Name: בידוד של Myoblasts האדם, הערכה של בידול Myogenic, ו-מופעלות סידן מופעל מדידה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: למדו לבודד מיובלסטים אנושיים משריר שלד בוגר ולהעריך בידול מיוגני וכניסת סידן מופעלת ממאגרים. שיטה זו מאפשרת בידוד מהיר ושחזור של תאים לחקר מנגנוני התחדשות שריר ותפקוד גנים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי קרן המדע הלאומית השוויצרית (מענק מס &#39;310030-166313), &quot;The Fondation Suisse pour la recherche sur les maladies musculaires&quot;, &quot;Foundation Marcel Levaillant&quot; ו- &quot;Fondation pour la recherche ostéo-articulaire&quot;.

<ol><li>Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+Cells+and+Skeletal+Muscle+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Compr+Physiol%22%5BJournal%5D)">Satellite Cells and Skeletal Muscle Regeneration.</a> Compr Physiol. 5 (3), 1027-1059 (2015).</li>
<li>Sambasivan, R., Tajbakhsh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Results+Probl+Cell+Differ%22%5BJournal%5D)">Adult skeletal muscle stem cells.</a> Results Probl Cell Differ. 56, 191-213 (2015).</li>
<li>Chen, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+blood-vessel-derived+multipotent+precursors+from+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of blood-vessel-derived multipotent precursors from human skeletal muscle.</a> J Vis Exp. (90), e51195(2014).</li>
<li>Zheng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+myogenic+stem+cells+from+cultures+of+cryopreserved+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Isolation of myogenic stem cells from cultures of cryopreserved human skeletal muscle.</a> Cell Transplant. 21 (6), 1087-1093 (2012).</li>
<li>Charville, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+Vivo+Expansion+and+In+Vivo+Self-Renewal+of+Human+Muscle+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Ex Vivo Expansion and In Vivo Self-Renewal of Human Muscle Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 5 (4), 621-632 (2015).</li>
<li>Stiber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STIM1+signalling+controls+store-operated+calcium+entry+required+for+development+and+contractile+function+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">STIM1 signalling controls store-operated calcium entry required for development and contractile function in skeletal muscle.</a> Nat Cell Biol. 10 (6), 688-697 (2008).</li>
<li>Prakriya, M., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Store-Operated+Calcium+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Store-Operated Calcium Channels.</a> Physiol Rev. 95 (4), 1383-1436 (2015).</li>
<li>Darbellay, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STIM1-+and+Orai1-dependent+store-operated+calcium+entry+regulates+human+myoblast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">STIM1- and Orai1-dependent store-operated calcium entry regulates human myoblast differentiation.</a> J Biol Chem. 284 (8), 5370-5380 (2009).</li>
<li>Darbellay, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+muscle+economy+myoblast+differentiation+and+excitation-contraction+coupling+use+the+same+molecular+partners%2C+STIM1+and+STIM2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Human muscle economy myoblast differentiation and excitation-contraction coupling use the same molecular partners, STIM1 and STIM2.</a> J Biol Chem. 285 (29), 22437-22447 (2010).</li>
<li>Nilius, B., Owsianik, G., Voets, T., Peters, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+receptor+potential+cation+channels+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Transient receptor potential cation channels in disease.</a> Physiol Rev. 87 (1), 165-217 (2007).</li>
<li>Vandebrouck, C., Martin, D., Colson-Van Schoor, M., Debaix, H., Gailly, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+TRPC+in+the+abnormal+calcium+influx+observed+in+dystrophic+%28mdx%29+mouse+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Involvement of TRPC in the abnormal calcium influx observed in dystrophic (mdx) mouse skeletal muscle fibers.</a> J Cell Bio. 158 (6), 1089-1096 (2002).</li>
<li>Antigny, F., Koenig, S., Bernheim, L., Frieden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((During+post-natal+human+myogenesis%2C+normal+myotube+size+requires+TRPC1-+and+TRPC4-mediated+Ca%282%29%28%2B%29+entry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">During post-natal human myogenesis, normal myotube size requires TRPC1- and TRPC4-mediated Ca(2)(+) entry.</a> J Cell Sci. 126 (11), 2525-2533 (2013).</li>
<li>Brinkmeier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRP+channels+in+skeletal+muscle%3A+gene+expression%2C+function+and+implications+for+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">TRP channels in skeletal muscle: gene expression, function and implications for disease.</a> Adv Exp Med Biol. 704, 749-758 (2011).</li>
<li>Pan, Z., Brotto, M., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Store-operated+Ca2%2B+entry+in+muscle+physiology+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Rep%22%5BJournal%5D)">Store-operated Ca2+ entry in muscle physiology and diseases.</a> BMB Rep. 47 (2), 69-79 (2014).</li>
<li>Lacruz, R. S., Feske, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diseases+caused+by+mutations+in+ORAI1+and+STIM1%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Diseases caused by mutations in ORAI1 and STIM1.</a> Ann N Y Acad Sci. 1356, 45-79 (2015).</li>
<li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STIM1-Ca%282%2B%29+signaling+is+required+for+the+hypertrophic+growth+of+skeletal+muscle+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">STIM1-Ca(2+) signaling is required for the hypertrophic growth of skeletal muscle in mice.</a> Mol Cell Biol. 32 (15), 3009-3017 (2012).</li>
<li>Wei-Lapierre, L., Carrell, E. M., Boncompagni, S., Protasi, F., Dirksen, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orai1-dependent+calcium+entry+promotes+skeletal+muscle+growth+and+limits+fatigue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Orai1-dependent calcium entry promotes skeletal muscle growth and limits fatigue.</a> Nat Commun. 4, 2805(2013).</li>
<li>Konig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+hyperpolarization+triggers+myogenin+and+myocyte+enhancer+factor-2+expression+during+human+myoblast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Membrane hyperpolarization triggers myogenin and myocyte enhancer factor-2 expression during human myoblast differentiation.</a> J Biol Chem. 279 (27), 28187-28196 (2004).</li>
<li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perivascular+origin+for+mesenchymal+stem+cells+in+multiple+human+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).</li>
<li>Bigot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-Associated+Methylation+Suppresses+SPRY1%2C+Leading+to+a+Failure+of+Re-quiescence+and+Loss+of+the+Reserve+Stem+Cell+Pool+in+Elderly+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Age-Associated Methylation Suppresses SPRY1, Leading to a Failure of Re-quiescence and Loss of the Reserve Stem Cell Pool in Elderly Muscle.</a> Cell Rep. 13 (6), 1172-1182 (2015).</li>
<li>Bettadapur, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+Culture+of+Aligned+Skeletal+Myotubes+on+Micromolded+Gelatin+Hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Prolonged Culture of Aligned Skeletal Myotubes on Micromolded Gelatin Hydrogels.</a> Sci Rep. 6, 28855(2016).</li>
<li>Darbellay, B., Arnaudeau, S., Bader, C. R., Konig, S., Bernheim, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STIM1L+is+a+new+actin-binding+splice+variant+involved+in+fast+repetitive+Ca2%2B+release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">STIM1L is a new actin-binding splice variant involved in fast repetitive Ca2+ release.</a> J Cell Biol. 194 (2), 335-346 (2011).</li>
<li>Sauc, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STIM1L+traps+and+gates+Orai1+channels+without+remodeling+the+cortical+ER%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">STIM1L traps and gates Orai1 channels without remodeling the cortical ER.</a> J Cell Sci. 128 (8), 1568-1579 (2015).</li>
<li>Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+measurements+in+organelles+with+Ca2%2B-sensitive+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Calcium measurements in organelles with Ca2+-sensitive fluorescent proteins.</a> Cell Calcium. 38 (3-4), 213-222 (2005).</li>
</ol>

למחברים אין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

הבידוד והתרבות של myoblasts האדם מן שריר השלד המבוגר מציע מודל במבחנה ללמוד בידול שרירים התחדשות שרירים. במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול המאפשר טיהור של תשואות גבוהות של myoblasts האדם בצורה פשוטה וחסכונית. בנוסף, טכניקה זו מספקת תוצאות אמין לשחזור במונחים של אחוז myoblasts מבודדים יעילות ההבחנה myogenic שלהם. ואכן, השגנו סביב 60% של myoblasts האדם לאחר מיון התא. תאים אלה יכולים להישמר בתרבות עד 6 מעברים (סביב 30 כפילויות) ולשמור על היכולות ...

שרירי השלד האנושיים מורכבים מקבוצות של סיבי שריר רב-תכליתיים, סינתטיים, הנובעים מאיחוי של תאים מבשר מיוגניים. שרירי השלד יש את היכולת להתחדש לאחר הפציעה תודה לנוכחות של SCS, תאי גזע שריר השלד הממוקם בין קרום הפלזמה של myofibers (sarcolemma) ואת הלמידה הבסיסית. בשרירים ללא פגע, SC הם בעיקר נוכחים במצב שקט. בתגובה ללחץ מכני או לפציעה, SC הופכים לפעילים (myoblasts), מתרבים, ועוברים תהליך הבחנה כדי ליצור מיופיבים חדשים או חידוש עצמי כדי לחדש את מאגר ה- SC 1 , 2 . במהלך השנים, מספר טכניקות פותחו כדי לבודד SCs הצאצאים שלהם, myoblasts, מן ביופסיות שריר השלד. עם הבנה גדולה יותר של פני השטח סמנים תאים הביע על תאים אלה ואת המתודולוגיה של מינון תא מופעלת הקרינה (FACS) 3, 4 , 5 , עכשיו ניתן לבודד אוכלוסיות טהור של myoblasts האדם מדגימות שרירים. סידן איתות מסדיר את התפתחות שריר השלד, הומיאוסטזיס, התחדשות. בפרט, הכניסה Ca 2 + המופעל בעקבות דלדול החנות תאיים, הנקראים SOCE, הוא בעל חשיבות רבה 6 עבור תהליכים אלה. לאחר גירוי התא, רמת Ca 2 + ב reticulum endo / sarcoplasmic (ER / SR) פוחתת, אשר בתורו מפעילה ממברנה פלזמה Ca 2 + ערוצים המאפשרים Ca 2 + כניסה למלא את ER / SR 7 . שני חלבונים עיקריים המעורבים SOCE הם ER / SR Ca 2 + -חישה מולקולת אינטראקציה סטרומה 1 (STIM1) חלבון הממברנה פלזמה Ca 2 + ערוץ Orai1. שריר השלד מבטא בשפע את שני החלבונים הללו, כמו גם חלבונים אחרים של אותן משפחות (STIM2Ora Orai2-Orai3) 8 , 9 ו כמה קה 2 + ערוצי לערוץ של קולטן חולף פוטנציאלי (TRPC) משפחה 10 , 11 , 12 , 13 . Ca 2 + כניסה דרך מסלול SOCE הוא בעל חשיבות רבה עבור היווצרות שריר / התחדשות 14 . מוטציות של חלבונים STIM1 או Orai1 יש השפעות מזיקות על תפקוד השרירים, המוביל בעיקר לשריר היפוטוניה 15 . מודלים בעלי חיים עם ליקוי SOCE גם להציג מסת שרירים מופחת כוח, יחד עם עייפות משופרת 6 , 16 , 17 . כאמור, חלבונים אחרים של STIM ו- Orai, כמו גם ערוצי TRPC רבים, מתבטאים בשרירי השלד, ותפקידים אלה לא נקבעו עד כה. על ידי דפיקות דמשלו רמת הביטוי שלהם, ולכן ניתן לחקור את ההשלכות שלהם ב- SOCE ואת תפקידיהם במהלך בידול שריר השלד האנושי. המדידה SOCE ניתן לבצע באמצעות שתי גישות שונות: הקלטות הנוכחי אלקטרו ו Ca 2 + מדידות. Electrophysiology הוא בהחלט שיטה ישירה יותר, כפי שהיא מודדת את הנוכחי של עניין וחתימה אלקטרופיזיולוגי הקשורים אליו. עם זאת, טכניקה זו קשה מאוד להחיל על תאי השריר, בעיקר בגלל גודל גדול של תאי שריר וגודל קטן של הנוכחי SOCE אנדוגני. Cytosolic Ca 2 + הדמיה היא טכנית מאוד נגיש, אבל המדד הוא יותר עקיף, כמו Ca 2 + רמת נמדדת cytosol משקף הן את כניסת Ca 2 + ואת שאיבה מחדש מתוך התא או בחנויות הפנימיות. מתודולוגיה הכוללת בידוד myoblasts מ חתיכות קטנות של skel האדםשריר etal לאחר עיכול אנזימטי, הגברה, FACS מוסבר במאמר זה. תהליך של בידול שרירים ואת פרוטוקול immunofluorescence לעקוב אחר הביטוי של סמנים בידול לאורך זמן מתוארים 18 . לבסוף, המדידה של SOCE ואת התפקיד של ערוצי יון שונים Ca 2 + איתות והבחנה שריר השלד מוסברים.

<table><tbody><tr><td>בשר חזיר s F10</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31550-023</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10270-106</td><td>Lot 41G5532K</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>O5482</td><td></td></tr><tr><td>fetuin</td><td>Sigma</td><td>F3385</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Corning</td><td>354001</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethansone</td><td>Sigma</td><td>D1756</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>קריאטין</td><td>סיגמא</td><td>27900</td><td></td></tr><tr><td>פירובט</td><td>סיגמא</td><td>P4562</td><td></td></tr><tr><td>אורידין</td><td>סיגמא</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15710-049</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין-EDTA 0.05%</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; מסננת תאים m</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; מסננת תאים m</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50&nbsp; צינור מ"ל</td><td>פלקון</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>פלקון 15&nbsp; צינור מ"ל</td><td>פלקון</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>פלקון 5&nbsp; צינור מ"ל (FACS)</td> <td>פלקון</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>מדיום תרבית: OPTI-MEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985-047</td><td></td></tr><tr><td>Transfectant reagnt: RNAiMax</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1756064</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>הרכבה בינונית</td><td>Fluka</td><td>10981</td><td></td></tr><tr><td>עכבר אנטי-MyHC *</td><td>DSHB</td><td>MF20&nbsp;</td><td>להתרכז</td></tr><tr><td>עכבר אנטי מיוגנין</td><td>BD Pharmigen</td><td>556358</td><td></td></tr><tr><td>ארנב אנטי MEF2</td><td>סנטה קרוז ביוטק</td><td>C-21</td><td></td></tr><tr><td>עז נגד עכבר Alexa488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>עז נגד ארנב Alexa 546</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A11035</td><td></td></tr><tr><td>עכבר אנטי אנושי CD56-Alexa488</td><td>BD Pharmingen</td><td>557699</td><td></td></tr><tr><td>עכבר אנטי אנושי CD146-PECy7</td><td>BD Pharmingen</td><td>562135</td><td></td></tr><tr><td>עכבר אנטי אנושי CD45-PE-CF594</td><td>BD Pharmingen</td><td>562279</td><td></td></tr><tr><td>עכבר אנטי אנושי CD34-APC</td><td>BD Pharmingen</td><td>345804</td><td></td></tr><tr><td>עכבר אנטי אנושי CD144-PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>560410</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 עכבר IgG1k</td><td>BD Pharmingen</td><td>557702</td><td></td></tr><tr><td>PECy7 עכבר IgG1k</td><td>BD Pharmingen</td><td>557872</td><td></td></tr><tr><td>PE-CF594 עכבר IgG1k</td><td>BD Pharmingen</td><td>562292</td><td></td></tr><tr><td>APC עכבר IgG1k</td><td>BD Pharmingen</td><td>550854</td><td></td></tr><tr><td>PE עכבר IgG1k</td><td>BD Pharmingen</td><td>556650</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>זהירות:&nbsp; תרכובת רעילה</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Fluka</td><td>762400</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F1201</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Sigma</td><td>T9033</td><td>זהירות&nbsp;: תרכובת רעילה&nbsp;</td></tr><tr><td>תוכנת רכישת הדמיה יחסית: Metafluor 6.3</td><td>Molecular Device</td><td></td><td></td></tr><tr><td>*&nbsp;: MF 20 הופקד ב-DSHB על ידי פישמן, D.A.&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד של myoblasts האדם, הערכה של בידול myogenic, ו-מופעלות סידן מופעל מדידה

Isolation of Human Myoblasts, Assessment of Myogenic Differentiation, and Store-operated Calcium Entry Measurement

תאי הלוויין (SC) הם תאי גזע שרירים הממוקמים בין קרום הפלזמה של סיבי השריר לבין הלמינה הבסיסית. הם חיוניים עבור התחדשות שריר. עם פגיעה, אשר מתרחשת לעתים קרובות בשרירי השלד, SCs מופעלים. הם מתרבים כמו myoblasts ולהבדיל לתקן נגעים שרירים. בין אירועים רבים המתרחשים במהלך בידול השריר, cytosolic Ca 2 + אותות הם בעלי חשיבות רבה. אלה Ca 2 + אותות נובעים Ca 2 + שחרור מ הפנימי Ca 2 + חנויות, כמו גם מ Ca 2 + כניסה מהחלל תאיים, במיוחד את החנות המופעלות Ca 2 + כניסה (SOCE). מאמר זה מתאר מתודולוגיה המשמשת כדי להשיג אוכלוסייה טהורה של myoblasts האדם מדגימות שריר שנאספו לאחר ניתוח אורתופדי. הרקמה היא מתעכל מכנית אנזימטית, ואת התאים הם מוגבר ולאחר מכן מיון על ידי cytometry הזרימה על פי נוכחות של speciסמני קרום. לאחר שהושג, myoblasts האדם מורחבים ומחויבים להבדיל על ידי הסרת גורמי גדילה מן המדיום התרבות. רמות הביטוי של גורמים שעתוק ספציפיים ב immunosluorescence חוץ גופית משמשים כדי להעריך את תהליך בידול myogenic בתנאי שליטה לאחר השתקת חלבונים המעורבים Ca 2 + איתות. לבסוף, אנו מפרטים את השימוש Fura-2 כמו ratiometric Ca 2 + בדיקה המספק מדידות אמין לשחזור של SOCE.

לאחר הדיסוציאציה האנזימטית של דגימת שריר אנושית, התאים גדלו ב- GM. מיובלסטים אנושיים, שהוגדרו כתאי CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-, התקבלו לאחר FACS. Myoblasts ייצג יותר מ 60% של האוכלוסייה נותחו ( איור 1 ). ראשי myoblasts האדם הוחזרו, גדל המפגש, ותרבותי DM במשך 48 שעות. לאחר immunostaining עבור הביטוי של גורם שעתוק MEF2 ואת שריר ספציפי חלבון שרשרת כבדה (MyHC), ראינו כי רוב התאים יצרו myotubes במבחנה (תאים MyHC חיובי), עם ערכי אינדק...

כאן, אנו מתארים מתודולוגיה כדי להשיג אוכלוסייה טהורה של myoblasts האדם מן רקמת שריר בוגר. תאים אלה משמשים ללמוד בידול שריר השלד במבחנה , בפרט, ללמוד חלבונים המעורבים Ca 2 + איתות.

בידוד של Myoblasts האדם, הערכה של בידול Myogenic, ו-מופעלות סידן מופעל מדידה

Satellite cells (SC) are muscle stem cells located between the plasma membrane of muscle fibers and the surrounding basal lamina. They are essential for ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להשיג אוכלוסייה טהורה של מיובלסטים אנושיים משריר שלם של מבוגר. תאים אלו משמשים למחקרים פונקציונליים, כגון הערכה של דיפרנציאציה מיוגנית ומדידה של כניסת סידן המופעלת על ידי מאגרים (store-operated calcium entry). היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת בידוד מהיר, פשוט וניתן לשחזור של מיובלסטים ראשוניים אנושיים.מיובלסטים אלו מהווים מודל ex-vivo חדש לחקר אותות סידן במהלך התחדשות שרירים. שיטה זו עשויה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום השרירים, כגון זיהוי התעלות היוניות וגורמי השעתוק המעורבים במהלךהתמיינות שרירים. בדרך זו, השיטה יכולה לספק תובנות לגבי תפקודי גנים במהלך התמיינות מיוגנית אנושית.ניתן להחיל זאת גם על מחקרים אחרים, כגון הפוטנציאל לשימוש בתאי גזע מיוגניים לטיפול בדיסטרופיות של השרירים. העבירו את דגימת השריר לפלטה סטרילית של ששה סנטימטרים, ושטפו את הדגימה עם PBS פעמיים. הסירו כל רקמת שומן שנותרה ושקלו את הדגימה.בשלב הבא, הוסיפו trypsin וקצצו את השריר לחלקים קטנים מגודל של שני מילימטרים. לאחר הקיצוץ, השתמשו בפיפט של 10 milliliter כדי להעביר את הרקמה לבקבוק דיסוציאציה של 200 milliliter המכיל מגנט ערבוב, ולאחר מכן המשיכו לאסוף רקמה מקוצצת בתמיסת trypsin עד שבקבוק הדיסוציאציה יתמלא ל-90 milliliters. כעת, הדגירו את הרקמה במקלחת במעלה של 37 degrees celsius למשך 60 דקות תוך ערבוב עדין.לאחר שעה, הוסף 10 milliliters של FCS כדי לעצור את התגובה והומוגניז את התערובת באמצעות טריטורציה. כעת, העמד מסננים של 70 micron על שני מבחנות של 50 milliliter והעבר חצי מתליה התאים דרך כל מסנן על ידי פיפטינג של התליה אל תוך המסננים. לאחר מכן, הכן תליה של התאים במצע גידול וזראה 200,000 תאים על צלחות של שישה סנטימטר עם 4 milliliters של מצע.דגרו את הפלטות, והחליפו את המצע בכל שלושה ימים. לאחר חמישה עד שבעה ימים, התאים צריכים להגיע ל-70% עד 80% התמזגות (confluency), ולאחר מכן צבעו אותם. לתחילת הפעולה, שטפו את הפלטה עם תאי התמזגות באמצעות PBS.לאחר מכן, הוסיפו 1 mL של תמיסת trypsin והניחו לאנזים לפעול במשך שלוש דקות. עצרו את התגובה על ידי הוספת 2 mL של מצע (medium) ואספו את התאים לשפופרת של 15 mL. לאחר מכן, סבבו את התאים בצנטריפוגה ושחזרו אותם ב-1 mL של מצע.בשלב הבא, בצעו ספירת תאים תוך שמירת התאים על קרח. לצורך ניתוח העובדות, העבירו לשבעה מבחנות 100,000 תאים לכל אחת. העבירו את שאר התאים למבחנה שמינית לצורך מיון.שטפו את התאים עם 1 ml של תמיסת fax קרה, לאחר מכן, סובבו את המבחנות בצנטריפוגה ושאבו והשליכו את העליון (supernatant). הוסיפו בחזרה 200 µL של תמיסת fax עם הנוגדנים המתאימים והשאירו את התאים לדגירה על קרח למשך 30 דקות. לאחר 30 דקות, שטפו שוב את התאים והשאיבו אותם מחדש ב-500 µL של תמיסת fax, ולאחר מכן מיינו את התאים באמצעות ציטומטר זרימה (flow cytometer).לאחר החרגת תאי המטופוייז חיוביים ל-CD45, הפר את התאים השליליים ל-CD45 על בסיס ביטוי של CD56. לאחר מכן, בצע גייטינג (gate) לאוכלוסייה החיובית ל-CD56 עבור CD34, CD144 ו-CD146. נתח מחדש חלק מהאוכלוסייה המומחרת כדי לבדוק את רמת הטוהר.כעת, הוציאו את המיובלסטים האנושיים ושטפו אותם עם 5 mL של מצע. לאחר מכן, השהו אותם שוב ב-1 mL של מצע. העבירו את התו suspension לצלחת של 6 cm עם 4 mL של מצע והדגירו את הצלחת ב-37 °C עם 7% CO2.עבור הליך זה, הכינו מיובלסטים מתורבת והכינו מצע טרנסווקציה (transvection) טרי. דגרו את המצע בטמפרטורת החדר למשך 15 עד 20 דקות. במהלך דגירת המצע, הכינו את המיובלסטים.ראשית, שטפו אותם פעם אחת עם PBS. לאחר מכן, בצעו טריפסינזציה לתאים הדבקים. עצרו את התגובה על ידי הוספת שני מיליליטר של מצע גידול.לאחר מכן, אספו את התאים לשפופרת של 50 מ"ל. סבבו אותם בצנטריפוגה ותלו אותם מחדש ב-1 מיליליטר של מדיום. עבור כל טרנספקציה, הכינו 500,000 תאים ב-200 מיקרוליטר של מדיום.לכל 500 microliters של תווך טרנסווקציה, הוסף מנה של 200 microliter של תאים ולאחר מכן ערבב באמצעות שתי תנועות בלבד של הפיפט. לאחר מכן, הנח לתגובות להתקיים במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר חמש דקות, העבר את התגובות לכלי תרבית בנפח 3.5 centimeter, שכל אחד מהם מכיל כיסוי זכוכית אחד.בשלב הבא, הוסיפו 1.3 milliliters של מצע לנפח סופי של 2 milliliters והדגירו את הצלחות. לאחר 48 שעות של דיפרנציאציה, ניתן לצבוע את התאים בצביעה אימונוהיסטוכימית או לנתח אותם באמצעות דימוי סידן. עבור כל אחת מהאפשרויות, שטפו תחילה את התאים בזהירות פעמיים באמצעות 1 milliliter של PBS בטמפרטורת החדר לשטיפה.נסו להימנע מהסרת המיוטובים (myotubes) מהמצע. לצורך דימות סידן, כסו את התאים השטופים ב-2 µM של fura-2 AM בתוספת 1 µM של threonic acid בתווך המכיל סידן. לאחר מכן, השאירו אותם לדגירה למשך כ-30 דקות לפני הערבוב.בשלב הבא, שטפו את התאים פעמיים במצע המכיל סידן ללא שינויים, ולאחר מכן הדגירו אותם למשך 10 עד 15 דקות לצורך האסטריפיקציה. כעת, הסירו את זכוכית הכיסוי מלוח התרבית והתקינו אותה בתא הניסוי. מלאו את התא במצע המכיל סידן, הניחו אותו תחת מיקרוסקופ, ולאחר מכן התחילו בהקלטת הנתונים.Fura-2 מעורר לסירוגין באורכי גל של 340 ו-380 ננומטר. האור הפלוט נאסף ב-510 ננומטר. חלוקת התמונות באורך גל של 340 ננומטר בתמונות ב-380 ננומטר מספקת את יחסי התמונות; מאחר והתנודות וריכוז הסידן נמוכים יחסית, רכוש יחס תמונה אחד מדי שתי שניות.לאחר שתי או שלוש דקות, החליפו את המצע במצע נטול סידן. לאחר מכן, במשך דקה אחת או שתיים, עקבו אחר הפעילות של תעלות הסידן המופעלות על ידי מאגרים (SOCs) בתאים. לאחר מכן, הוסיפו לתאים Thapsigargin בריכוז של 1 µM כדי לרוקן את מאגרי הסידן הפנימיים שלהם.המתינו שמונה עד 10 דקות, לאחר מכן, החליפו במהירות את המצע במצע המכיל סידן והקליטו למשך חמש דקות בזמן שהסידן חודר לתאים דרך תעלות suc e. לאחר סיום הניסוי, נתחו את התמונות. בחרו אזור שבו אין תאים עבור אזור 1, המגדיר את הרקע, ולאחר מכן בחרו אזור בציטופלזמה עבור אזור 2.ניתן לסמן את שני האזורים על כל אחת מהתמונות בסדרה. לאחר מכן, עברו ללשונית run experiments ובחרו תמונות ייחוס עבור הערוצים 340 ו-380, בחרו באזור one, ולאחר מכן לחצו על subtract background. כעת, הריצו את הניסוי כולו כדי להסיר את הרקע מכל התמונות.עם סיום הפעולה, לחץ על אפשרות רישום הנתונים (log data) כדי לפתוח גיליון אלקטרוני שבו נרשמים נתוני הזמן והיחסים. תאי שריר גודלו, הורחבו ומוינו באמצעות fax. מיובלסטים ייצגו יותר מ-60% מהאוכלוסייה שנותחה.המיובלסטים האנושיים הראשוניים תורגדו לאחר מכן במצע דיפרנציאציה ונצבעו אימונוהיסטוכימית עבור גורם השעתוק MEF2 וחלבוני שרשרת כבדה של מיוזין. רוב התאים ביטאו שרשרת כבדה של מיוזין ויצרו מיוטובים עם ערכי מדד היתוך של כ-60% המצב שבו 40% הנותרים של התאים נותרו תאים חד-גרעיניים לא מובחנים, הידועים גם כתאי רזרבה. ניסוי כניסת הסידן המופעל על ידי מאגרי הסידן שתואר בוצע בהצלחה בתאים המובחנים.ביצוע אותו ניסוי על תאים שעברו טרנספקציה של RNA מפריע קטן (small interfering RNA), המכוון נגד תעלות חדירות לסידן ממשפחת ה-TRPC, מראה כי להשתקת הגן (knockdown) הייתה השפעה מדידה על כניסת סידן המופעלת על ידי מאגרים (store operated calcium entry). לאחר צפייה בסרטון זה, תרכישו הבנה טובה לגבי אופן בידודם של מיובלאסטים אנושיים משריר שלד של מבוגר. אנו משתמשים בתאים אלה כדי לחקור את השלבים העוקבים של התמיינות שרירים ובמיוחד את דה-אקטיבציית גורמי השעתוק ותעלות הסידן.לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה בפחות משלוש שעות אם היא מבוצעת כראוי. זוהי שיטה מהירה, פשוטה וניתנת לשחזור להשגת תנובה של מיובלאסטים אנושיים. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב למנוע מתרביות המיובלאסטים להגיע לצפיפות מלאה, שכן הדבר יוביל לדיפרנציאציה ספונטנית לא רצויה.

isolation-human-myoblasts-assessment-myogenic-differentiation-store

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

הקרינה מבוסס מדידה הכניסה חנות המופעל הסידן בתאים חיים: מתא הסרטן תרבותי כדי סיב שריר שלד

כאן אנו מתארים את הבידוד של cardiomyoctyes עכבר המבוגר באמצעות מערכת זלוף Langendorff. תאים וכתוצאה מכך הם Ca2 +, סובלניים, חשמלי שקט ויכולים להיות מתורבת וtransfected עם אדנו או lentiviruses כדי לתפעל ביטוי גנים. הפונקציונליות שלהם יכולה גם להיות מנותחת באמצעות מערכת MMSYS וטכניקות תיקון מהדק.

בידוד, תרבות ואפיון פונקציונלי של Cardiomyoctyes מאוס למבוגרים

סוגי התאים הדבקים העיקריים שמקורם בשריר אנושי הם תאים מיוגניים ופיברובלסטים. כאן, אוכלוסיות התאים מועשרות באמצעות מיון תאים מופעל מגנטי המבוסס על אנטיגן CD56. תיוג חיסוני לאחר מכן עם נוגדנים ספציפיים ושימוש בטכניקות ניתוח תמונה מאפשר כימות של מאפיינים ציטופלזמיים וגרעיניים בתאים בודדים.

בידוד וכמוני Immunocytochemical אפיון של תאים ראשוניים myogenic וFibroblasts משרירי שלד אדם

תאי שריר הם בין התאים האיקריוטיים המורכבים ביותר. אנו מציגים פרוטוקול להתמיינות חוץ גופית של סיבי שריר בוגרים מאוד המאפשר מניפולציה גנטית והדמיה ברורה בכל שלבי ההתפתחות.

במבחנת הבידול של בוגרות Myofibers עבור הדמיה חיה

מיאוברוב הם מתרבים תאים מקודכי להבדיל לטופס מיונוקלאוטים מיופולימרים ובסופו של דבר שריר השלד סיבים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור בידוד יעיל והתרבות של myoblasts חזיקה הראשוני של השרירים העכבר המבוגר הצעיר. השיטה מאפשרת מחקרים מולקולריים, גנטיים ומטבוליים של תאי שריר בתרבות.

בידוד והבידול של מכשולים ראשוניים מתוך שריר השלד של העכבר Explants

מוצג הוא פרוטוקול לבידוד של קרדיומיוציטים חדריים אנושיים ובעלי חיים מפרוסות שריר הלב לחתוך vibratome. תפוקות גבוהות של תאים סובלניים סידן (עד 200 תאים / מ"ג) ניתן להשיג כמויות קטנות של רקמה (&lt;50 מ"ג). הפרוטוקול ישים על שריר הלב החשוף לאישמיה קרה עד 36 שעות.

בידוד של קרדיומיוציטים חדריים אנושיים מפרוסות שריר הלב ויסטום-לחתוך

מודלים עכבריים מאפשרים ללמוד מנגנוני מפתח של arrhythmogenesis. לשם כך, קרדיומיוציטים באיכות גבוהה נחוצים לביצוע מדידות מהדק תיקון. כאן מתוארת שיטה לבידוד מיוציטים פרוזדוריים וחדרי מורין באמצעות זילוח לנגנדורף מבוסס אנזים מדרדר, המאפשר מדידות בו זמנית של סידן חולף וזרם סידן מסוג L.

בידוד מיוציטים פרוזדוריים וחדריים באיכות גבוהה למדידות בו זמנית של Ca2+ Transients וזרם סידן מסוג L

כאן שיטות המשמשות כדי ללמוד את ההשפעה התפקודית של מוטציות RYR1 בא לידי ביטוי אנדוגני וירוס אפשטיין בר מונצח B-לימפוציטים, ביופסיה שריר נגזר תאי לווין המובחנים myotubes מתוארים.

אפיון פונקציונלי של גרסאות RYR1 אנושיות מבוטאות אנדוגניות

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט לייצור מערכים של מיקרוטיסות שרירי השלד האנושיים בתלת-ממד ופולשניות מינימלית במורד הזרם בתקיפות תפקודיות, כולל כוח התכווצות ניתוחי טיפול בסידן.

הערכת מדדים תפקודיים של בריאות שריר השלד במיקרוטיסוסות שריר השלד האנושי

אנו מתארים פרוטוקול לקבלת סיבים מנותקים אנזימטית באורכים וסוגים שונים משישה שרירים של עכברים בוגרים: שלושה מהם כבר תוארו (flexor digitorum brevis, extensor digitorum longus, soleus) ושלושה מהם נותקו בהצלחה בפעם הראשונה (extensor hallucis longus, peroneus longus, peroneus digiti quarti).

סיבי שריר שלד שלמים קצרים, בינוניים וארוכים המתקבלים על ידי דיסוציאציה אנזימטית של שישה שרירי גפיים אחוריות של עכברים: Beyond Flexor Digitorum Brevis

פרוטוקול זה מספק שיטה סטנדרטית לבידוד והעשרת מיובלסטים ראשוניים משרירי השלד של עכברים בוגרים ויילודים באמצעות ניתוק רקמות, סינון רציף, ציפוי מוקדם ותנאי תרבית מוגדרים, המאפשר הקמה ותחזוקה של תרביות מיובלסטים שמקורן בתאי לוויין ליישומים ניסיוניים במורד הזרם.

בידוד תאי לוויין שריר השלד למחקרי מיוגנזה במבחנה

למדו לבודד מיובלסטים אנושיים משריר שלד בוגר ולהעריך בידול מיוגני וכניסת סידן מופעלת ממאגרים. שיטה זו מאפשרת בידוד מהיר ושחזור של תאים לחקר מנגנוני התחדשות שריר ותפקוד גנים.

בידוד של Myoblasts האדם, הערכה של בידול Myogenic, ו-מופעלות סידן מופעל מדידה

גלה סרטונים נוספים