקול זה אינם מוגבלים לשרירים שלד. ניתן להשתמש בו גם כדי לבודד פריציטים (pericytes) מאיברים אחרים, כגון המוח. כדי להתחיל, השג תחילה את הרקמה הרצויה מעכבר טרנסגני nestin-GFP, ולאחר מכן שטוף את הרקמה פעמיים ב-PBS קר בקרח המכיל אנטיביוטיקה.לאחר מכן, העבירו את הדגימות לצלחת סטרילית בקוטר 10 סנטימטרים. לאחר מכן, באמצעות מספריים ולאבנים סטריליים, חתכו את השרירים לחתיכות קטנות של 1 עד 2 מילימטרים מעוקב. במידת הצורך, הוסיפו כמות קטנה של DMEM כדי למנוע מהרקמה להתייבש.העבירו את הרקמה למעלה ולמטה באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מילימטר כדי לפרק אותה באופן מכני. לאחר מכן, הוסיפו לתערובת תמיסת עיכול טרייה, DMEM המועשר ב-0.2% Type 2 collagenase, והדגרירו את הדגימה בטמפרטורה של 37 °C למשך שעתיים ב-35 RPM. לאחר שעתיים של הדגירה, בצעו טיטרציה לתערובת באמצעות מחט במידה 18 (18-gauge) וסובבו את התוצרי בתהליך צנטריפוגה ב-500 x g למשך חמש דקות

isolation-of-type-i-and-type-ii-pericytes-from-mouse-skeletal-muscles

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

סרטון זה מדגים שיטה לבידוד פריציטים מוחיים ממוח עכבר. התאים המבודדים מתורבתים במדיה ספציפית לפריציטים כדי לקדם את התפשטות הפריציטים.

בידוד וטיפוח פריציטים מוחיים של עכברים

בידוד והתרבות של myofibers הוא תקן...

בידוד ותרבות של Myofibers פרט ותאי הלווין שלהם משרירי שלד למבוגרים

הבידוד והתרבות של אוכלוסייה טהורה של תאי לווין שקטים, אוכלוסיית תאי גזע שריר, הוא חיוני להבנה של ביולוגיה שרירים תאי גזע והתחדשות, כמו גם בתאי גזע להשתלה עבור טיפולים בניוון שרירים ומחלות ניווניות אחרות.

בידוד, תרבות והשתלה של תאי לווין שריר

פיתחנו רומן וטכניקה לשחזור לבודד את התרבויות העיקריות של תאי שריר חלק ריאתי עורקים (PASMC) מעכברים צעירים כP7 כ, ובכך לאפשר מחקר טוב יותר של מסלולי האיתות המעורבים בהתכווצות שרירים חלקה בילוד תא ורגיעה.

בידוד של תאי שריר חלקים עורק ריאה מעכברים ילודים

Microvascular תאי אנדותל של שרירי השלד (MMEC) לעצב את הדופן הפנימית של שריר נימים ולווסת את שניהם, חילופי נוזלים/מולקולות והעברה של תאים (חיסוניים) בין רקמת שריר, דם. בידוד של MMEC מאתר ראשי, כפי שמתואר כאן, מאפשר מקיף חקירות במבחנה של יחידת"myovascular".

בידוד של תאי אנדותל Microvascular ראשי שריר השלד מאתר

על מנת לבודד ולטהר את קרום הלב למחקרים בסיסיים ולחקור את הפוטנציאל הטיפולי של הביולוגיה שלהם.

בידוד וטיהור של קרום הלב של מורלין

אנחנו מציגים פרוטוקול להפקת. קרום המוח של מורציטים פרוטוקול זה הינו כלי רב ערך עבור מחקרים בלתי מתורבת המספקים טוהר גבוה ותשואה גבוהה, ובכך מקטין את מספר החיות הנסיוניות המשמשות.

שיטת פלט גבוהה כדי לבודד קרום הלב של מוחין מהעכבר

כאן, אנו מציעים שיטה ביעילות להשיג סיבי שריר בודד בשלב מוקדם לאחר לידה התפתחותית מ homozygous מוטציה Lamin δ 8-11 מודל העכבר, מודל חמור מאוד עבור השרירים נייל-דרייפוס ניוון שרירים (edmd).

בידוד ותרבות בודדים מודל מורנה של קבצי נייל-דרייפוס ניוון שרירים בתחילת לאחר לידה פיתוח

פרוטוקול זה מתאר בידוד של תאי גזע שריריים ואבות פיברו-אדיפוגניים משרירי שלד בודדים בעכברים. הפרוטוקול כולל דיסקציה של שריר יחיד, בידוד תאי גזע על ידי מיון תאים מופעל פלואורסצנטי, הערכת טוהר על ידי צביעה אימונופלואורסצנטית, ומדידה כמותית של כניסה לשלב S על ידי בדיקת שילוב 5-ethynyl-2'-deoxyuridine.

בידוד אוכלוסיות תאי גזע שקטים משרירי שלד בודדים

כדי להשיג פריציטים קורטיקליים במוח העכבר העומדים בדרישות scRNA-seq, אנו מציגים פרוטוקול FACS מותאם באופן קריטי המבוסס על בחירת CD13⁺/CD31⁻. השיפורים המרכזיים שלנו משפרים משמעותית את חיוניות התא ואת שלמות ה-RNA, ומאפשרים פרופיל טרנסקריפטומי אמין.

בידוד פריציטים מרקמת קורטיקת העכבר באמצעות FACS לצורך ריצוף תא יחיד

פרוטוקול זה מספק שיטה סטנדרטית לבידוד והעשרת מיובלסטים ראשוניים משרירי השלד של עכברים בוגרים ויילודים באמצעות ניתוק רקמות, סינון רציף, ציפוי מוקדם ותנאי תרבית מוגדרים, המאפשר הקמה ותחזוקה של תרביות מיובלסטים שמקורן בתאי לוויין ליישומים ניסיוניים במורד הזרם.

בידוד תאי לוויין שריר השלד למחקרי מיוגנזה במבחנה

למדו לבודד תת-אוכלוסיות של pericytes מסוג I ו-II משרירי השלד בעכברים באמצעות FACS. שיטה זו מאפשרת בידוד בו-זמני ללא שימוש ב-transgene NG2 dsRED ומסייעת בחקר הביולוגיה של pericytes.

בידוד של סוג אני ו II סוג pericytes של עכבר שרירי השלד

גלה סרטונים נוספים