Name: לוקליזציה של גנים קולטן Odorant ב אנטנות ארבה על ידי RNA באתרו הכלאה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: למדו לוקליזציה של גנים קולטן ריח ברמות ביטוי נמוכות באנטנות חרגולים באמצעות הכלאת RNA in situ עם בדיקות DIG או ביוטין. שיטה זו מאפשרת זיהוי רגיש של ביטוי גנים בעצבנות חרקים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי מענק מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (No.31472037). אזכור שמות מסחריים או מוצרים מסחריים במאמר זה הוא אך ורק לצורך מתן מידע ספציפי ואין פירושו המלצה.

<ol><li>Sato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+olfactory+receptors+are+heteromeric+ligand-gated+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insect olfactory receptors are heteromeric ligand-gated ion channels.</a> Nature. 452 (7190), 1002-1006 (2008).</li>
<li>Smart, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+odorant+receptors+are+novel+seven+transmembrane+domain+proteins+that+can+signal+independently+of+heterotrimeric+G+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila odorant receptors are novel seven transmembrane domain proteins that can signal independently of heterotrimeric G proteins.</a> Insect Biochem Mol Biol. 38 (8), 770-780 (2008).</li>
<li>Wicher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+odorant+receptors+are+both+ligand-gated+and+cyclic-nucleotide-activated+cation+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drosophila odorant receptors are both ligand-gated and cyclic-nucleotide-activated cation channels.</a> Nature. 452 (7190), 1007-1011 (2008).</li>
<li>Carey, A. F., Wang, G., Su, C. Y., Zwiebel, L. J., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+reception+in+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Odorant reception in the malaria mosquito Anopheles gambiae.</a> Nature. 464 (7258), 66-71 (2010).</li>
<li>Hallem, E. A., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coding+of+odors+by+a+receptor+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Coding of odors by a receptor repertoire.</a> Cell. 125 (1), 143-160 (2006).</li>
<li>Wang, G., Carey, A. F., Carlson, J. R., Zwiebel, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+odor+coding+in+the+malaria+vector+mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of odor coding in the malaria vector mosquito Anopheles gambiae.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4418-4423 (2010).</li>
<li>Hassanali, A., Njagi, P. G., Bashir, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+ecology+of+locusts+and+related+acridids%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Entomol%22%5BJournal%5D)">Chemical ecology of locusts and related acridids.</a> Annu Rev Entomol. 50, 223-245 (2005).</li>
<li>Schaeren-Wiemers, N., Gerfin-Moser, A. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00267823">A single protocol to detect transcripts of various types and expression levels in neural tissue and cultured cells: in situ hybridization using digoxigenin-labeled cRNA probes.</a> Histochemistry. 100 (6), 431-440 (1993).</li>
<li>Vosshall, L. B., Amrein, H., Morozov, P. S., Rzhetsky, A., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spatial+map+of+olfactory+receptor+expression+in+the+Drosophila+antenna%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A spatial map of olfactory receptor expression in the Drosophila antenna.</a> Cell. 96 (5), 725-736 (1999).</li>
<li>Yang, Y., Krieger, J., Zhang, L., Breer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+olfactory+co-receptor+Orco+from+the+migratory+locust+%28Locusta+migratoria%29+and+the+desert+locust+%28Schistocerca+gregaria%29%3A+identification+and+expression+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The olfactory co-receptor Orco from the migratory locust (Locusta migratoria) and the desert locust (Schistocerca gregaria): identification and expression pattern.</a> Int J Biol Sci. 8 (2), 159-170 (2012).</li>
<li>Schultze, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+co-expression+pattern+of+odorant+binding+proteins+and+olfactory+receptors+identify+distinct+trichoid+sensilla+on+the+antenna+of+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The co-expression pattern of odorant binding proteins and olfactory receptors identify distinct trichoid sensilla on the antenna of the malaria mosquito Anopheles gambiae.</a> PLoS One. 8 (7), e69412(2013).</li>
<li>Xu, H., Guo, M., Yang, Y., You, Y., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+two+novel+odorant+receptors+in+the+locust+%28Locusta+migratoria%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential expression of two novel odorant receptors in the locust (Locusta migratoria).</a> BMC Neurosci. 14, 50(2013).</li>
<li>Saina, M., Benton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+olfactory+receptor+expression+and+localization+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualizing olfactory receptor expression and localization in Drosophila.</a> Methods Mol Biol. 1003, 211-228 (2013).</li>
<li>Guo, M., Krieger, J., Große-Wilde, E., Mißbach, C., Zhang, L., Breer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variant+ionotropic+receptors+are+expressed+in+olfactory+sensory+neurons+of+coeloconic+sensilla+on+the+antenna+of+the+desert+locust+%28Schistocerca+gregaria%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Variant ionotropic receptors are expressed in olfactory sensory neurons of coeloconic sensilla on the antenna of the desert locust (Schistocerca gregaria).</a> Int J Biol Sci. 10 (1), 1-14 (2013).</li>
<li>You, Y., Smith, D. P., Lv, M., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+broadly+tuned+odorant+receptor+in+neurons+of+trichoid+sensilla+in+locust%2C+Locusta+migratoria%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A broadly tuned odorant receptor in neurons of trichoid sensilla in locust, Locusta migratoria.</a> Insect Biochem Mol Biol. 79, 66-72 (2016).</li>
<li>Jiang, X., Pregitzer, P., Grosse-Wilde, E., Breer, H., Krieger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+two+%22Sensory+Neuron+Membrane+Proteins%22+%28SNMPs%29+of+the+desert+locust%2C+Schistocerca+gregaria+%28Orthoptera%3A+Acrididae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of two "Sensory Neuron Membrane Proteins" (SNMPs) of the desert locust, Schistocerca gregaria (Orthoptera: Acrididae).</a> J Insect Sci. 16 (1), 33(2016).</li>
<li>Angerer, L. M., Angerer, R. C. In situ. hybridization to cellular RNA with radiolabelled RNA probes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAngerer%2C+LM+%22In+situ+hybridization%22">In situ hybridization</a>. Wilkinson, D. G. , IRL Press. Oxford. 2(1992).</li>
<li>Komminoth, P., Merk, F. B., Leav, I., Wolfe, H. J., Roth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+35S-+and+digoxigenin-labeled+RNA+and+oligonucleotide+probes+for+in+situ+hybridization.+Expression+of+mRNA+of+the+seminal+vesicle+secretion+protein+II+and+androgen+receptor+genes+in+the+rat+prostate%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Comparison of 35S- and digoxigenin-labeled RNA and oligonucleotide probes for in situ hybridization. Expression of mRNA of the seminal vesicle secretion protein II and androgen receptor genes in the rat prostate.</a> Histochemistry. 98 (4), 217-228 (1992).</li>
<li>Leary, J. J., Brigati, D. J., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+sensitive+colorimetric+method+for+visualizing+biotin-labeled+DNA+probes+hybridized+to+DNA+or+RNA+immobilized+on+nitrocellulose%3A+Bio-blots%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Rapid and sensitive colorimetric method for visualizing biotin-labeled DNA probes hybridized to DNA or RNA immobilized on nitrocellulose: Bio-blots.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (13), 4045-4049 (1983).</li>
<li>Hallem, E. A., Ho, M. G., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+odor+coding+in+the+Drosophila+antenna%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of odor coding in the Drosophila antenna.</a> Cell. 117 (7), 965-979 (2004).</li>
<li>Jones, W. D., Nguyen, T. A., Kloss, B., Lee, K. J., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+conservation+of+an+insect+odorant+receptor+gene+across+250+million+years+of+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional conservation of an insect odorant receptor gene across 250 million years of evolution.</a> Curr Biol. 15 (4), R119-R121 (2005).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף או כל ניגודי אינטרסים אחרים.

זה קשה לבצע RNA ISH כדי למקם או גנים אנטנות חרקים בגלל רמות ביטוי של גנים או, למעט ORCO , הם נמוכים מאוד ושמירה פרוסות היסטולוגית של אנטנות חרקים קשה מאוד. בנוסף, זיהוי TSA הוא גם מאוד מסובך. כדי לטפל בבעיות אלה, יש לנקוט בצעדים הבאים. האנטנות נבחרות מתוך ארבה מבוגר החדש שיש להם עור רזה רך cuticles, אשר לשמור על המורפולוגיה שלהם על השקופית. הדגימות קפואים הם מחולקים לתוך 12 פרוסות עבה מיקרומטר. נעשה שימוש בבדיקות ביוטין ובדיג שכותרתו במיוחד. דטרגנטים, כגון Tween-20 ו- Tri...

אנטנות חרקים, שהן האיברים הכימוזנריים החשובים ביותר, מכוסים במבנים רבים דמויי שיער - הנקראים סנסיליה - המושרשים על ידי נוירונים של קולטן חוש הריח (ORN). על הממברנה של חרקים ORN, רצפטורים אודורנט (ORs), סוג של חלבון המכיל שבעה תחומים transmembrane, באים לידי ביטוי עם corceptor (ORCO) כדי ליצור heteromer המתפקד כמו ערוץ יון מלוטש יון 1 , 2 , 3 . ORs שונים מגיבים לשילובים שונים של חומרים כימיים 4 , 5 , 6 . ארבה ( Locusta migratoria ) בעיקר להסתמך על רמזים חוש הריח כדי להפעיל התנהגויות חשובות 7 . ORS ארבה הם גורמים מרכזיים להבנת מנגנוני הריח המולקולריים. לוקליזציה של ארבה או גן ספציפי לנוירון שלמורפולוגית ספציפית סוג sensillum על ידי RNA ב הכלאה Situ (RNA ISH) הוא הצעד הראשון בחקר הפונקציה ORs. רנ&quot;א משתמשת בדיקה מסומנת RNA משלים למדוד ולמקם רצף מסוים RNA בסעיף של רקמות, תאים או mounts כולו באתרם , מתן תובנות תהליכים פיזיולוגיים מחלה פתוגנזה. Digoxigenin שכותרתו (DIG שכותרתו) ו ביוטין שכותרתו בדיקות RNA כבר בשימוש נרחב הכלאה RNA. RNA תיוג עם digoxigenin-11-UTP או biotin-16-UTP יכול להיות מוכן על ידי שעתוק במבחנה עם SP6 ו T7 RNA פולימריות. DIG ו- biotin שכותרתו בדיקות RNA יש את היתרונות הבאים: לא רדיואקטיבי; בטוח; יַצִיב; רגיש מאוד; ספציפיים מאוד; וקל לייצר באמצעות PCR ו שעתוק במבחנה . DIG ו- biotin שכותרתו בדיקות RNA יכול להיות chromogenically ו זוהה fluorescently. DIG שכותרתו בדיקות RNA יכול להיות מזוהה עם אלקלי דיגוקסגנין אנטיNe-phosphatase (AP) נוגדנים conjugated כי ניתן לדמיין גם עם המצעים chemiluminescent רגיש nitroblue tetrazolium כלוריד / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate toluidine מלח (NBT / BCIP) באמצעות מיקרוסקופ אופטי או עם 2 הידרוקסיה -3-naphtoic חומצה -2 &#39;-phenylanilide פוספט (HNPP) יחד עם 4-chloro-2-methylbenzenediazonium חמי אבץ כלוריד מלח (אדום מהיר) באמצעות מיקרוסקופ confocal. Biotin שכותרתו בדיקות RNA יכול להיות מזוהה עם אנטי ביוטין streptavidin צנון סוס צחצוח Peroxidase (HRP) - conjugated נוגדנים שיכולים להיות דמיינו עם tyramides פלואורסצין באמצעות מיקרוסקופ confocal. לכן, פעמיים צבע פלואורסצנט הכלאה באתרו יכול להתבצע כדי לזהות שני גנים היעד בפרוסה אחת באמצעות בדיקות DIG ו ביוטין שכותרתו RNA. RNA ISH עם DIG- ו / או בדיקות שכותרתו ביוטין שימש בהצלחה למקם גנים ההרחה הקשורות, כגון OR, ionotropic קולטן, חלבון odorant מחייבואת החלבון נוירון חישה, ב אנטנות חרקים של, אך לא רק, תסיסנית melanogaster , Anopheles gambiae , L. migratoria ואת ארבה המדבר Schistocera gregaria 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . עם זאת, ישנם שני אתגרים משמעותיים בעת ביצוע RNA ISH עבור חרקים ORS: (1) או גנים (למעט ORCO ) באים לידי ביטוי ברמות נמוכות ורק במספר תאים, מה שהופך זיהוי האות קשה מאוד, (2) שימור רקמת חרקים עבור היסטולוגיה, כך שהמורפולוגיה נשמרת ורעש הרקע נמוך, יכול להיות מאתגר. במאמר זה פרוטוקול מפורט ויעיל המתאר RNA ISH עבור לוקליזציה או גנים חרקיםאנטנות מוצג, כולל הן Chromogenic ו Tyramide איתות הגברה (TSA) גילוי.

<table><tbody><tr><td><חזק>חומרים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 פעמים; TSINGKETM מאסטר מיקס</td><td>TSINGKE, סין</td><td>TSE004</td><td></td></tr><tr><td>ללא RNase H2O</td><td>TIANGEN, סין</td><td>RT121-02</td><td></td></tr><tr><td>אגרוז רגיל G-10</td><td>BIOWEST, ספרד</td><td>91622</td><td></td></tr><tr><td>מאגר מחייב</td><td>TIANgel ערכת טיהור מידי, TIANGEN, סין</td><td>DP209-02</td><td></td></tr><tr><td>מאגר איזון</td><td>TIANgel ערכת טיהור מידי, TIANGENסין</td><td>DP209-02</td><td></td></tr><tr><td>פתרון כביסה</td><td>TIANgel ערכת טיהור מידי, TIANGEN, סין</td><td>DP209-02</td><td></td></tr><tr><td>T וקטור</td><td>פרומגה, ארה"ב</td><td>A362A</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>Promega, ארה"ב</td><td>M180A</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli DH5&alpha;</td><td>TIANGEN, סין</td><td>CB101</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma, ארה"ב</td><td>A-6140</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופיל ובטא;-D-1-thiogalactopyranoside</td><td>Inalco, ארה"ב</td><td>1758-1400</td><td></td></tr><tr><td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&beta;-D-galactopyranoside</td><td>SBS Genetech, סין</td><td>GX1-500</td><td></td></tr><tr><td>Nco I</td><td>BioLabs, ניו אינגלנד</td><td>R0193S</td><td></td></tr><tr><td>Spe I</td><td>BioLabs, ניו אינגלנד</td> ערכת תיוג <td>RNA R0133M</td><td></td></tr><tr><td>DIG</td><td>רוש, שוויץ</td><td>ערכת</td> תיוג RNA 11175025910 <td></td></tr><tr><td>ביוטין רוש, שוויץ</td><td>ערכת</td><td>תיוג</td> RNA 11685597910 <td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>DIG, רוש, שוויץ</td><td>11175025910</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>סינופארם, סין</td><td>10012718</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>סינופארם, סין</td><td>10009257</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית</td><td>בייג'ינג כימיקל ריג'נטס חברה, סין</td><td>10000292</td><td></td></tr><tr><td>רקמות-טק O.C.T. תרכובת</td><td>סאקורה פינטק אירופה, Zoeterwoude, הולנד</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות</td><td>טינה ג'ין האו יאנג ייצור ביולוגי ושות', LTE, סין</td><td>FISH0010</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>סינופארם, סין</td><td>80070591</td><td></td></tr><tr><td>Millex</td><td>Millipore, ארה"ב</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>AMRESCO, ארה"ב</td><td>0777-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Nitroblue טטרזוליום כלוריד / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate מלח טולואידין</td><td>רוש, שוויץ</td><td>11175041910</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>סינופארם, סין</td><td>10010618</td><td></td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>תגובות</חזק</td></tr><tr><td>><חזק>פתרונות</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1&פעמים; Tris-acetate-EDTA</td><td>Sigma, ארה"ב</td><td>V900483-1KG</td><td>0.04 mol/L Tris-Base</td></tr><tr><td>1& פעמים; Tris-acetate-EDTA חברת</td><td>ריג'נטס כימית בייג'ינג, סין</td><td>10000292</td><td>0.12% חומצה אצטית</td></tr><tr><td>1& פעמים; Tris-acetate-EDTA</td><td>Sigma, ארה"ב</td><td>03677</td><td>חומצה אתילנדיאמינטטראצטית מלח דיסודיום (EDTA)</td></tr><tr><td>מדיום נוזלי Luria-Bertani (LB)</td><td>סינופארם, סין</td><td></td><td>10019392 10 גרם/ליטר</td></tr><tr><td>NaCl מדיום נוזלי לוריא-ברטאני (LB)</td><td>MERCK, גרמניה</td><td>VM335231</td><td>10 גרם/ליטר פפטון מקזאין (טריפטון)</td></tr><tr><td>מדיום נוזלי לוריא-ברטני (LB)</td><td>MERCK, גרמניה</td><td>VM361526</td><td>5 גרם/ליטר תמצית שמרים</td></tr><tr><td>צלחת מצע מוצק LB</td><td>סינופארם, סין</td><td>10019392</td><td>10 גרם/ליטר NaCl</td></tr><tr><td>LB צלחת מצע מוצק</td><td>MERCK, גרמניה</td><td>VM335231</td><td>10 גרם/ליטר פפטון מקזאין (טריפטון)</td></tr> <tr><td>צלחת מצע מוצק LB</td><td>MERCK, גרמניה</td><td>VM361526</td><td>5 גרם/ליטר תמצית שמרים</td></tr><tr><td>צלחת מצע מוצק LB</td><td>WISENT ING, קנדה</td><td>800-010-CG</td><td>15 גרם/ליטר אגר כיתה בקטריולוגית</td></tr><tr><td>10 פעמים; תמיסת מלח חומצית פוספט (PBS, pH 7.1)</td> <td>סינופארם, סין</td><td>10019392</td><td>8.5% NaCl</td></tr><tr><td>10& פעמים; תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS, pH 7.1)</td><td>סיגמא, ארה"ב</td><td>V900041-500G</td><td>14 מ"מ KH<תת>2PO4</td></tr><tr><td>10& פעמים; תמיסת מלח חומצה פוספט (PBS, pH 7.1)</td><td>סיגמא, ארה"ב</td><td>V900268-500G</td><td>80 מ"מ Na2HPO4</td></tr><tr><td>10 פעמים; תמיסת מלח Tris-Buffered (TBS, pH 7.5)</td><td>סיגמא, ארה"ב</td><td>V900483-1 ק"ג</td><td>1 מ' Tris-Base</td></tr><tr><td>10&times; תמיסת מלח Tris-Buffered (TBS, pH 7.5)</td><td>סינופארם, סין</td><td>10019392</td><td>1.5 מ'</td></tr><tr><td>מאגר זיהוי NaCl (DAP) &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; זיהוי כרומוגני pH 9.5&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; זיהוי TSA pH 8.0</td><td>סיגמא, ארה"ב</td><td>V900483-1KG</td><td>100 מ"מ מאגר זיהוי Tris-Base</td></tr><tr><td>(DAP) &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; זיהוי כרומוגני pH 9.5&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; זיהוי TSA pH 8.0</td><td>סינופארם, סין</td><td>10019392</td><td>100 מ"מ</td></tr><tr><td>מאגר זיהוי NaCl (DAP) &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; זיהוי כרומוגני pH 9.5&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; זיהוי TSA pH 8.0</td><td>סיגמא, ארה"ב</td><td>V900020-500G</td><td>50 מ"מ MgCl2&middot; 6 שעות<תת>2</תת>O</td></tr><tr><td>20&פעמים; מי מלח-נתרן ציטראט (pH 7.0)</td><td>סינופארם, סין</td><td>10019392</td><td>3 מ' NaCl</td></tr><tr><td>20&; תמיסת מלח-נתרן ציטראט (pH 7.0)</td><td>סיגמא, ארה"ב</td><td>V900095-500 גרם</td><td>0.3 מ' Na-ציטראט</td></tr><tr><td>4% תמיסת פרפורמלדהיד (PFA, pH 9.5)</td><td>סיגמא, ארה"ב</td><td>V900894-100 גרם</td><td>4% מאגר</td></tr><tr><td>נתרן קרבונט</td> פרפורמלדהיד <td>סיגמא, ארה"ב</td><td>V900182-500 גרם</td><td>0.1 מ' NaHCO<תת>3</תת>מאגר</td></tr> <tr><td>נתרן קרבונט (pH 10.2)</td><td>סיגמא, ארה"ב</td><td>V900182-500G</td><td>80 מ"מ NaHCO3</ תת></td></tr><tr><td>נתרן קרבונט בופר (pH 10.2)</td><td>סיגמא, ארה"ב</td><td>S7795-500G</td><td>120 מ"מ Na2CO3</td></tr><tr><td>Formamide Solution (pH 10.2)</td><td>MPBIO, ארה"ב</td><td>FORMD002</td><td>50% תמיסת פורממיד פורממיד נטולת יונים</td></tr><tr><td>(pH 10.2)</td><td></td><td></td><td>5& פעמים; מאגר חסימת מלח-נתרן ציטראט</td></tr><tr><td>ב-TBS</td><td>רוש, שוויץ</td><td>11175041910</td><td>1%</td></tr><tr><td>מאגר חסימת כתמים ב-TBS</td><td>אמרסקו, ארה"</td>ב <td>0694-500 מ"ל</td><td>0.03% טריטון X-100</td></tr><tr><td>מאגר חוסם ב-TBS</td><td></td><td></td><td>1& פעמים; תמיסת מלח חוצצת</td></tr><tr><td>Tris תמיסת פוספטאז אלקליין</td><td>רוש, שוויץ</td><td></td><td>11175041910 1.5 U/mL נוגדן מצומד אנטי דיגוקסיגנין פוספטאז אלקליין</td></tr><tr><td>תמיסת</td><td></td><td></td><td>פוספטאז אלקליין חוסם חוצץ ב-TBS</td></tr><tr><td>תמיסת פוספטאז אלקליין / צנון סוסים</td><td>רוש, שוויץ</td><td>11175041910</td><td>1.5 U/mL אנטי דיגוקסיגנין פוספטאז אלקליין מצומד נוגדן</td></tr><tr><td>אלקליין פוספטאז / תמיסת פרוקסידאז צנון סוסים</td><td>ערכת TSA, פרקין אלמר, ארה"ב</td><td></td><td>NEL701A001KT 1% אנטי ביוטין סטרפטווידין צנון סוסים פרוקסידאז - נוגדן מצומד</td></tr><tr><td>פוספטאז אלקליין / תמיסת</td><td></td><td></td> פרוקסידאז צנון סוסים <td>חוסם מאגר ב-TBS</td></tr><tr><td>מאגר הכלאה</td><td>MPBIO, ארה"ב</td><td>FORMD002</td><td>50% היברידיזציה של פורממיד דה-יונים</td></tr><tr><td> חוצץ</td><td></td><td></td><td>פעמיים; </td></tr><tr><td>מאגר היברידיזציה</td> מלוח-נתרן ציטראט <td>סיגמא, ארה"ב</td><td>D8906-50G</td><td>10% דקסטרן סולפט</td></tr><tr><td>מאגר הכלאה</td><td>invitrogen, ארה"ב</td><td>AM7119</td><td>20 ומיקרו; גרם/מ"ל שמרי t-RNA</td></tr><tr><td>מאגר היברידיזציה</td><td>סיגמא, ארה"ב</td><td>D3159-10G</td><td>0.2 מ"ג/מ"ל זרע הרינג DNA</td></tr><tr><td>2-הידרוקסי-3-חומצה נפטואית-2'-פנילאניליד פוספט/ 4-כלורו-2-מתילבנזנדיאזוניום המי-אבץ כלוריד מצע מלח</td><td>רוש, שוויץ</td><td>11758888001</td><td>1% 2-הידרוקסי-3-חומצה נפטואית-2'-פנילאניליד פוספט (10 מ"ג/מ"ל)</td></tr><tr><td>2-הידרוקסי-3-חומצה נפטואית-2'-פנילאניליד פוספט/ 4-כלורו-2-מתילבנזנדיאזוניום המי-אבץ כלוריד מצע מלח</td><td>רוש, שוויץ</td><td>11758888001</td><td>1% 4-כלורו-2-מתילבנזנדיאזוניום המי-אבץ כלוריד מלח (25 מ"ג/מ"ל)</td></tr><tr><td>2-הידרוקסי-3-חומצה נפטואית-2'-פנילנליד פוספט/ 4-כלורו-2-מתילבנזנדיאזוניום המי-אבץ כלוריד מצע</td><td></td><td></td> מלח <td>זיהוי אות</td></tr><tr><td>טירמיד ערכת TSA מצע הגברה</td><td>פרקין אלמר, ארה"ב</td><td>NEL701A001KT</td><td>2% פלואורסצאין-טירמידים</td></tr><tr><td>מצע הגברת אות טירמיד</td><td>ערכת TSA, פרקין אלמר, ארה"ב</td><td>NEL701A001KT</td><td>מדלל</td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>הערות</חזק></td></tr><tr><td><חזק>מכשיר</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מקפיא מיקרוטום</td><td>לייקה, נוסלוך, גרמניה</td><td>Jung CM300 קריוסטט ספקטרופוטומטר</td><td></td></tr><tr><td></td><td>תרמו מדעי, ארה"ב</td><td>NANODROP 2000</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אופטי</td><td>אולימפוס, טוקיו, יפן</td><td>אולימפוס IX71מיקרוסקופ</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>אולימפוס, טוקיו, יפן</td><td>אולימפוס BX45 מיקרוסקופ</td><td></td> קונפוקלי</tr></tbody></table>

לוקליזציה של גנים קולטן odorant ב אנטנות ארבה על ידי rna<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

חרקים פיתחו מערכות מתוחכמות של קליטת חוש הריח לחוש אותות כימיים אקסוגניים. אלה האותות הכימיים הם transduced על ידי נוירונים קולטן חוש הריח (ORNs) שוכנים במבנים דמויי שיער, המכונה chemosensilla, של האנטנות. על קרום של ORN, Odorant קולטנים (ORs) הם האמינו להיות מעורב ריחוף ריח. לפיכך, היכולת לזהות גנים הממוקמים ל- ORN נחוצה כדי לזהות גנים, ומספקת בסיס יסודי לתפקוד תפקודי נוסף באתרו . רמות ביטוי RNA של ספציפיים או S אנטנות חרקים הם נמוכים מאוד, ושימור רקמות חרקים עבור היסטולוגיה מאתגרת. לכן, קשה למקם OR לסוג מסוים של sensilla באמצעות RNA ב הכלאה באתרו . במאמר זה, רנ&quot;א מפורט ויעיל בפרוטוקול הכלאה באתרו במיוחד עבור גנים לידי ביטוי נמוך של חרקים, הוא הציג. בנוסף, או ספציפי גןS זוהה על ידי ביצוע ניאון פעמיים צבע ניסויי הכלאה באתרו באמצעות שיתוף קולטן ביטוי קולטן, אורקו , כסמן.

עם זיהוי כרומוגני, תת קבוצה קטנה של תאים antennal בכל סעיף antennal המבוגר היה מסומן על ידי DIG שכותרתו LmigOR1 ו Lmigor2 בדיקות antisense ( איור 3 ). RNA על מקטעים רצופים כדי למקם LmigOR1 ו LmigOR2 הראה כי תאים אנטנלים המבטאים את שני הגנים היו ממוקמים באשכולות ORN להביע Lmigorco , המציין כי LmigOR1 ו LmigOR2 משוערים היו למעשה ליד...

מאמר זה מתאר פרוטוקול RNA מפורט ויעיל בפרוטוקול הכלאה באתרו, במיוחד עבור גנים של קולטנים (OR), המופיעים ברמה נמוכה, וכן בגנים אחרים, באנטנות חרקים באמצעות בדיקות דיגוקיגנין (DIG) או תוויות ביוטין.

לוקליזציה של גנים קולטן Odorant ב אנטנות ארבה על ידי RNA<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא למקם גנים של קולטני ריח מבוטאים ברמה נמוכה כמו גם גנים אחרים באנטנות החרקים באמצעות בדיקות עם תווית דיגוקסיגנין או ביוטין. כדי להתחיל בהליך זה, בחר את הארבה הבוגר החדש הפעיל ויש לו אנטנות שלמות, ואז חתוך את האנטנות לשניים עד שלושה מילימטרים באמצעות סכיני גילוח סטריליים. לאחר מכן, מרחו תרכובת OCT על מחזיק מיקרוטום מקפיא והניחו את הדגימות על התרכובת בצורה אופקית.העבירו את המחזיק למיקרוטום המקפיא בטמפרטורה שלילית של 24 מעלות צלזיוס כדי לאזן עד שהתרכובת קופאת. לאחר מכן, הוציאו את המחזיק וכסו את הדגימות בתרכובת קטנה. העבירו את המחזיק למיקרוטום המקפיא בטמפרטורה שלילית של 24 מעלות צלזיוס שוב למשך 10 דקות לפחות, ואז חתכו את הדגימות הקפואות לפרוסות בעובי 12 מיקרומטר.לאחר מכן, הפשירו את הפרוסות בזו אחר זו על שקופיות וייבשו אותן באוויר למשך 10 דקות. לאחר הכנת חלקי הקריוסטט, הניחו את השקופיות במיכל פלסטיק וקבעו את הרקמות על ידי דגירה של המגלשות בתמיסת 4% PFA למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר 30 דקות יש לשטוף את השקופיות ב- X PBS אחד למשך דקה אחת.כדי לחסל את החלבונים האלקליין, העבירו את השקופיות ל-0.2 מימן כלורי מולרי למשך 10 דקות, ולאחר מכן העבירו את השקופיות ל-X PBS אחד עם 1% טריטון X-100 למשך שתי דקות כדי לחסל את חלבון פני השטח של חומצת גרעין. לאחר מכן, שטפו את השקופיות פעמיים למשך 30 שניות ב-X PBS אחד. לאחר מכן יש לשטוף את השקופיות בתמיסת פורממיד למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.מסננים את השקופיות ומוסיפים 100 מיקרוליטר של בדיקות אנטיסנס וחוש מדוללות, ואז מניחים את החלקות הכיסוי על חלקי הרקמות. לאחר מכן, הוסף תמיסת פורממיד או PBS X אחד לתחתית הקופסה כדי לשמור על לחות הסביבה, אך אל תטבול את השקופיות בנוזל. לאחר מכן, הניחו את המגלשות המכוסות אופקית בקופסה לחה ודגרו בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך 22 שעות.לאחר ההכלאה, הסר את החלקות הכיסוי בזהירות. שטפו את הצדדים פעמיים על ידי ערבובם בעדינות על נדנדה למשך 30 דקות ב-0.1 X SSC ב-60 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן שטפו את השקופיות ב-X TBS אחד למשך 30 שניות. הוסף מיליליטר אחד של מגיב חוסם 1% ב-TBS בתוספת 0.03% טריטין X-100 בכל שקופית ודגר למשך 30 דקות.לאחר מכן, השליכו את תמיסת החסימה. לזיהוי כרומוגני, השתמש במגיב חוסם ב-TBS כדי לדלל 750 יחידות למיליליטר נוגדן מצומד אנטי-דיגוקסיגנין-AP ל-1.5 יחידות לתמיסת AP מיליליטר. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת AP לכל שקופית מכוסה.לזיהוי TSA, השתמש במגיב חוסם ב-TBS כדי לדלל 750 יחידות למיליליטר של נוגדן מצומד אנטי-דיגוקסיגנין-AP ונוגדנים מצומדים אנטי-ביוטין סטרפטווידין HRP לתמיסת AP HRP, ולאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת AP HRP לכל שקופית מכוסה. הוסף את תמיסת הפורממיד או PBS X אחד כדי לשמור על הקופסה לחה אך לא רטובה. לאחר מכן, דגרו את המגלשות בקופסה לחה למשך 60 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.שטפו את המגלשות שלוש פעמים במשך חמש דקות ב-X TBS אחד בתוספת 0.05% TWEEN 20 על נדנדה. לאחר מכן, שטפו את השקופיות במאגר DAP למשך חמש דקות על ידי השארת מיכל הפלסטיק על נדנדה נסער בעדינות. לזיהוי כרומוגני, הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת מצע NBT/BCIP לכל שקופית.הנח בזהירות את החלקות הכיסוי על המגלשות, ולאחר מכן דגר את השקופיות בקופסה לחה עם תמיסת מצע למשך 10 דקות עד לילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. בדוק את ההתפתחות על ידי התבוננות בשקופיות מעת לעת תחת המיקרוסקופ. כאשר הפיתוח מוכן, עצור את התגובה על ידי העברת המגלשות למים.לזיהוי TSA, השתמש במזרק כדי להזיז את המצע HNPP/Fast Red ממסנן המזרק, ולאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של מצע HNPP/Fast Red לכל שקופית המכוסה בתלוש כיסוי. לאחר מכן, דגרו את השקופיות למשך 30 דקות עם מצע HNPP/Fast Red בטמפרטורת החדר. לאחר 30 דקות, הסר את החלקות הכיסוי בזהירות ושטוף את השקופיות שלוש פעמים במשך חמש דקות ב-X TBS אחד בתוספת 0.05% TWEEN 20.דגרו את השקופיות עם 100 מיקרוליטר של מצע TSA לכל שקופית מכוסה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את החלקות הכיסוי בזהירות ושטוף את השקופיות שלוש פעמים במשך חמש דקות ב-X TBS אחד בתוספת 0.05% TWEEN 20 לפני הטמעת השקופיות בגליצרול PBS. לזיהוי כרומוגני, התבונן בקטעי הרקמה באמצעות מיקרוסקופ אופטי.מוצגים כאן דפוס התיוג של בדיקת האנטי-סנס LmigOR1 ו-LmigORco על החלקים הרצופים של אנטנת הארבה. להלן דפוס התיוג של בדיקת האנטי-סנס LmigORco ו-LmigOR2 על החלקים הרצופים של אנטנת הארבה. האיור של המבנים דמויי דנדריטי המסומנים מדי פעם מוצג כאן.לזיהוי TSA, התבונן בקטעי הרקמה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. כאן, בוצעה הכלאה של שני צבעים באתרם בקטע האנטנה האורכית כדי להמחיש את הביטוי של LmigOR1 ו-LmigORco. לוקליזציה של תאים המבטאים LmigOR1 באשכולות תאים המבטאים LmigORco אישרה את זהותו העצבית, והנה מבט מקרוב על האזורים הסגורים.מדי פעם מסומן מבנה דמוי דנדריטי מסומן על ידי חץ, והאזורים המוקפים בעיגול מצביעים על אשכול הנוירונים של קולטני הריח המבטאים LmigORco וחולקים את אותו סנסילום.

localization-odorant-receptor-genes-locust-antennae-rna-situ

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנחנו מדגימים וריאציות של טכניקה רבת יחידת ההקלטה התאית לאפיין תגובות ריח מעורר בשלושת השלבים הראשונים של מסלול ההרחה חסר חוליות. טכניקות אלה יכולים בקלות להיות מותאמות לבחינת פעילות הרכב במערכות עצביות אחרות גם כן.

שיטות הקלטה בעל מספר יחידות לאפיין את הפעילות עצבית בארבה (<em&gt; Schistocerca אמריקנה</em&gt;) מעגלי ריח

כאן אנו מתארים את התהליך של צביעה חיסונית שלמה של אנטנות דרוזופילה, המאפשר לנו להבין טוב יותר את המנגנונים המולקולריים המעורבים בגיוון נוירונים של קולטני ריח (ORN).

הר immunolabeling השלם של חוש הריח קולטן נוירונים<em&gt; דרוזופילה</em&gt; אנטנה

אנו מתארים פרוטוקול לשימוש באנטנות חרקים בצורה של אלקטרואנטנוגרמות (EAGs) על רובוטים אוטונומיים. העיצוב הניסיוני שלנו מאפשר הקלטות יציבות תוך יום ופותר כתמי ריח בודדים עד 10 הרץ. היעילות של חיישני EAG לחיפושי ריח מודגמת בהנעת רובוט לעבר מקור ריח.

באמצעות חיישני Electroantennogram חרקים על אוטונומי רובוטים לחיפושי חוש הריח

RNA in situ hybridization (ISH) מאפשר הדמיה של RNA בתאים וברקמות. כאן אנו מראים כיצד ניתן להשתמש בהצלחה בשילוב של RNAscope ISH עם אימונוהיסטוכימיה או צבעים היסטולוגיים כדי לזהות mRNAs הממוקמים באקסונים בחלקים של מוחות עכברים ובני אדם.

איתור של Axonally המותאם למקום mRNAs בסעיפי מוח באמצעות ברזולוציה גבוהה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה

פשפשי מיטה מסתמכים על נוירונים של קולטני ריח השוכנים ברגישות הריח של האנטנות שלהם כדי לזהות סמיוכימיקלים בסביבה. תוך שימוש בהקלטת סנסילום יחידה, אנו מדגימים שיטה להערכת תגובת פשפש המיטה לסמיוכימיקלים ולחקור את תהליך הקידוד הכרוך בכך.

שימוש יחיד Sensillum הקלטה לזיהוי תגובות חוש הריח Neuron של באגס במיטה לSemiochemicals

כאן, אנו מציגים פרוטוקול שלב ומנתחים לפתח חוש הריח רקמות ממינים דרוזופילה . הרקמה ביתור מאוחר יותר ניתן להשתמש עבור ניתוחים מולקולריים, כגון כמותיים RT-PCR (הפוך תמלול-תגובת שרשרת פולימראזית) או RNA רצף (RNAseq), כמו גם ניתוחים ויוו כגון אימונוהיסטוכימיה או בחיי עיר הכלאה.

הכנת לפתח רקמות היקפיים חוש הריח עבור מולקולרית וניתוח Immunohistochemical ב דרוזופילה

מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט ויעיל עבור הקלטות יחיד sensillum basiconica sensilla קאלאמרי של חרקים mouthparts.

Sensillum אחת ההקלטות של ארבה משוש Sensilla Basiconica

מחקר זה מציג פרוטוקולים ניסיוניים עבור מזל"ט גילוי ריח ביו-היברידי המבוסס על אנטנות משי. הפעלת מכשיר אלקטרואנטנוגרם ניסיוני עם אנטנות משי מוצגת, בנוסף למבנה של מזל"ט ביו-היברידי המיועד לוקליזציה של מקור ריח באמצעות אלגוריתם נחשול הספירלה.

רחפן גילוי ריח ביו-היברידי מבוסס אלקטרואנטנוגרפיה באמצעות אנטנות Silkmoth עבור לוקליזציה של מקור ריח

המאמר מתאר את השיטות והריאגנטים הדרושים לביצוע הכלאה של תגובת שרשרת RNA, הכלאה פלואורסצנטית באתרה (HCR RNA, WM-FISH) כדי לחשוף תובנות לגבי הרזולוציה המרחבית והתאית של גנים קולטנים כימו-סנסוריים באנטנת היתושים ובמישוש המקסילרי.

תגובת שרשרת הכלאה RNA פלואורסצנטיות מלאה באתרה הכלאה של גנים כימו-סנסוריים בתוספות ריח יתושים

פעמיים פלואורסצנטי באתרו הכלאה בסעיפים המוח טריים

למדו לוקליזציה של גנים קולטן ריח ברמות ביטוי נמוכות באנטנות חרגולים באמצעות הכלאת RNA in situ עם בדיקות DIG או ביוטין. שיטה זו מאפשרת זיהוי רגיש של ביטוי גנים בעצבנות חרקים.

לוקליזציה של גנים קולטן Odorant ב אנטנות ארבה על ידי RNA

גלה סרטונים נוספים