הקלטה הפלסטיות הסינפטית בפרוסות בהיפוקמפוס חריפה, בהשתתפות של מיחזור - בנפח מצומצם, זלוף- ומערכת ועלייתו-סוג תא

המטרה הכוללת של הליך זה היא לספק שיטה להבטיח אמצעים פשוטים של קרבוגנציה של ACSF מיחזור בנפח קטן ולהשיג הקלטות ארוכות טווח של פוטנציאל שדה באמצעות תא הקלטה המותקן על מיקרוסקופ פלואורסצנטי. שיטה זו יכולה לעזור לנו לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירופלסטיות הנוגעות למסלולי הליגנין הבסיסיים המווסתים את ההעברה הסינפטית והיווצרות הזיכרון במצב תאי של למידה וזיכרונות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא עוזרת לייצב את רמת החמצן של מאגר ביולוגי קטן כדי לשפר את יעילות העלות של הניסויים באמצעות אנטגוניסטים או אגוניסטים ספציפיים.

הכנת פרוסות ההיפוקמפוס החריפות מודגמת על ידי הדוקטורנטים, שיה ווייגואנג מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל בהליך זה, השתמש בלהב כירורגי קר כדי לנתח חלק מקליפת המוח הגבית בזווית של 70 מעלות לאורך הקצה הגבי של כל חצי כדור. בעזרת מרית צמנט דנטלי קרה, העבירו כל חצי כדור לפיסת נייר סינון כדי לייבש את המשטח בקצרה.

הרכיבו את שתי ההמיספרות עם משטחים חתוכים טריים על משטח החיתוך הקר כקרח באמצעות דבק דבק מהיר כך שהקצה הזנבי של חצאי הכדור פונה לסכין הגילוח. לאחר מכן, הנח את פלטפורמת החיתוך בתא הקירור של ויברטום. מלאו את החדר במאגר החיתוך בשתיים עד ארבע מעלות צלזיוס וקרבוגנאט אותו.

לאחר מכן, חותכים פרוסות של 350 מיקרומטר באמצעות הגדרות ויברוטום נאותות. בודד את היווצרות ההיפוקמפוס מהסוביקולום וקליפת המוח האנטורינית באמצעות שתי צינוריות הזרקה כמספריים. הסר את הבועות מהרשת המחזיקה את הפרוסות של תא הדגירה שהוכן בעבר באמצעות פיפטת פסטר.

לאחר מכן, העבירו את הפרוסות בעלות שקיפות מסוימת בשכבה הפירמידלית ממשטח החיתוך על רשת תא הדגירה בעזרת פיפטת פסטר עם פה גדול. בשלב זה, הוסף מחבר צינור תלת כיווני ליציאת מערכת המיחזור. חבר את הזרוע האמצעית של מחבר הצינור התלת-כיווני לצינור אספקת קרבוגן ולווסת את קצב הזרימה באמצעות מד זרימת אוויר.

לאחר מכן, הוסף מחבר צינור תלת כיווני שני לזרימת מערכת המיחזור. חבר את הזרוע האמצעית לצינור הפונה לתנור החימום המוטבע, את הזרוע העליונה לצינור סיליקון דק ואת הזרוע התחתונה לצינור הזרימה מהמאגר. לאחר מכן, הנח מסחטת צינור על צינור סיליקון דק במיקום לאורך הצינור שבו פעימת ה-ACSF בתא הפרוסות שנוצרת על ידי המשאבה הפריסטולית היא המינימלית.

כעת, השרו מראש פיסת נייר קטנה לניקוי עדשות ורשת ניילון קבועה על חוט פלטינה בצורת U בתא פרוסות הטבילה למשך מספר דקות. לאחר מכן, הסר את חוט הפלטינה בצורת U. כבה את המיחזור והנח פרוסה על נייר ניקוי העדשות.

לאחר מכן, הנח מיד את הרשת המחזיקה את הפרוסה על גבי הפרוסה. הפעל את המשאבה ותן לפרוסה להתייצב למשך 30 דקות מבלי לטבול את המטרה ב-ACSF. בינתיים, מלאו את אלקטרודת ההקלטה ב-ACSF והרכיבו אותה לתוך מחזיק הפיפטה.

בדוק את הבידוד של אלקטרודת גירוי המתכת על ידי הנחתה בתמיסת נתרן ביקרבונט. חבר את האלקטרודה לקוטב השלילי של מחולל מתח DC וצפה בהיווצרות בועות בקצה תחת מיקרוסקופ דיסקציה. לאחר מכן, הנח את אלקטרודת גירוי הטונגסטן המבודדת אפוקסי שנבדקה במחזיק המניפולטור ואת חוט הייחוס בתא הפרוסה.

הוסף אלקטרודת ייחוס שנייה לתא וחבר אותה לשקע הייחוס של שלב הראש של אלקטרודת ההקלטה. בתוכנת בקרת המגבר, לחץ על אפס clamp תיבת מצב ולאחר מכן לחץ פעמיים על תיבת רשימת רווח הפלט. בחר רווח של 100, לחץ פעמיים על כלי תיבת הסינון הגבוה, בחר שלושה קילו-הרץ ולחץ פעמיים על תיבת רשימת מסנני המעבר הנמוך AC כדי לבחור 0.1 הרץ.

בתוכנת ההקלטה, לחץ על רכישה, פרוטוקול פתוח. בחר פרוטוקול שיש לו את ההגדרות המאפשרות גירויים אפיזודיים ודיגיטציה של פוטנציאלים מוגברים ב-10 עד 20 קילו-הרץ למשך 50 עד 100 מילישניות ושמפעיל אוטומטית מבודד גירוי 10 אלפיות השנייה לאחר תחילת הקלטה אפיזודית. הנח את אלקטרודות הגירוי וההקלטה בקו ובמקביל לשכבה הפירמידלית.

לאחר מכן, לחץ על רכישה, ערוך פרוטוקול ובחר את כרטיסיית הטריגר בחלון המוקפץ. לחץ על תיבת מקור הטריגר ובחר מקש רווח כמקור הטריגר. לאחר מכן, לחץ על כפתור אישור ולחץ על כפתור ההקלטה כדי להתחיל ברכישה.

בתוכנת מבודד הגירוי, לחץ על תיבת בקרת המתח והזן אפס. לחץ על כפתור ההורדה. לאחר מכן, לחץ על חלון תוכנת ההקלטה ולחץ על מקש הרווח.

חזור על מחזור זה על-ידי הזנה רציפה של ערכים מ- 1000 עד 8000. מתאם את עוצמת הגירוי עם ערכי שיפוע FEPSP וקובע את עוצמת הגירוי הנדרשת כדי לקבל 40% מהשיפוע המקסימלי של FEPSP. לחץ על תיבת בקרת המתח והזן את הערך שנקבע.

לאחר מכן, לחץ על כפתור ההורדה. בתוכנת ההקלטה, לחץ על כפתור העצירה ולאחר מכן על תפריט הרכישה. לחץ על ערוך פרוטוקול ובחר בכרטיסיית הטריגר בחלון המוקפץ.

לאחר מכן, לחץ על תיבת מקור הטריגר ובחר את הטיימר הפנימי כמקור הטריגר. לחץ על כפתור האישור, ואחריו על כפתור ההקלטה שמתחיל את ההקלטה האוטומטית של פוטנציאל השדה כל 60 שניות. לחץ על כפתור העצירה לאחר 30 עד 60 דקות.

בתוכנת ההקלטה, לחץ על Acquire, פתח פרוטוקול ובחר את אותו פרוטוקול כמו ההקלטה הבסיסית. לחץ על לחצן אישור ולאחר מכן לחץ על הקלט. המשך להריץ אוטומטית את ההקלטות הפוטנציאליות בשטח למשך שעתיים עד ארבע שעות.

בסיום, לחץ על כפתור העצירה כדי לסיים את ההקלטה. איור זה מציג את ההקלטות המייצגות של העצמה תלוית פעילות של העברה סינפטית באמצעות קרבוגנציה של זרימה יוצאת וקרבוגנציה של מאגר עם מיחזור של מאגר ACSF קטן. החיזוק הושרה לאחר נקודת זמן אפס בשלוש פעמים 100 הרץ לשנייה.

איור זה מראה שהקרבוגנציה היוצאת עם מיחזור של מאגר ACSF קטן שיפרה את האינדוקציה של LTD בהשוואה לניסויים עם קרבוגנציה של מאגר בלבד. לאחר השליטה, ניתן לבצע את הכנת הפרוסה תוך חמש עד 10 דקות וניתן להשיג גם רישום פוטנציאלי שדה יציב במשך שעות רבות אם הוא מבוצע כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב להתאים את רמת הקרבוגנציה שלך, מהירות הזילוף, מיקום האלקטרודות ומתח הגירוי של השקילות הספציפית שלך.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטה אחרת כמו מהדק התיקון, ניתן לבצע את המיקרוסקופיה המשפטית על מנת לענות על שאלות נוספות כמו ויריליזציה של לוקליזציה של תאי מוהל של בדיקות עורקים בתגובה לאינדוקציה של פלסטיות סינפטית תלוית פעילות. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום הנוירופלסטיות לחקור פלסטיות סינפטית תלוית פעילות כמצב תאי של למידה וזיכרון בפרוסות היפוקמפוס במבחנה של גנים של עכברים טרנסגניים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לבצע הכנת פרוסות חריפה מההיפוקמפוס הטמפורלי וכיצד להשיג תנאים יציבים להקלטה ארוכת טווח של שידורים סינפטיים באמצעות נפח קטן של ACSF ממוחזר.

אל תשכח שעבודה עם בעלי חיים ותרכובות כימיות עלולה להיות מסוכנת ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון לבישת כפפות וחיטוי נכון בעת ביצוע הליך זה.