וזמינותו של זרחון ואיגוד Microtubule יחד עם לוקליזציה של חלבון טאו בתאי סרטן המעי הגס
10 באוקטובר 2017
כתב יד זה מתאר פרוטוקולים סטנדרטיים למדידת hyperphosphorylation טאו, מדידת מחייב טאו microtubules, לוקליזציה של טאו תאיים בעקבות טיפולים תרופות. פרוטוקולים אלה ניתן להשתמש שוב ושוב לסינון סמים או תרכובות אחרות המכוונות איגוד hyperphosphorylation או microtubule טאו.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור זרחון טאו, יכולות קשירת המיקרו-צינוריות של טאו ולוקליזציה של טאו, באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית בתאי סרטן המעי הגס. שיטה זו יכולה להיות יעילה עבור רוב תחומי המחקר הביולוגיים, במיוחד חקר הסרטן והדמנציה, שבהם זרחון וקשירת מיקרו-צינוריות הם גורמים חשובים. היתרון העיקרי של בדיקת הזרחן המוצגת הוא שהיא מספקת דרך קלה לתפוס את כל הזרחן של דגימות חלבון.
היתרון העיקרי הוא מבחן קשירת מיקרו-צינוריות הוא שמדובר בהליך פשוט להפריד את החלבונים הקשורים למיקרו-צינורות משברים לא מחייבים. עם זאת, היתרונות העיקריים של טכניקת לוקליזציה של טאו הם שהיא דורשת כמות קטנה יחסית של נוגדנים ראשוניים ומשניים. כדי להתחיל בהליך זה, הכן את כל הריאגנטים כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
העבירו כמיליון תאי HCT 116 לצלחות תרבית המכילות מדיום חיוני מינימלי בתוספת 10% סרום בקר עוברי ו-1% סטרפטומיצין פניצילין. כאשר התאים מגיעים למפגש של 65%, השתמש בשואב כדי להסיר את המדיום המשלים FBS. לאחר מכן, הוסיפו MEM ללא סרום, המכיל כורכומין או ליתיום כלוריד.
דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באווירה לחה המכילה 5% פחמן דו חמצני למשך 24 שעות. לאחר מכן, יש לשטוף את התאים עם 10 מיליליטר PBS קר כקר. הוסף מיליליטר אחד של PBS קר כקרח, ולאחר מכן השתמש במגרד תאים כדי לגרד את התאים ולהעביר אותם לצינורות צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר.
צנטריפוגה למשך ארבע דקות בטמפרטורה של 1800 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס. אנו משעים את כדורי התא ב-100 מיקרוליטר של מאגר RIPA שלם בארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, ומקפידים להקיש על הצינורות באופן קבוע כדי ליזק את התאים. לאחר מכן, סוניקציה קצרה של הדגימות במשרעת של 10% פועמת למשך 0.2 שניות, וכבויה למשך 0.2 שניות, למשך 2 שניות בסך הכל
.צנטריפוגה התא הומוגנית ב -22, 570 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. העבירו את הסופרנטנטים לצינורות מסומנים חדשים ולאחר מכן מדדו את ריכוז החלבון על ידי בדיקת ברדפורד, כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר הכנת דגימות המכילות 20 מיקרוגרם של חלבון כולל, הוסף שני מיקרוליטרים של מאגר פוספטאז אלקליין ו-10 מיקרוליטר פוספטאז אלקליין לכל אחד.
לאחר מכן, הוסיפו מים מזוקקים, כך שהנפח הסופי של כל דגימה הוא 20 מיקרוליטר. דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. בזמן שהדגימות דוגרות, הכינו דגימות נוספות באותו ריכוז, אך ללא פוספטאז להשוואה.
לאחר שעה, עצור את התגובה על ידי הוספת EDTA בריכוז סופי של 50 מילימולרית או נתרן אורתוואנדאט בריכוז סופי של 10 מילימולר. הוסף מאגר טעינת ג'ל 4XSDS שהוכן טרי המכיל 400 מילימולרי DTT. בעזרת גוש חום, דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.
מערבלים את הדגימות ואז נותנים להן להתקרר בטמפרטורת החדר למשך 10 עד 15 דקות. לאחר מכן, טען 13 מיקרוליטר של דגימה לכל באר וכן את הסולם המולקולרי על ג'ל פוליאקרילאמיד 10%. חבר את מערכת האלקטרופורזה למקור חשמל, והגדר את המתח ל-70 וולט למשך 20 דקות כדי להעביר את דגימות החלבון מג'ל הערימה לג'ל הרמיסה.
לאחר מכן, הגדילו ל-125 וולט והפעילו את הג'ל למשך כ-70 עד 120 דקות עד שהדגימות וסולם החלבון יגיעו לסוף הג'ל. בעזרת מערכת אלקטרובלוטינג רטובה, העבירו את הג'ל על קרום פלואוריד פוליווינילידן ב-100 וולט למשך כ-100 דקות. לאחר מכן, דגרו על הממברנה כדי לספוג אלבומין סרום בקר 4% למשך 90 דקות בטמפרטורת החדר.
דגרו את הכתם למשך הלילה בתמיסת נוגדנים ראשונית בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. למחרת, שטפו את הכתם שלוש פעמים ב-PBST, ושטפו במשך שבע דקות בכל פעם. דגירה בתמיסת הנוגדנים המשניים הלא בטוחה למשך 90 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, יש לשטוף עם PBST ארבע פעמים כאשר כל שטיפה נמשכת שבע דקות. פתח את הכתם באמצעות ערכת כימילומינסנציה בהתאם להוראות היצרן. כסה את הכתם המפותח בניילון שקוף, ולאחר מכן רכוש תמונות כימילומינסנציה של הכתם עם מערכת הדמיה כימילומינסנציה זמינה מסחרית.
לאחר הכנת דגימות טריות, דגרו אותן בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. אולטרה-צנטריפוגה את הדגימות ב-100, 000 פעמים G ו-25 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. לאחר מכן, העבירו 120 מיקרוליטר מכל סופרנטנט המכיל טאו לא קשור לצינורות נפרדים, נקיים ומסומנים.
הוסף 120 מיקרוליטר של מאגר דגימה פיבי לגלולה המכילה טאו קשור. לאחר ערבוב יסודי, על ידי מערבולת ופיפטינג, העבירו את התערובת לצינורות נקיים ומסומנים. לאחר הכנת דגימות בריכוז חלבון שווה ערך, הוסף מאגר טעינת ג'ל 4XSDS טרי המכיל 400 מילי-מולרי DTT.
השתמש בבלוק חום כדי לדגור את הדגימות ב-100 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. מערבלים את הדגימות ואז נותנים להן להתקרר בטמפרטורת החדר למשך 10 עד 15 דקות. טען 13 מיקרוליטר דגימה לבאר ואת סולם המשקל המולקולרי על ג'ל פוליאקרילאמיד 10%.
חבר את האלקטרודות החיוביות והשליליות של מערכת האלקטרופורזה למקור חשמל ולאחר מכן הגדר את המתח ל-70 וולט למשך 20 דקות. לאחר מכן, הגדילו ל-125 וולט והפעילו את הג'ל למשך כ-70 עד 120 דקות עד שהדגימות וסולם החלבון יגיעו לסוף הג'ל. השתמש במערכת אלקטרובלוטינג רטובה כדי להעביר את הג'ל על ממברנת פלואוריד פוליווינילידן ב-100 וולט למשך כ-100 דקות.
דגרו על הממברנה כדי לספוג אלבומין בסרום בקר 4% למשך 90 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, יש לדגור למשך הלילה בתמיסת נוגדנים ראשונית בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, שטפו את הכתם ארבע פעמים עם PBST כאשר כל שטיפה נמשכת שבע דקות.
דגרו את הכתם השטוף בתמיסת הנוגדנים המשנית הרלוונטית למשך 90 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו עם PBST במשך שבע דקות וחזרו על הכביסה בסך הכל ארבע פעמים. פתח את הכתם באמצעות ערכת כימילומינסנציה.
מכסים בניילון שקוף, ומקבלים תמונות באמצעות מערכת הדמיה כימילומינסנציונית. כדי להתחיל, הנח את החלקות הכיסוי לבארות של צלחת כיסוי רקמות בת שש בארות, ולאחר מכן זרע 250,000 תאים לכל באר במדיום התרבות המומלץ. לאחר 24 שעות יש לשטוף את התאים פעמיים עם PBS.
הוסיפו MEM ללא סרום, המכיל כורכומין ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באווירה לחה המכילה 5% פחמן דו חמצני למשך 24 שעות. לאחר מכן, יש לשטוף שוב את התאים ב- PBS קר כקרח. תקן את התאים בפורמלדהיד 3.7% באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, בחושך.
שטפו את התאים עם PBS, ולאחר מכן קבעו את התאים במתנול קר כקרח בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר מכן, דגרו את התאים על הקרח ב-3% BSA ו-0.1% Triconex 100 ב-PBS למשך 10 דקות. שטפו את התאים עם PBS ולאחר מכן דגרו במאגר חוסם למשך שעה בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, הוסף 60 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים ראשונית לחתיכת הפלואוריד החתוכה של פוליווינילידן בכל באר. הנחת הכיסוי מחליקה כך שהתאים יוצרים מגע עם תמיסת הנוגדנים. דגירה למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס בתא לח וחשוך.
למחרת יש לשטוף את התאים ארבע פעמים עם PBS. הוסף 80 מיקרוליטר מתמיסת הנוגדן המשנית לכל אחת מחלקי הפלואוריד הפוליווינילידן והנח את החלקות הכיסוי כך שהתאים יוצרים מגע עם תמיסת הנוגדנים. דגירה בתא לח כהה בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.
לאחר מכן יש לשטוף את התאים ארבע פעמים עם PBS. הרכיב את הדגימות במדיום ההרכבה עם DAPI, ואז תקן את החלקות הכיסוי על שקופיות זכוכית. ואז לדגור בתא חשוך בטמפרטורת החדר למשך שעה וחצי.
בעזרת מיקרוסקופ קונפוקלי בחן את השקופיות. במחקר זה, זרחון טאו ספציפי לציטוט מוערך באמצעות נוגדן פוספו-טאו. נראה כי תאים שטופלו בכורכומין מבטאים ירידה בטאו ככל שריכוז הכורכומין עולה.
ביטויפוספו-טאו, לעומת זאת, נראה כעולה בריכוזים נמוכים יותר של כורכומין, ויורד רק בריכוזים גבוהים מאוד. לאחר מכן נבדקים תאים שטופלו בליתיום כלוריד. כפי שניתן לראות, הביטוי של טאו ופוספו-טאו יורד משמעותית תחת טיפול בליתיום כלוריד.
לאחר מכן מוערך הזרחן הכולל על ידי בדיקת פוספוטאז. נראה כי טאו נודד מהר יותר בדגימות שטופלו בפוספוטאז בהשוואה לדגימת הבקרה הלא מטופלת, מה שמצביע על כך שדגימת הבקרה זרחנית. דגימות תאים שטופלו בכורכומין הראו תוצאות דומות מאוד, מה שמצביע על כך שקווי התאים של סרטן המעי הגס לא הפחיתו את זרחון הטאו.
גם דגימות שטופלו בפוספטאז וגם דגימות שלא טופלו ביצעו אלקטרופוריזציה כמעט באותו טווח בדגימות של תאים שטופלו בליתיום כלוריד, מה שמצביע על ירידה בזרחון טאו. לאחר מכן, בדיקת הקישור המיקרו-צינורית של דגימות תאים נקבעת בהצלחה באמצעות טאו 352 כבקרה חיובית. כפי שמוצג כאן, גם כורכומין וגם ריכוז נמוך של טיפול בליתיום כלוריד מביאים לעיכוב פעילות קשירת מיקרו-צינוריות.
לאחר מכן מבוצעת מיקרוסקופיה קונפוקלית. לאחר טיפול בכורכומין, נראה כי טאו עובר לגרעין. זה תומך במחקרים קודמים, שדיווחו כי טאו גרעיני הוא שחקן מפתח בהגנה על DNA עצבי.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע בדיקת פוספוטאז כדי לקבוע את כל הזרחן של דגימות חלבון וכיצד לבצע בדיקת קשירת מיקרו-צינורות. אתה אמור להיות מסוגל להבין כיצד לבצע בדיקה אימונופלואורסצנטית על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית תוך שימוש בכמויות קטנות יותר של נוגדנים. ההליכים המוצגים כאן הם חסכוניים ועשויים לסייע בגילוי ופיתוח של חומרים טיפוליים חדשים לטיפול בטאו-פורזה וסרטן שונים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
כתב יד זה מפרט פרוטוקולים לבחינת פוספורילציה של tau, קישור למיקרוטובולי ומיקום של tau באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית בתאי סרטן המעי הגס. שיטות אלו ישימות במחקרים על סרטן ודמנציה, תוך התמקדות בחשיבותו של tau בתחומים אלו.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- חקר הסרטן
רקע
- היפר-פוספורילציה של Tau היא גורם קריטי במחלות ניוורו-דגנרטיביות.
- יכולות הקישור של tau למיקרוטובוליים חיוניות ליציבות נוירונלית.
- הבנת הלוקליזציה של tau יכולה לספק תובנות לגבי תפקידיו התפקודיים.
- מיקרוסקופיה קונפוקלית מאפשרת ויזואליזציה מפורטת של tau בתאים.
מטרת המחקר
- למדידת היפר-פוספורילציה של tau בתגובה לטיפולים תרופתיים.
- להערכת הקישור של tau למיקרוטובוליים.
- לאיתור מיקום ה-tau בתוך תאי סרטן של המעי הגס והחוריד.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בדיקות פוספורילציה להערכת מודיפיקציות של tau.
- בדיקות קישור למיקרוטובוליים להפרדת חלבוני קישור.
- מיקרוסקופיה קונפוקלית להדמיית לוקליזציה של tau.
- שימוש בנוגדנים ראשוניים ושניוניים לצורך זיהוי.
תוצאות עיקריות
- ניתן להשתמש בפרוטוקולים באופן חוזר לצורך סריקת תרופות.
- הושגה הפרדה יעילה של חלבונים נקשרי-מיקרוטובולי.
- נדרשות כמויות מינימליות של נוגדנים לצורך לוקליזציה של tau.
- הושגו תובנות לגבי תפקידו של tau בסרטן ובניוון עצבי.
מסקנות
- השיטות המוצגות בעלות ערך לחקר תהליכים הקשורים ל-tau.
- הן יכולות לסייע במחקר של מטרות טיפוליות עבור טאו-פתיות (tauopathies).
- פרוטוקולים אלה משפרים את ההבנה של המשמעות הביולוגית של tau.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הערכת הפספורילציה של tau והקישור למיקרוטובוליים בתאי סרטן המעי הגס מספקת תובנות מכניסטיות לגבי תפקידו הדואלי של tau בניוון עצבי ובאונקולוגיה. בדיקות אלו מאפשרות תיקוף של מטרות (target validation) על ידי קישור של מודיפיקציות פוסט-טרנסלציונליות לתוצאות תפקודיות במערכות תאיות הרלוונטיות למחלה. גישה זו תומכת בביטחון חיזוי בסריקת תרכובות המודולות את הפתולוגיה של tau בתחומי טיפול שונים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן השערות טיפוליות על ידי מדידת מצבי הפספורילציה של tau ומסוגלות קישור למיקרוטובולי במודלים של סרטן המעי הגס.
- ערך תפעולי: משתמש במבחני פוספטאז ובמבחני קישור למיקרוטובולי להפחתת סיכונים של מעורבות המטרה באמצעות תוצאות ביוכימיות כמותיות.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיק הפיתוח על ידי זיהוי תרכובות המשנות את מיקומו ותפקודו של tau, רלוונטי הן לטאו-פתיות (tauopathies) והן לאסטרטגיות נגד סרטן.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: הכנת מערכות תאיות שעברו תיקוף לצורך סריקות המשך, באמצעות קביעת פרופילי בסיס של פוספורילציית tau וקישוריות.
- ערך תפעולי: מאפשר סטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות הכנת דגימות הניתנת לשחזור, כולל זיהוי נוגדנים בריכוז נמוך לצורך מחקרי לוקליזציה.
- יכולת הרחבה: תומך בשימוש חוזר במסעות סריקה של תרכובות המכוונות להיפר-פוספורילציה של tau או לאינטראקציה עם מיקרוטובוליים.
מחקר תרגומי וטרום-קליני
- ערך מדעי: בוחן לוקליזציה תוך-תאית של tau באמצעות אימונוהיסטוכימיה ומיקרוסקופיה קונפוקלית, ומקשר בין שינויים מולקולריים לפנוטיפים תאיים במערכות רלוונטיות למחלה.
- ערך תפעולי: דורש כמות מינימלית של נוגדנים ראשוניים ושניוניים, מה שמפחית את עלויות הריאגנטים תוך שמירה על רגישות זיהוי עבור מחקרים אורכיים.
- המשכיות תרגומית: מחבר תובנות מכניסטיות משלב הגילוי להערכה פרה-קלינית באמצעות מעקב אחר התנהגות ה-tau תחת הפרעה פרמקולוגית.
שילוב בצינור העיבוד ובזרימת העבודה
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של גילוי מוקדם על ידי אספקת תוצאות (readouts) אורתוגונליות לגבי מודיפיקציה, קישור ומיקום של tau, ובכך מסייעת בקבלת החלטות לגבי זיהוי מובילים (lead identification) לפני המעבר לשלב הפרה-קליני.
- ביולוגיה של תגליות: תומך בבדיקת השערות לגבי תפקידו של tau ביציבות מיקרוטובוליים ובטרנסלוקציה גרעינית תחת טיפול תרופתי.
- סקר (Screening): מספק תוצאות כמותיות מבדיקות פוספטאז ומבדיקות קישור המאפשרות השוואה של השפעות תרכובות על הביוכימיה של tau.
- אנליטיקה: מייצר שינויים מדידים בניידות חלבונים ובחלקיקי קישור המסייעים לצוותים לתעדף פגיעות (hits) על בסיס הפחתת סיכונים ביוכימית.
- מחקר תרגומי: מקשר בין שינויים ביוכימיים להפצה מחדש תת-תאית, ובכך תומך בנתיבי התקדמות המותאמים לסממנים ביולוגיים כאשר נתוני המקור תומכים במתאם.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה רב-פעמית להערכת תרכובות המכוונות ל-tau בתיקי פיתוח של אונקולוגיה וניוון עצבי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מנגיסטית על ידי מתאם בין מצבי פוספורילציה של tau לבין קישור פונקציונלי למיקרוטובוליים ומיקום תת-תאי.
- ערך תפעולי: מייצב את זרימות העבודה להכנת דגימות, אלקטרופורזה, בלוטינג ודימוי, ובכך משפר את השחזוריות בין אתרים שונים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות go/no-go על ידי אספקת נתונים רב-פרמטריים על מעורבות המטרה, ובכך מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בתוכניות המתמקדות ב-tau.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון של תרכובות המדגימות השפעות תלויות-מינון על פוספורילציה, קישור או טרנסלוקציה גרעינית של tau.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בביוכימיה של חלבונים, אלקטרופורזה, בלוטינג ומיקרוסקופיה קונפוקאלית לביצוע ופירוש מדויקים של הבדיקה.
- תלוי בגישה לאולטרה-צנטריפוגה, למערכות דימוי כימילומניסנציה ולמיקרוסקופי פלואורסצנציה עם סטים של מסננים מתאימים.
- מחייב סטנדרטיזציה של ריכוזי הנוגדנים, זמני האינקובציה ותנאי הבופר כדי להבטיח מדידות עקביות של פוספורילציה וקישור.
- כולל שיקולי התאמה כאשר מרחיבים את הבדיקות לקווי תאים אחרים או לאיזופורמות של tau מעבר ל-HCT 116 ו-tau באורכו המלא.
- מוגבל בשל אופיה החצי-כמותי של בדיקות הקישור והשונות הפוטנציאלית ביעילות הפוספטאז בין הכנות דגימה שונות.
שאלות נפוצות בתחום הביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:01
Cell Culture, Treatment, and Examination of Protein Expression
2:53
Phosphate Assay
5:22
Microtubule-binding Assay
7:55
Localization and Expression of Tau After Treatment of Cells with Curcumin
10:23
Results: Phosphorylation, Microtubule Binding, and Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells
12:03
Conclusion
