בידוד של Myoblasts האדם, הערכה של בידול Myogenic, ו-מופעלות סידן מופעל מדידה

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשיג אוכלוסייה טהורה של מיובלסטים אנושיים משרירי שלד בוגרים. תאים אלה משמשים למחקרים פונקציונליים כגון הערכת התמיינות מיוגנית ומדידת כניסת סידן המופעלת בחנות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת בידוד מהיר, פשוט וניתן לשחזור של מיובלסטים ראשוניים אנושיים.

מיובלסטים אלה הם ה-ex-vivo החדש לחקר איתות הסידן במהלך התחדשות השרירים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום השרירים כגון, זיהוי הערוצים היוניים וגורמי השעתוק המעורבים במהלך התמיינות השרירים. שכן שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי תפקודי גנים במהלך התמיינות מיוגנית אנושית.

ניתן ליישם אותו גם במחקרים אחרים כגון, פוטנציאל לשימוש בתאי גזע מיוגניים לטיפול בניוון שרירים. העבירו את דגימת השריר לצלחת סטרילית של שישה סנטימטרים, שטפו את הדגימה עם PBS פעמיים. הסר את כל רקמת השומן שנותרה ושקול את הדגימה.

לאחר מכן, הוסיפו טריפסין וטחנו את השריר לחתיכות קטנות משני מילימטרים. לאחר הטחינה, השתמש בפיפטה של 10 מיליליטר כדי להעביר את הרקמה לבקבוק דיסוציאציה של 200 מיליליטר המכיל מוט ערבוב, ולאחר מכן המשך לאסוף רקמה טחונה בתמיסת טריפסין עד שבקבוק הדיסוציאציה מתמלא ל-90 מיליליטר. כעת, דגרו את הרקמה באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות תוך ערבוב עדין.

לאחר שעה מוסיפים 10 מיליליטר FCS כדי לעצור את התגובה ולהומוגניזציה של התערובת באמצעות טריטורציה. כעת, טען מסננות 70 מיקרון על שני צינורות של 50 מיליליטר והעביר מחצית ממתלה התא דרך כל מסננת על ידי הזרמת המתלה לתוך המסננים. לאחר מכן, הכינו השעיה של התאים במדיום הגידול וצלחו 200,000 תאים על צלחות של שישה סנטימטרים עם ארבעה מיליליטר של מדיום.

דגרו את הצלחות, החליפו את המדיום כל שלושה ימים. לאחר חמישה עד שבעה ימים, התאים צריכים להיות 70% עד 80%, ואז להכתים אותם. כדי להתחיל, שטפו את צלחת התאים המתכנסים עם PBS.

לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת טריפסין ותנו לאנזים לעבוד במשך שלוש דקות. עצור את התגובה על ידי הוספת שני מיליליטר מדיום ואסוף את התאים בצינור של 15 מיליליטר. לאחר מכן, סובב את התאים כלפי מטה והשהה אותם מחדש במיליליטר אחד של מדיום.

לאחר מכן, קח ספירת תאים תוך כדי אחסון התאים על קרח. לניתוח העובדות, טען שבעה צינורות עם 100,000 תאים כל אחד. טען את התאים הנותרים לצינור שמיני למיון.

שטפו את התאים עם מיליליטר אחד של מאגר פקס קר, ולאחר מכן, צנטריפוגו את הצינורות ושאבו והשליכו את הסופרנטנט. הוסף בחזרה 200 מיקרוליטר של מאגר פקס עם הנוגדנים המתאימים ותן לתאים לדגור על קרח למשך 30 דקות. לאחר 30 דקות, שטפו שוב את התאים והשעו אותם מחדש ב-500 מיקרוליטר של מאגר פקס, ולאחר מכן מיינו את התאים באמצעות ציטומטר זרימה.

לאחר אי הכללת התאים ההמטופויאטיים החיוביים CD45, הפרד את התאים השליליים CD45 על סמך ביטוי CD56. לאחר מכן, קבע את האוכלוסייה החיובית ל-CD56 עבור CD34, CD144 ו-CD146. נתח מחדש חלק מהאוכלוסייה הממוינה, כדי לבדוק את הטוהר.

כעת, משוך את המיובלסטים האנושיים ושטוף אותם בחמישה מיליליטר של מדיום. ואז השעו אותם מחדש במיליליטר אחד של מדיום. העבירו את המתלה לצלחת של שישה סנטימטרים עם ארבעה מיליליטר בינוני ודגרו את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס עם 7% פחמן דו חמצני.

לצורך הליך זה, יש לתרבת מיובלסטים וליצור מדיום טרנסבקציה טרי. דוגרים את המדיום בטמפרטורת החדר למשך 15 עד 20 דקות. במהלך הדגירה הבינונית, הכינו את המיובלסטים.

ראשית, שטפו אותם פעם אחת עם PBS. לאחר מכן, נסה את התאים הדבקים. עצור את התגובה על ידי הוספת שני מיליליטר מדיום.

לאחר מכן, אסוף את התאים לצינור של 50 מיליליטר. סובב אותם ותלה אותם מחדש במיליליטר אחד של מדיום. לכל טרנסבקציה, הכינו 500,000 תאים ב -200 מיקרוליטר מדיום.

לכל 500 מיקרוליטר של מדיום טרנסבקציה, הוסף 200 מיקרוליטר של תאים ולאחר מכן ערבב באמצעות שתי משיכות בלבד של אקדח הפיפטה. לאחר מכן, הניחו לתגובות להמשיך במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר חמש דקות, העבירו את התגובות לכלי תרבית בגודל 3.5 סנטימטרים, שכל אחד מהם מכיל תלוש כיסוי זכוכית אחד.

לאחר מכן, הוסיפו 1.3 מיליליטר בינוני לנפח סופי של שני מיליליטר ודגרו על הכלים. לאחר 48 שעות של התמיינות, ניתן לצבוע את התאים או לנתח אותם באמצעות הדמיית סידן. עבור כל אחת מהאפשרויות, ראשית יש לשטוף בזהירות את התאים פעמיים באמצעות מיליליטר אחד של PBS בטמפרטורת החדר כדי לשטוף.

נסה להימנע מניתוק ה-myotubes. להדמיית סידן, כסו את התאים השטופים בשני fura-2 AM מיקרומולרית בתוספת חומצה תראונית מיקרומולרית אחת במדיום המכיל סידן. לאחר מכן, הניחו להם לדגור כ -30 דקות לפני הערבוב.

לאחר מכן, שטפו את התאים פעמיים במדיום המכיל סידן לא שונה ולאחר מכן, דגרו אותם למשך 10 עד 15 דקות לצורך האסטריפיקציה. כעת, הסר את החלקת הכיסוי מצלחת התרבות והתקן אותה בתא הניסוי. טען את החדר במדיום המכיל סידן, הנח אותו מתחת למיקרוסקופ ולאחר מכן התחל בהקלטת הנתונים.

Fura-2 מעורר לסירוגין ב-340 ו-380 ננומטר. אור הפליטה נאסף ב-510 ננומטר. צלילה של תמונות 340 ננומטר ננומטר על ידי 380 תמונות, מספקת את יחסי התמונה מכיוון שהתנודות וריכוז הסידן נמוכים יחסית, רוכשים יחס תמונה אחד כל שתי שניות.

לאחר שתיים-שלוש דקות, החלף את המדיום במדיום נטול סידן. לאחר מכן, במשך דקה או שתיים, עקוב אחר פעילות הסידן המופעל בתאים. לאחר מכן, הוסף תפסיגרגין מיקרו-מולרי אחד לתאים כדי לרוקן את מאגרי הסידן הפנימיים שלהם.

המתן שמונה עד 10 דקות, לאחר מכן, החלף במהירות את המדיום במדיום המכיל סידן ורשום במשך חמש דקות בזמן שהסידן נכנס לתאים דרך תעלות הסוכר. לאחר סיום הניסוי, נתח את התמונות. בחר אזור שבו אין תאים לאזור אחד, המגדיר את הרקע, ולאחר מכן, בחר אזור בציטופלזמה עבור אזור שני.

ניתן לצייר את שני האזורים על כל אחת מהתמונות בסדרה. לאחר מכן, עבור ללשונית הפעל ניסויים ובחר תמונות התייחסות עבור ערוצי 340 ו-380, בחר אזור אחד ולאחר מכן לחץ על הפחת רקע. כעת, הפעל את כל הניסוי כדי להסיר את הרקע מכל התמונות.

לאחר השלמתו, לחץ על אפשרות נתוני יומן כדי לפתוח גיליון אלקטרוני שבו נרשמים נתוני הזמן והיחס. תאי השריר גדלו, הורחבו ומוינו באמצעות פקס. מיובלסטים ייצגו יותר מ-60% מהאוכלוסייה שנותחה.

לאחר מכן תורבטו המיובלסטים האנושיים העיקריים במדיום התמיינות וצבועים במערכת החיסון עבור גורם השעתוק של MEF2 וחלבוני השרשרת הכבדה של המיוזין. רוב התאים ביטאו שרשרת כבדה של מיוזין ויצרו מיוטיובים עם ערכי אינדקס היתוך של כ-60%40% הנותרים נותרו תאים חד-גרעיניים לא ממויינים, הידועים גם כתאי מילואים. ניסוי כניסת הסידן המופעל בחנות המתואר בוצע בהצלחה על התאים הממויינים.

ביצוע אותו ניסוי על תאים שהועברו עם RNA מפריע קטן, המכוון כנגד תעלות חדירות סידן ממשפחת TRPC, מראה כי לנוקדאון הייתה השפעה מדידה על כניסת הסידן המופעלת בחנות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד מיובלסטים אנושיים משרירי השלד הבוגרים. אנו משתמשים בתאים אלה כדי לחקור את השלבים העוקבים של התמיינות השרירים ובמיוחד את נטרול גורמי השעתוק ותעלות הסידן.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך פחות משלוש שעות אם היא מבוצעת כראוי. זוהי שיטה מהירה, פשוטה וניתנת לשחזור שמשיג את התפוקה של מיובלסטים אנושיים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב למנוע מתרביות המיובלסט להגיע לביטחון מלא, מכיוון שתהיה התמיינות ספונטנית לא רצויה.