שיפור היישום של משקל מולקולרי גבוה Biotinylated לתוספי אמין עבור היטל Thalamocortical עקיבה בחולדה

המטרה הכוללת של סרטון זה היא להדגים פרוטוקול מעודן ליישום BDA במשקל מולקולרי גבוה לחקר התיוג העצבי האופטימלי במערכת העצבים המרכזית. מדד זה יכול לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הרשתות העצביות. על ידי הדמיית מבנה המסגרת של תיוג עצבי באמצעות מעגלים עצביים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מספקת את האפשרות להפעיל מעגלים עצביים מקומיים ואת המאפיינים הכימיים שלהם. הכינו מיקרו-מזרק מיקרוליטר אחד, המצויד במיקרופיפט זכוכית, ובדקו אותו על ידי שאיבת פרפין נוזלי. לאחר הרדמת החולדה באמצעות פרוטוקול מאושר, אשר הרדמה עמוקה על ידי היעדר תגובה לצביטה בזנב.

לאחר מכן גלחו את החלק העליון של ראש החיה עם סכין גילוח חשמלי ושפשפו את מקום הניתוח עם 10% פובידון יוד, ואחריו 70% אתנול. אבטח את החולדה למכשיר הסטריאוטקסי על ידי הכנסת מוטות אוזניים קהים לאוזניים והנחת החותכות העליונות של החולדה למחזיק הפה. מרחו משחה עיניים על העיניים.

השתמש בכפפות ווילונות כירורגיים סטריליים כדי לשמור על תנאים סטריליים. נקה שוב את עור הראש של אתר הניתוח באמצעות אתנול 70%. לאחר ביצוע חתך סגיטלי בעור בעזרת אזמל, לאורך התפר הסגיטלי, השתמש באפליקטורים סטריליים עם קצה כותנה כדי לגרד את השריר והפריאוסטאום הרחק מהגולגולת.

בעזרת קואורדינטות מוגדרות מראש מאטלס, קבע את מיקום הגולגולת. בצע קרניוטומיה באמצעות מקדחת קוצים עם קצה עגול כדי לקדוח לעומק של כמילימטר אחד עד שקרומי המוח נראים לעין. כרתו את הדורה מאטר באמצעות מיקרו מלקחיים כדי לחשוף את קליפת המוח מעל אתר ההזרקה.

הוציאו את הפרפין הנוזלי מהמיקרו-מזרק ואז ציירו תמיסת BDA של 10%. התקן את המזרק למנגנון המיקרו-הזרקה וחבר את המיקרו-משאבה. תחת סטריאומיקרוסקופ, תפעל את מכשיר המיקרו-הזרקה.

הכניסו את המיקרופיפט הזכוכית המלא לתוך ה-VPM דרך פני השטח של קליפת המוח לעומק של 5.8 מילימטרים. לאחר מכן, השתמש במיקרו-משאבה כדי להזריק בלחץ 100 ננוליטר של 10% BDA לתוך ה-VPM, במשך תקופה של שלוש דקות. לאחר חמש דקות, משוך לאט את הפיפט.

תפרו את הפצע בחוט סטרילי, ואז הניחו את החולדה באזור התאוששות חם, עד שהיא חוזרת להכרה ומתאוששת לחלוטין. לאחר המתת חסד של החולדה, השתמש במספריים ובמלקחיים כדי לפתוח את חלל בית החזה של החולדה ולגשת ללב. הכנס קטטר תוך ורידי לחדר השמאלי, לכיוון אבי העורקים, ולאחר מכן פתח את האפרכסת הימנית.

ראשית, יש להחדיר תמיסת מלח של 0.9% בטמפרטורה פיזיולוגית, למשך כדקה עד שתיים, עד שהדם היוצא מהלב צלול. ואז המשיכו עם 250 עד 300 מיליליטר של 4% פרפורמלדהיד, במאגר פוספט מולארי של 0.1. לאחר תיקון המוח המנותח ב-4% פרפורמלדהיד למשך שעתיים בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן העבירו את המוח ל-30% סוכרוז ב-0.1 PBS מולארי והקפאה למשך שלושה ימים בארבע מעלות צלזיוס. לאחר שלושה ימים, כאשר המוח שקע בתמיסה, חלקו את המוח לשלושה בלוקים בכיוון העטרה בעזרת מטריצת מוח. הגוש המרכזי מכיל את הגרעין האחורי המדיאלי הגחוני של התלמוס בקליפת המוח הסומטוסנסורית הראשונית.

הרכיבו את הבלוק המרכזי של המוח על שלב ההקפאה של המיקרוטום הגולש לחיתוך במישור העטרה וחתכו ב-40 מיקרון כשהוא קפוא. אוספים את החלקים בכלי בן שש בארות, המכיל 0.1 PBS מולארי. התחל לצבוע על ידי שטיפת החלקים ב-0.1 PBS טוחנת למשך כדקה עם נדנדה.

לאחר מכן העבירו את החלקים לתמיסה מעורבת של סטרפטווידין-AF594 בצבע ניסל פלואורסצנטי ירוק AF500/525 ב-0.1 PBS מולארי המכיל 0.3% טריטון X-100, ודגרו במשך שעתיים בטמפרטורת החדר. לאחר הצביעה יש לשטוף את החלקים שלוש פעמים ב- 0.1 PB טוחנת עם נדנדה. הרכיבו את החלקים על שקופיות המיקרוסקופ בטכניקות היסטוכימיות סטנדרטיות.

יבש את החלקים באוויר למשך כשעה. מרחו 50% גליצרין במים מזוקקים על החלקים התורניים והחלקת הכיסוי לפני הדמיית השקופיות. פוטומיקרוגרף מייצג זה מציג את אתר ההזרקה של BDA באדום של גרעין הגחון האחורי-מדיאלי של התלמוס על רקע צביעת ניסל ירוקה.

תיוג BDA thorescent מוצג כאן, כולל אקסונים של תלמיל קורטיקול בשכבה ארבע ונוירונים תלמיים בקליפת המוח בשכבות חמש ושש. לשם השוואה, פוטומיקרוגרף זה מדגים כי תיוג BDA קונבנציונלי עם הליך אבידין-ביוטין פרוקסידאז סטנדרטי חושף דפוס דומה של תיוג עצבי לתיוג BDA יסודי. תצוגת הגדלה גבוהה יותר זו של חתך בתווית BDA מראה את הסורגים האקסונליים המסומנים באנטרוגרדיה בפירוט, באדום.

גוף התא העצבי המסומן בדיעבד, דנדריטים ועמודי שדרה דנדריטיים מוצגים כאן בפירוט. לאחר השליטה, ניתן לבצע קרניוטומיה והזרקה סטריאוטקסית תוך 20 עד 30 דקות, אם היא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליישם BDA במשקל מולקולרי גבוה כדי להחיות קשרים עצביים ומבנה מפורט של תיוג עצבי.