Name: בידוד של Myoblasts האדם, הערכה של בידול Myogenic, ו-מופעלות סידן מופעל מדידה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: למדו לבודד מיובלסטים אנושיים משריר שלד בוגר ולהעריך בידול מיוגני וכניסת סידן מופעלת ממאגרים. שיטה זו מאפשרת בידוד מהיר ושחזור של תאים לחקר מנגנוני התחדשות שריר ותפקוד גנים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי קרן המדע הלאומית השוויצרית (מענק מס &#39;310030-166313), &quot;The Fondation Suisse pour la recherche sur les maladies musculaires&quot;, &quot;Foundation Marcel Levaillant&quot; ו- &quot;Fondation pour la recherche ostéo-articulaire&quot;.

<ol><li>Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+Cells+and+Skeletal+Muscle+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Compr+Physiol%22%5BJournal%5D)">Satellite Cells and Skeletal Muscle Regeneration.</a> Compr Physiol. 5 (3), 1027-1059 (2015).</li>
<li>Sambasivan, R., Tajbakhsh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Results+Probl+Cell+Differ%22%5BJournal%5D)">Adult skeletal muscle stem cells.</a> Results Probl Cell Differ. 56, 191-213 (2015).</li>
<li>Chen, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+blood-vessel-derived+multipotent+precursors+from+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of blood-vessel-derived multipotent precursors from human skeletal muscle.</a> J Vis Exp. (90), e51195(2014).</li>
<li>Zheng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+myogenic+stem+cells+from+cultures+of+cryopreserved+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Isolation of myogenic stem cells from cultures of cryopreserved human skeletal muscle.</a> Cell Transplant. 21 (6), 1087-1093 (2012).</li>
<li>Charville, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+Vivo+Expansion+and+In+Vivo+Self-Renewal+of+Human+Muscle+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Ex Vivo Expansion and In Vivo Self-Renewal of Human Muscle Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 5 (4), 621-632 (2015).</li>
<li>Stiber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STIM1+signalling+controls+store-operated+calcium+entry+required+for+development+and+contractile+function+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">STIM1 signalling controls store-operated calcium entry required for development and contractile function in skeletal muscle.</a> Nat Cell Biol. 10 (6), 688-697 (2008).</li>
<li>Prakriya, M., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Store-Operated+Calcium+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Store-Operated Calcium Channels.</a> Physiol Rev. 95 (4), 1383-1436 (2015).</li>
<li>Darbellay, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STIM1-+and+Orai1-dependent+store-operated+calcium+entry+regulates+human+myoblast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">STIM1- and Orai1-dependent store-operated calcium entry regulates human myoblast differentiation.</a> J Biol Chem. 284 (8), 5370-5380 (2009).</li>
<li>Darbellay, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+muscle+economy+myoblast+differentiation+and+excitation-contraction+coupling+use+the+same+molecular+partners%2C+STIM1+and+STIM2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Human muscle economy myoblast differentiation and excitation-contraction coupling use the same molecular partners, STIM1 and STIM2.</a> J Biol Chem. 285 (29), 22437-22447 (2010).</li>
<li>Nilius, B., Owsianik, G., Voets, T., Peters, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+receptor+potential+cation+channels+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Transient receptor potential cation channels in disease.</a> Physiol Rev. 87 (1), 165-217 (2007).</li>
<li>Vandebrouck, C., Martin, D., Colson-Van Schoor, M., Debaix, H., Gailly, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+TRPC+in+the+abnormal+calcium+influx+observed+in+dystrophic+%28mdx%29+mouse+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Involvement of TRPC in the abnormal calcium influx observed in dystrophic (mdx) mouse skeletal muscle fibers.</a> J Cell Bio. 158 (6), 1089-1096 (2002).</li>
<li>Antigny, F., Koenig, S., Bernheim, L., Frieden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((During+post-natal+human+myogenesis%2C+normal+myotube+size+requires+TRPC1-+and+TRPC4-mediated+Ca%282%29%28%2B%29+entry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">During post-natal human myogenesis, normal myotube size requires TRPC1- and TRPC4-mediated Ca(2)(+) entry.</a> J Cell Sci. 126 (11), 2525-2533 (2013).</li>
<li>Brinkmeier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRP+channels+in+skeletal+muscle%3A+gene+expression%2C+function+and+implications+for+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">TRP channels in skeletal muscle: gene expression, function and implications for disease.</a> Adv Exp Med Biol. 704, 749-758 (2011).</li>
<li>Pan, Z., Brotto, M., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Store-operated+Ca2%2B+entry+in+muscle+physiology+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Rep%22%5BJournal%5D)">Store-operated Ca2+ entry in muscle physiology and diseases.</a> BMB Rep. 47 (2), 69-79 (2014).</li>
<li>Lacruz, R. S., Feske, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diseases+caused+by+mutations+in+ORAI1+and+STIM1%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Diseases caused by mutations in ORAI1 and STIM1.</a> Ann N Y Acad Sci. 1356, 45-79 (2015).</li>
<li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STIM1-Ca%282%2B%29+signaling+is+required+for+the+hypertrophic+growth+of+skeletal+muscle+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">STIM1-Ca(2+) signaling is required for the hypertrophic growth of skeletal muscle in mice.</a> Mol Cell Biol. 32 (15), 3009-3017 (2012).</li>
<li>Wei-Lapierre, L., Carrell, E. M., Boncompagni, S., Protasi, F., Dirksen, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orai1-dependent+calcium+entry+promotes+skeletal+muscle+growth+and+limits+fatigue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Orai1-dependent calcium entry promotes skeletal muscle growth and limits fatigue.</a> Nat Commun. 4, 2805(2013).</li>
<li>Konig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+hyperpolarization+triggers+myogenin+and+myocyte+enhancer+factor-2+expression+during+human+myoblast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Membrane hyperpolarization triggers myogenin and myocyte enhancer factor-2 expression during human myoblast differentiation.</a> J Biol Chem. 279 (27), 28187-28196 (2004).</li>
<li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perivascular+origin+for+mesenchymal+stem+cells+in+multiple+human+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).</li>
<li>Bigot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-Associated+Methylation+Suppresses+SPRY1%2C+Leading+to+a+Failure+of+Re-quiescence+and+Loss+of+the+Reserve+Stem+Cell+Pool+in+Elderly+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Age-Associated Methylation Suppresses SPRY1, Leading to a Failure of Re-quiescence and Loss of the Reserve Stem Cell Pool in Elderly Muscle.</a> Cell Rep. 13 (6), 1172-1182 (2015).</li>
<li>Bettadapur, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+Culture+of+Aligned+Skeletal+Myotubes+on+Micromolded+Gelatin+Hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Prolonged Culture of Aligned Skeletal Myotubes on Micromolded Gelatin Hydrogels.</a> Sci Rep. 6, 28855(2016).</li>
<li>Darbellay, B., Arnaudeau, S., Bader, C. R., Konig, S., Bernheim, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STIM1L+is+a+new+actin-binding+splice+variant+involved+in+fast+repetitive+Ca2%2B+release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">STIM1L is a new actin-binding splice variant involved in fast repetitive Ca2+ release.</a> J Cell Biol. 194 (2), 335-346 (2011).</li>
<li>Sauc, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STIM1L+traps+and+gates+Orai1+channels+without+remodeling+the+cortical+ER%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">STIM1L traps and gates Orai1 channels without remodeling the cortical ER.</a> J Cell Sci. 128 (8), 1568-1579 (2015).</li>
<li>Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+measurements+in+organelles+with+Ca2%2B-sensitive+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Calcium measurements in organelles with Ca2+-sensitive fluorescent proteins.</a> Cell Calcium. 38 (3-4), 213-222 (2005).</li>
</ol>

למחברים אין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

הבידוד והתרבות של myoblasts האדם מן שריר השלד המבוגר מציע מודל במבחנה ללמוד בידול שרירים התחדשות שרירים. במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול המאפשר טיהור של תשואות גבוהות של myoblasts האדם בצורה פשוטה וחסכונית. בנוסף, טכניקה זו מספקת תוצאות אמין לשחזור במונחים של אחוז myoblasts מבודדים יעילות ההבחנה myogenic שלהם. ואכן, השגנו סביב 60% של myoblasts האדם לאחר מיון התא. תאים אלה יכולים להישמר בתרבות עד 6 מעברים (סביב 30 כפילויות) ולשמור על היכולות ...

שרירי השלד האנושיים מורכבים מקבוצות של סיבי שריר רב-תכליתיים, סינתטיים, הנובעים מאיחוי של תאים מבשר מיוגניים. שרירי השלד יש את היכולת להתחדש לאחר הפציעה תודה לנוכחות של SCS, תאי גזע שריר השלד הממוקם בין קרום הפלזמה של myofibers (sarcolemma) ואת הלמידה הבסיסית. בשרירים ללא פגע, SC הם בעיקר נוכחים במצב שקט. בתגובה ללחץ מכני או לפציעה, SC הופכים לפעילים (myoblasts), מתרבים, ועוברים תהליך הבחנה כדי ליצור מיופיבים חדשים או חידוש עצמי כדי לחדש את מאגר ה- SC 1 , 2 . במהלך השנים, מספר טכניקות פותחו כדי לבודד SCs הצאצאים שלהם, myoblasts, מן ביופסיות שריר השלד. עם הבנה גדולה יותר של פני השטח סמנים תאים הביע על תאים אלה ואת המתודולוגיה של מינון תא מופעלת הקרינה (FACS) 3, 4 , 5 , עכשיו ניתן לבודד אוכלוסיות טהור של myoblasts האדם מדגימות שרירים. סידן איתות מסדיר את התפתחות שריר השלד, הומיאוסטזיס, התחדשות. בפרט, הכניסה Ca 2 + המופעל בעקבות דלדול החנות תאיים, הנקראים SOCE, הוא בעל חשיבות רבה 6 עבור תהליכים אלה. לאחר גירוי התא, רמת Ca 2 + ב reticulum endo / sarcoplasmic (ER / SR) פוחתת, אשר בתורו מפעילה ממברנה פלזמה Ca 2 + ערוצים המאפשרים Ca 2 + כניסה למלא את ER / SR 7 . שני חלבונים עיקריים המעורבים SOCE הם ER / SR Ca 2 + -חישה מולקולת אינטראקציה סטרומה 1 (STIM1) חלבון הממברנה פלזמה Ca 2 + ערוץ Orai1. שריר השלד מבטא בשפע את שני החלבונים הללו, כמו גם חלבונים אחרים של אותן משפחות (STIM2Ora Orai2-Orai3) 8 , 9 ו כמה קה 2 + ערוצי לערוץ של קולטן חולף פוטנציאלי (TRPC) משפחה 10 , 11 , 12 , 13 . Ca 2 + כניסה דרך מסלול SOCE הוא בעל חשיבות רבה עבור היווצרות שריר / התחדשות 14 . מוטציות של חלבונים STIM1 או Orai1 יש השפעות מזיקות על תפקוד השרירים, המוביל בעיקר לשריר היפוטוניה 15 . מודלים בעלי חיים עם ליקוי SOCE גם להציג מסת שרירים מופחת כוח, יחד עם עייפות משופרת 6 , 16 , 17 . כאמור, חלבונים אחרים של STIM ו- Orai, כמו גם ערוצי TRPC רבים, מתבטאים בשרירי השלד, ותפקידים אלה לא נקבעו עד כה. על ידי דפיקות דמשלו רמת הביטוי שלהם, ולכן ניתן לחקור את ההשלכות שלהם ב- SOCE ואת תפקידיהם במהלך בידול שריר השלד האנושי. המדידה SOCE ניתן לבצע באמצעות שתי גישות שונות: הקלטות הנוכחי אלקטרו ו Ca 2 + מדידות. Electrophysiology הוא בהחלט שיטה ישירה יותר, כפי שהיא מודדת את הנוכחי של עניין וחתימה אלקטרופיזיולוגי הקשורים אליו. עם זאת, טכניקה זו קשה מאוד להחיל על תאי השריר, בעיקר בגלל גודל גדול של תאי שריר וגודל קטן של הנוכחי SOCE אנדוגני. Cytosolic Ca 2 + הדמיה היא טכנית מאוד נגיש, אבל המדד הוא יותר עקיף, כמו Ca 2 + רמת נמדדת cytosol משקף הן את כניסת Ca 2 + ואת שאיבה מחדש מתוך התא או בחנויות הפנימיות. מתודולוגיה הכוללת בידוד myoblasts מ חתיכות קטנות של skel האדםשריר etal לאחר עיכול אנזימטי, הגברה, FACS מוסבר במאמר זה. תהליך של בידול שרירים ואת פרוטוקול immunofluorescence לעקוב אחר הביטוי של סמנים בידול לאורך זמן מתוארים 18 . לבסוף, המדידה של SOCE ואת התפקיד של ערוצי יון שונים Ca 2 + איתות והבחנה שריר השלד מוסברים.

<table><tbody><tr><td>בשר חזיר s F10</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31550-023</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10270-106</td><td>Lot 41G5532K</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>O5482</td><td></td></tr><tr><td>fetuin</td><td>Sigma</td><td>F3385</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Corning</td><td>354001</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethansone</td><td>Sigma</td><td>D1756</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>קריאטין</td><td>סיגמא</td><td>27900</td><td></td></tr><tr><td>פירובט</td><td>סיגמא</td><td>P4562</td><td></td></tr><tr><td>אורידין</td><td>סיגמא</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15710-049</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין-EDTA 0.05%</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; מסננת תאים m</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; מסננת תאים m</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50&nbsp; צינור מ"ל</td><td>פלקון</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>פלקון 15&nbsp; צינור מ"ל</td><td>פלקון</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>פלקון 5&nbsp; צינור מ"ל (FACS)</td> <td>פלקון</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>מדיום תרבית: OPTI-MEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985-047</td><td></td></tr><tr><td>Transfectant reagnt: RNAiMax</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1756064</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>הרכבה בינונית</td><td>Fluka</td><td>10981</td><td></td></tr><tr><td>עכבר אנטי-MyHC *</td><td>DSHB</td><td>MF20&nbsp;</td><td>להתרכז</td></tr><tr><td>עכבר אנטי מיוגנין</td><td>BD Pharmigen</td><td>556358</td><td></td></tr><tr><td>ארנב אנטי MEF2</td><td>סנטה קרוז ביוטק</td><td>C-21</td><td></td></tr><tr><td>עז נגד עכבר Alexa488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>עז נגד ארנב Alexa 546</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A11035</td><td></td></tr><tr><td>עכבר אנטי אנושי CD56-Alexa488</td><td>BD Pharmingen</td><td>557699</td><td></td></tr><tr><td>עכבר אנטי אנושי CD146-PECy7</td><td>BD Pharmingen</td><td>562135</td><td></td></tr><tr><td>עכבר אנטי אנושי CD45-PE-CF594</td><td>BD Pharmingen</td><td>562279</td><td></td></tr><tr><td>עכבר אנטי אנושי CD34-APC</td><td>BD Pharmingen</td><td>345804</td><td></td></tr><tr><td>עכבר אנטי אנושי CD144-PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>560410</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 עכבר IgG1k</td><td>BD Pharmingen</td><td>557702</td><td></td></tr><tr><td>PECy7 עכבר IgG1k</td><td>BD Pharmingen</td><td>557872</td><td></td></tr><tr><td>PE-CF594 עכבר IgG1k</td><td>BD Pharmingen</td><td>562292</td><td></td></tr><tr><td>APC עכבר IgG1k</td><td>BD Pharmingen</td><td>550854</td><td></td></tr><tr><td>PE עכבר IgG1k</td><td>BD Pharmingen</td><td>556650</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>זהירות:&nbsp; תרכובת רעילה</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Fluka</td><td>762400</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F1201</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Sigma</td><td>T9033</td><td>זהירות&nbsp;: תרכובת רעילה&nbsp;</td></tr><tr><td>תוכנת רכישת הדמיה יחסית: Metafluor 6.3</td><td>Molecular Device</td><td></td><td></td></tr><tr><td>*&nbsp;: MF 20 הופקד ב-DSHB על ידי פישמן, D.A.&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד של myoblasts האדם, הערכה של בידול myogenic, ו-מופעלות סידן מופעל מדידה

Isolation of Human Myoblasts, Assessment of Myogenic Differentiation, and Store-operated Calcium Entry Measurement

תאי הלוויין (SC) הם תאי גזע שרירים הממוקמים בין קרום הפלזמה של סיבי השריר לבין הלמינה הבסיסית. הם חיוניים עבור התחדשות שריר. עם פגיעה, אשר מתרחשת לעתים קרובות בשרירי השלד, SCs מופעלים. הם מתרבים כמו myoblasts ולהבדיל לתקן נגעים שרירים. בין אירועים רבים המתרחשים במהלך בידול השריר, cytosolic Ca 2 + אותות הם בעלי חשיבות רבה. אלה Ca 2 + אותות נובעים Ca 2 + שחרור מ הפנימי Ca 2 + חנויות, כמו גם מ Ca 2 + כניסה מהחלל תאיים, במיוחד את החנות המופעלות Ca 2 + כניסה (SOCE). מאמר זה מתאר מתודולוגיה המשמשת כדי להשיג אוכלוסייה טהורה של myoblasts האדם מדגימות שריר שנאספו לאחר ניתוח אורתופדי. הרקמה היא מתעכל מכנית אנזימטית, ואת התאים הם מוגבר ולאחר מכן מיון על ידי cytometry הזרימה על פי נוכחות של speciסמני קרום. לאחר שהושג, myoblasts האדם מורחבים ומחויבים להבדיל על ידי הסרת גורמי גדילה מן המדיום התרבות. רמות הביטוי של גורמים שעתוק ספציפיים ב immunosluorescence חוץ גופית משמשים כדי להעריך את תהליך בידול myogenic בתנאי שליטה לאחר השתקת חלבונים המעורבים Ca 2 + איתות. לבסוף, אנו מפרטים את השימוש Fura-2 כמו ratiometric Ca 2 + בדיקה המספק מדידות אמין לשחזור של SOCE.

לאחר הדיסוציאציה האנזימטית של דגימת שריר אנושית, התאים גדלו ב- GM. מיובלסטים אנושיים, שהוגדרו כתאי CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-, התקבלו לאחר FACS. Myoblasts ייצג יותר מ 60% של האוכלוסייה נותחו ( איור 1 ). ראשי myoblasts האדם הוחזרו, גדל המפגש, ותרבותי DM במשך 48 שעות. לאחר immunostaining עבור הביטוי של גורם שעתוק MEF2 ואת שריר ספציפי חלבון שרשרת כבדה (MyHC), ראינו כי רוב התאים יצרו myotubes במבחנה (תאים MyHC חיובי), עם ערכי אינדק...

כאן, אנו מתארים מתודולוגיה כדי להשיג אוכלוסייה טהורה של myoblasts האדם מן רקמת שריר בוגר. תאים אלה משמשים ללמוד בידול שריר השלד במבחנה , בפרט, ללמוד חלבונים המעורבים Ca 2 + איתות.

בידוד של Myoblasts האדם, הערכה של בידול Myogenic, ו-מופעלות סידן מופעל מדידה

Satellite cells (SC) are muscle stem cells located between the plasma membrane of muscle fibers and the surrounding basal lamina. They are essential for ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להשיג אוכלוסייה טהורה של מיובלסטים אנושיים משריר שלם של מבוגר. תאים אלו משמשים למחקרים פונקציונליים, כגון הערכה של דיפרנציאציה מיוגנית ומדידה של כניסת סידן המופעלת על ידי מאגרים (store-operated calcium entry). היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת בידוד מהיר, פשוט וניתן לשחזור של מיובלסטים ראשוניים אנושיים.מיובלסטים אלו מהווים מודל ex-vivo חדש לחקר אותות סידן במהלך התחדשות שרירים. שיטה זו עשויה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום השרירים, כגון זיהוי התעלות היוניות וגורמי השעתוק המעורבים במהלךהתמיינות שרירים. בדרך זו, השיטה יכולה לספק תובנות לגבי תפקודי גנים במהלך התמיינות מיוגנית אנושית.ניתן להחיל זאת גם על מחקרים אחרים, כגון הפוטנציאל לשימוש בתאי גזע מיוגניים לטיפול בדיסטרופיות של השרירים. העבירו את דגימת השריר לפלטה סטרילית של ששה סנטימטרים, ושטפו את הדגימה עם PBS פעמיים. הסירו כל רקמת שומן שנותרה ושקלו את הדגימה.בשלב הבא, הוסיפו trypsin וקצצו את השריר לחלקים קטנים מגודל של שני מילימטרים. לאחר הקיצוץ, השתמשו בפיפט של 10 milliliter כדי להעביר את הרקמה לבקבוק דיסוציאציה של 200 milliliter המכיל מגנט ערבוב, ולאחר מכן המשיכו לאסוף רקמה מקוצצת בתמיסת trypsin עד שבקבוק הדיסוציאציה יתמלא ל-90 milliliters. כעת, הדגירו את הרקמה במקלחת במעלה של 37 degrees

isolation-human-myoblasts-assessment-myogenic-differentiation-store

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

הקרינה מבוסס מדידה הכניסה חנות המופעל הסידן בתאים חיים: מתא הסרטן תרבותי כדי סיב שריר שלד

אנו מתארים את בידודו של myocytes פרוזדורי אדם אשר יכול לשמש לתאיים...

בידוד של myocytes פרוזדורי אדם למדידות בו זמנית של Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; ארעי וזרמים הממברנה

כאן אנו מתארים את הבידוד של cardiomyoctyes עכבר המבוגר באמצעות מערכת זלוף Langendorff. תאים וכתוצאה מכך הם Ca2 +, סובלניים, חשמלי שקט ויכולים להיות מתורבת וtransfected עם אדנו או lentiviruses כדי לתפעל ביטוי גנים. הפונקציונליות שלהם יכולה גם להיות מנותחת באמצעות מערכת MMSYS וטכניקות תיקון מהדק.

בידוד, תרבות ואפיון פונקציונלי של Cardiomyoctyes מאוס למבוגרים

סוגי התאים הדבקים העיקריים שמקורם בשריר אנושי הם תאים מיוגניים ופיברובלסטים. כאן, אוכלוסיות התאים מועשרות באמצעות מיון תאים מופעל מגנטי המבוסס על אנטיגן CD56. תיוג חיסוני לאחר מכן עם נוגדנים ספציפיים ושימוש בטכניקות ניתוח תמונה מאפשר כימות של מאפיינים ציטופלזמיים וגרעיניים בתאים בודדים.

בידוד וכמוני Immunocytochemical אפיון של תאים ראשוניים myogenic וFibroblasts משרירי שלד אדם

תאי שריר הם בין התאים האיקריוטיים המורכבים ביותר. אנו מציגים פרוטוקול להתמיינות חוץ גופית של סיבי שריר בוגרים מאוד המאפשר מניפולציה גנטית והדמיה ברורה בכל שלבי ההתפתחות.

במבחנת הבידול של בוגרות Myofibers עבור הדמיה חיה

מיאוברוב הם מתרבים תאים מקודכי להבדיל לטופס מיונוקלאוטים מיופולימרים ובסופו של דבר שריר השלד סיבים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור בידוד יעיל והתרבות של myoblasts חזיקה הראשוני של השרירים העכבר המבוגר הצעיר. השיטה מאפשרת מחקרים מולקולריים, גנטיים ומטבוליים של תאי שריר בתרבות.

בידוד והבידול של מכשולים ראשוניים מתוך שריר השלד של העכבר Explants

מוצג הוא פרוטוקול לבידוד של קרדיומיוציטים חדריים אנושיים ובעלי חיים מפרוסות שריר הלב לחתוך vibratome. תפוקות גבוהות של תאים סובלניים סידן (עד 200 תאים / מ"ג) ניתן להשיג כמויות קטנות של רקמה (&lt;50 מ"ג). הפרוטוקול ישים על שריר הלב החשוף לאישמיה קרה עד 36 שעות.

בידוד של קרדיומיוציטים חדריים אנושיים מפרוסות שריר הלב ויסטום-לחתוך

מודלים עכבריים מאפשרים ללמוד מנגנוני מפתח של arrhythmogenesis. לשם כך, קרדיומיוציטים באיכות גבוהה נחוצים לביצוע מדידות מהדק תיקון. כאן מתוארת שיטה לבידוד מיוציטים פרוזדוריים וחדרי מורין באמצעות זילוח לנגנדורף מבוסס אנזים מדרדר, המאפשר מדידות בו זמנית של סידן חולף וזרם סידן מסוג L.

בידוד מיוציטים פרוזדוריים וחדריים באיכות גבוהה למדידות בו זמנית של Ca2+ Transients וזרם סידן מסוג L

כאן שיטות המשמשות כדי ללמוד את ההשפעה התפקודית של מוטציות RYR1 בא לידי ביטוי אנדוגני וירוס אפשטיין בר מונצח B-לימפוציטים, ביופסיה שריר נגזר תאי לווין המובחנים myotubes מתוארים.

אפיון פונקציונלי של גרסאות RYR1 אנושיות מבוטאות אנדוגניות

אנו מתארים פרוטוקול לקבלת סיבים מנותקים אנזימטית באורכים וסוגים שונים משישה שרירים של עכברים בוגרים: שלושה מהם כבר תוארו (flexor digitorum brevis, extensor digitorum longus, soleus) ושלושה מהם נותקו בהצלחה בפעם הראשונה (extensor hallucis longus, peroneus longus, peroneus digiti quarti).

סיבי שריר שלד שלמים קצרים, בינוניים וארוכים המתקבלים על ידי דיסוציאציה אנזימטית של שישה שרירי גפיים אחוריות של עכברים: Beyond Flexor Digitorum Brevis

פרוטוקול זה מספק שיטה סטנדרטית לבידוד והעשרת מיובלסטים ראשוניים משרירי השלד של עכברים בוגרים ויילודים באמצעות ניתוק רקמות, סינון רציף, ציפוי מוקדם ותנאי תרבית מוגדרים, המאפשר הקמה ותחזוקה של תרביות מיובלסטים שמקורן בתאי לוויין ליישומים ניסיוניים במורד הזרם.

בידוד תאי לוויין שריר השלד למחקרי מיוגנזה במבחנה

למדו לבודד מיובלסטים אנושיים משריר שלד בוגר ולהעריך בידול מיוגני וכניסת סידן מופעלת ממאגרים. שיטה זו מאפשרת בידוד מהיר ושחזור של תאים לחקר מנגנוני התחדשות שריר ותפקוד גנים.

בידוד של Myoblasts האדם, הערכה של בידול Myogenic, ו-מופעלות סידן מופעל מדידה

גלה סרטונים נוספים