Name: שיפור היישום של משקל מולקולרי גבוה Biotinylated לתוספי אמין עבור היטל Thalamocortical עקיבה בחולדה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: למד פרוטוקול משופר להחלת BDA במשקל מולקולרי גבוה למעקב אחר מעגלים עצביים במערכת העצבים המרכזית של חולדות. שיטה זו מאפשרת הדמיה ברורה של מבנים עצביים ותכונות כימיות מקומיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן על ידי נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (פרוייקט קוד מס 81373557; 81403327 מס).

מחקר זה אושרה על ידי ועדת האתיקה-סין האקדמיה הסינית למדעי הרפואה (אסמכתא מס ' 20160014). כל ההליכים נערכו לפי מוסדות לאומיים של בריאות המדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה (הלאומית האקדמיה Press, וושינגטון די. סי., 1996). ארבעה חולדות זכר בוגר (משקל 250-280 גרם) השתמשו במחקר זה. כל בעלי החיים היו בבניין מחזור/כהה 12 שעות עם מבוקר טמפרטורה ולחות, איפשרה גישה ללא מזון ומים. כלים וחומרים השתמשו במחקר הנוכחי היו הראה באיור1.  לפני הניתוח, כל הכלים, כגון מסגרת stereotaxic פיפטה מזכוכית, נוקו באמצעות אתנול 70%.
1. ניתוחים
<ol><li>קובעים את האזור קואורדינטות עניין ב- VPM באמצעות stereotaxic אטלס9 (איור 2 א).</li>
	<li>להכין 1 µL מיקרו-מזרק מצויד micropipette זכוכית (בקוטר טיפ של 10-20 מיקרומטר) (איור 1D) לבדוק את זה עם שמן פראפין.</li>
	<li>עזים ומתנגד החולדות עם 7% כלורין (0.7 מ של 100 גרם) על ידי הזרקת בקרום הבטן.</li>
	<li>לאחר הרדמה עמוקה הוא אישר עם זנב קמצוץ, פדלים רפלקס הנסיגה, לגלח את הראש של החיה עם מכונת גילוח חשמלית ו לשפשף את האתר כירורגית 3 פעמים עם 10% povidone יוד ואחריו אתנול 70% בהתאמה.</li>
	<li>למקם את החולדה המכשיר stereotaxic על-ידי הצבת האוזן בוטה ברים לתוך אוזניה, למקם החותכות העליונות של החולדה בעל הפה (איור 1E), ולאחר מכן החל אופטלמולוגיות משחה על העיניים.</li>
	<li>לנקות את העור הראשי של האתר כירורגית שוב באמצעות אתנול 70%. להשתמש כפפות כירורגי סטרילי ומגבות כדי לשמור את הניתוח בתנאים סטריליים.</li>
	<li>עושים חתך הסאגיטלי בעור עם איזמל לאורך התפר המשונן (איור 1F).</li>
	<li>לגרד את השריר ואת קרום העצם מן הגולגולת באמצעות applicators שקצהו כותנה סטרילי לאורך כל הניתוח כדי לשלוט הדימום (איור 1F).</li>
	<li>בעזרת הקואורדינטות מוגדרת מראש מתוך אטלס (איור 2 א), לקבוע את המיקום (-3.3 מ מ Bregma נקודות, 2.6 מ מ הזכות קו האמצע) של גולגולת (איור 1 ג'י).</li>
	<li>לבצע ניתוח של פתיחת גולגולת באמצעות תרגיל בר עם מעט עגול-טיפ (#106) (איור 1 H) ולהמשיך קידוח כדי על 1 מ מ לעומק תוך מספר דקות עד שהגיע קרומי המוח (איור 1I).</li>
	<li>בלו קרום הדורה באמצעות microforceps לחשוף את קליפת המוח במהלך ההזרקה (איור 1I).</li>
	<li>לשנות פרפין נוזלי במזרק המיקרו-עם 10% BDA (10,000 משקל מולקולרי, במים מזוקקים) פתרון (איור 1J).</li>
	<li>בעיא המזרק המנגנון microinjection וחבר עם מיקרו-משאבה (איור 1 K). הערה: אמצעי האחסון מוזרק נמצא תלוי על המהירות של המיקרו-המשאבה. כאן זה היה מותאם nL 30/min (איור 1 L).</li>
	<li>תחת stereomicroscope, הכנס של micropipette זכוכית באופן ידני עם המנגנון microinjection VPM דרך השטח בקליפת המוח של המוח בעומק של 5.8 מ מ (איור 1 מ').</li>
	<li>לחץ-להזריק 100 nL של 10% BDA לתוך VPM על פני תקופה של 3 דקות (nL 35/דקה) עם מיקרו-משאבה (איור 1 L, M).</li>
	<li>לאחר ההזרקה, לשמור על פיפטה במקומם 5 דקות נוספות, ואז לסגת לאט.</li>
	<li>תפר את הפצע עם חוט סטרילי (איור 1N). בצע את הנחיות ועדת טיפול בבעלי חיים מקומיים מראש, לאחר ניתוח נגד כאבים.</li>
	<li>למקם את החולדה באזור השחזור חמים עד שהיא תשוב להכרה הוא התאושש לחלוטין.</li>
	<li>להחזיר את החולדה התאושש בחזרה לכלוב שלו.</li>
</ol>2. perfusions ומקטעים
<ol><li>כעבור זמן הישרדות של בדרך כלל 10 ימים, להזריק החיה עם מנת יתר של 10% urethane (2 מ"ל של 100 גרם) על ידי הזרקת בקרום הבטן לזירוז המתת חסד.</li>
	<li>Perfuse העכברושים ניסיוני בשכונה (איור 1O).<ol>
<li>לאחר עוצר הנשימה, באמצעות מספריים, מלקחיים, לפתוח את חלל בית החזה של העכברוש לגשת הלב. להכניס קטטר תוך ורידי של החדר השמאלי כלפי אבי העורקים, ולאחר מכן פתח את auricle נכון.</li>
		<li>קודם perfuse עם 0.9% באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) בטמפרטורת פיזיולוגיים (37 מעלות צלזיוס) כ 1-2 דקות עד היציאה מן הלב הוא נקה ולאחר מכן המשך עם 250-300 מ ל 4% paraformaldehyde במאגר פוספט 0.1 M (PB, pH 7.4).</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאחר זלוף, פצעים וחתכים בעור הראש, לפתוח את הגולגולת, ואז לנתח את המוח חולדה. פוסט-לתקן את המוח ביתור ב 4% paraformaldehyde עבור 2 h בטמפרטורת החדר (26 ° C), אז cryoprotect ב- 30% סוכרוז ב- PBS 0.1 M (pH 7.4) במשך 3 ימים ב 4 ° C עד המוח הוא שקוע הפתרון (איור 1 P).</li>
	<li>ברגע המוח הוא שקוע הפתרון, לחלק את המוח שלושה גושי בניינים לכיוון הילתית על מטריצות המוח (איור 1Q). הגוש המרכזי מכיל את VPM ואת S1.</li>
	<li>חותכים את הגוש המרכזי של המוח-40 µm על שלב ההקפאה הזזה מיקרוטום מערכת בכיוון הילתית. איסוף מקטעים אלה מסודרת בצלחת 6-ובכן עם 0.1 M PBS (pH 7.4) (דמויות 1R, S).</li>
</ol>3. תקן ABC מכתים
הערה: חינם צף מקטעים של כל קטע הילתית השלישי של המוח שימשו להמחשת BDA תיוג עם ABC סטנדרטי הליך10.
<ol><li>לשטוף בסעיפים PBS 0.1 M עבור-1 דקות.</li>
	<li>דגירה בסעיפים 1% פתרון ABC 0.1 M PB (pH 7.4) המכיל 0.3% טריטון X-100 לשעה בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לשטוף את המקטעים שלוש פעמים ב 50 מ מ טריס מאגר (pH 7.4).</li>
	<li>כתם הסעיפים בתמיסה המכילה 0.02 נקודות % 3, 3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) ו- 0.01% H2O2 במאגר טריס 50 מ מ, כ- 2-5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לשטוף את המקטעים שלוש פעמים ב 50 מ מ טריס מאגר (pH 7.4).</li>
	<li>הר הסעיפים על שקופיות מיקרוסקופ באמצעות טכניקות פתולוגיה סטנדרטי (איור 1T; ראה משלימה השלישי קובץ וידאו, זלוף ומקטעים).</li>
	<li>יבש הסעיפים באוויר הלילה בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>מייבשים את המקטעים בקצרה בסדרה של אלכוהול (50%, 70%, 95%, 100%) פתרונות. להטביע את השקופיות כל פתרון עבור-15 s. אל תאפשר את השקופיות להתייבש בין שלב לשלב.</li>
	<li>נקה בסעיפים קסילן שלוש פעמים, בערך 20 דקות.</li>
	<li>לשים הפרוסות 2 או 3 טיפות בלזם ואז במקום coverslips על הסעיפים.</li>
</ol>4. צביעת פלורסנט כפול BDA ולא בסיסיות עצביים רכיבי בתוך קליפת המוח
הערה: לעומת זאת, צביעת פלורסנט כפול בוצע להתבוננות הקורלציה של BDA תיוג, אלמנטים בסיסיים עצבית על הסעיפים סמוכים לעיל להשתמש עם streptavidin-AF594, counterstained עם Nissl פלורסנט הכתם AF500/525.
<ol><li>לשטוף בסעיפים PBS 0.1 M עבור-1 דקות.</li>
	<li>דגירה בסעיפים פתרון מעורבות של streptavidin-AF594 (שבערך), AF500/525 ירוק ניאון Nissl הכתם (1:1, 000) ב- PBS 0.1 M (pH 7.4) המכיל 0.3% טריטון X-100 עבור 2 h בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לשטוף את המקטעים שלוש פעמים ב 0.1 M PB (pH 7.4).</li>
	<li>הר הסעיפים על שקופיות מיקרוסקופ בטכניקות פתולוגיה סטנדרטי. יבש הסעיפים באוויר לשעה בערך.</li>
	<li>חלות coverslips הסעיפים פלורסנט עם גליצרין 50% במים מזוקקים לפני התצפית.</li>
</ol>5. צביעת פלורסנט כפול BDA ו Interneurons של קליפת המוח
הערה: צביעת פלורסנט כפול בוצע להתבוננות הקורלציה של BDA תיוג ו interneurons על הסעיפים נציג את המטרה קורטיקלית עם streptavidin-AF594, PV-נוגדנים.
<ol><li>לשטוף בסעיפים נציג 0.1 M PBS (pH 7.4) במשך כ- 1 דקות.</li>
	<li>דגירה בסעיפים פתרון חסימה המכיל סרום עז רגיל 3% ו- 0.3% טריטון X-100 ב 0.1 M PBS למשך 30 דקות.</li>
	<li>להעביר את המקטעים לתוך פתרון של העכבר monoclonal אנטי-PV IgG (1:1, 000) 0.1 M PBS (pH 7.4) המכיל 1% עז נורמלי סרום ו- 0.3% טריטון X-100 נלון ב 4 º C.</li>
	<li>למחרת, לשטוף את המקטעים שלוש פעמים ב- PBS 0.1 M (pH 7.4).</li>
	<li>לחשוף את הסעיפים פתרון מעורבות של עז אנטי-mouse-AF488 משני נוגדנים (שבערך), streptavidin-AF594 (שבערך) ו 4 אינץ ', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (דאפי, 1:40, 000) בנסיוב 0.1 M PBS (pH 7.4) המכיל 1% עז רגילה 0.3% טריטון X-100 לשעה.</li>
	<li>חזור על שלבים 4.3-4.5.</li>
</ol>6. תצפית
<ol><li>קח תמונות של VPM, thalamocortical אקסונים, corticothalamic נוירונים.<ol>
<li>להתבונן הדגימות פלורסנט עם מערכת הדמיה קונאפוקלית מצויד עם מטרות עדשות (4 x, נה: 0.13; 10 x, נה: x 0.40; ל-40, נה: 0.95). השתמש אורכי הגל עירור, פליטה של 405 (ירוק) (כחול), 488 ננומטר (אדום) 559. הערה: כאן חריר קונאפוקלית זה 152 מיקרומטר (4 x, 10 x) ו- 105 מיקרומטר (40 x). הרזולוציה המרחבית של לכידת התמונה הוא 1024 × 1024 פיקסלים (4 x, 10 x) 640 × 640 פיקסל (40 x).</li>
		<li>סעו עשרים תמונות במסגרות רצופים של 2 מיקרומטר כל סעיף בעובי של 40 µm (סדרת Z).</li>
		<li>לשלב התמונות תמונה אחת בפוקוס בתמונה קונאפוקלית עיבוד מערכת תוכנה לניתוח תלת מימדי כדלקמן: התחל קבע במישור המוקד ← סוף קבע במישור המוקד ← שלב הגדרת גודל ← לבחור עומק דפוס ← תמונת לכידת ← Z סדרות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לקחת תמונות brightfield על ידי מיקרוסקופ אור מצויד with a מצלמה דיגיטלית (4 x, נה: 0.13; 10 x, נה: x 0.40; ל-40, נה: 0.95 עדשות). השתמש את זמן החשיפה של גב' 500 להשתמש בתוכנה לעריכת תמונות כדי להתאים את הבהירות והחדות של התמונות להוסיף תוויות.</li>
</ol>

<ol><li>Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylated+dextran+amine+as+an+anterograde+tracer+for+single-+and+double-labeling+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies.</a> J Neurosci Methods. 41, 239-254 (1992).</li>
<li>Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y., Del Mar, N., Honig, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathway+tracing+using+biotinylated+dextran+amines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Pathway tracing using biotinylated dextran amines.</a> J Neurosci Methods. 103, 23-37 (2000).</li>
<li>Ling, C., Hendrickson, M. L., Kalil, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+the+detailed+structure+of+cortical+and+thalamic+neurons+in+the+adult+rat+brain+with+refined+biotinylated+dextran+amine+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Resolving the detailed structure of cortical and thalamic neurons in the adult rat brain with refined biotinylated dextran amine labeling.</a> PLoS One. 7, e45886(2012).</li>
<li>Zhang, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterograde+and+retrograde+tracing+with+high+molecular+weight+biotinylated+dextran+amine+through+thalamocortical+and+corticothalamic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Anterograde and retrograde tracing with high molecular weight biotinylated dextran amine through thalamocortical and corticothalamic pathways.</a> Microsc Res Tech. 80, 260-266 (2017).</li>
<li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylated+dextran+amine+anterograde+tracing+of+the+canine+corticospinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regen+Res%22%5BJournal%5D)">Biotinylated dextran amine anterograde tracing of the canine corticospinal tract.</a> Neural Regen Res. 7, 805-809 (2012).</li>
<li>Armstrong-James, M., Callahan, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thalamo-cortical+processing+of+vibrissal+information+in+the+rat.+II.+spatiotemporal+convergence+in+the+thalamic+ventroposterior+medial+nucleus+%28VPm%29+and+its+relevance+to+generation+of+receptive+fields+of+S1+cortical+%26%2334%3Bbarrel%26%2334%3B+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Thalamo-cortical processing of vibrissal information in the rat. II. spatiotemporal convergence in the thalamic ventroposterior medial nucleus (VPm) and its relevance to generation of receptive fields of S1 cortical &#34;barrel&#34; neurones.</a> J Comp Neurol. 303, 211-224 (1991).</li>
<li>Armstrong-James, M., Callahan, C. A., Friedman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thalamo-cortical+processing+of+vibrissal+information+in+the+rat.+I.+Intracortical+origins+of+surround+but+not+centre-receptive+fields+of+layer+IV+neurones+in+the+rat+S1+barrel+field+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Thalamo-cortical processing of vibrissal information in the rat. I. Intracortical origins of surround but not centre-receptive fields of layer IV neurones in the rat S1 barrel field cortex.</a> J Comp Neurol. 303, 193-210 (1991).</li>
<li>Agmon, A., Yang, L. T., Jones, E. G., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+precision+in+the+thalamic+projection+to+neonatal+mouse+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Topological precision in the thalamic projection to neonatal mouse barrel cortex.</a> J Neurosci. 15, 549-561 (1995).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+rat+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The rat brain in stereotaxic coordinates</a>. , Academic Press. San Diego. (1998).</li>
<li>Davidoff, M., Schulze, W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1692015">Standard avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) staining combination of the peroxidase anti-peroxidase (PAP)-and avidin-biotin-peroxidase complex (ABC)-techniques: an amplification alternative in immunocytochemical staining.</a> Histochemistry. 93, 531-536 (1990).</li>
<li>Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+axonal+diffusion+of+3000+molecular+weight+dextran+amines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast axonal diffusion of 3000 molecular weight dextran amines.</a> J Neurosci Methods. 50, 95-103 (1993).</li>
<li>Kaneko, T., Saeki, K., Lee, T., Mizuno, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+retrograde+axonal+transport+and+subsequent+visualization+of+tetramethylrhodamine+%28TMR%29+-dextran+amine+by+means+of+an+acidic+injection+vehicle+and+antibodies+against+TMR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved retrograde axonal transport and subsequent visualization of tetramethylrhodamine (TMR) -dextran amine by means of an acidic injection vehicle and antibodies against TMR.</a> J Neurosci Methods. 65, 157-165 (1996).</li>
<li>Medina, L., Reiner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efferent+projections+of+the+dorsal+and+ventral+pallidal+parts+of+the+pigeon+basal+ganglia%2C+studied+with+biotinylated+dextran+amine%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The efferent projections of the dorsal and ventral pallidal parts of the pigeon basal ganglia, studied with biotinylated dextran amine.</a> Neuroscience. 81, 773-802 (1997).</li>
<li>DE Venecia, R. K., Smelser, C. B., McMullen, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parvalbumin+is+expressed+in+a+reciprocal+circuit+linking+the+medial+geniculate+body+and+auditory+neocortex+in+the+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Parvalbumin is expressed in a reciprocal circuit linking the medial geniculate body and auditory neocortex in the rabbit.</a> J Comp Neurol. 400, 349-362 (1998).</li>
<li>Ojima, H., Takayanagi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+two+anterograde+axon+tracers+to+label+distinct+cortical+neuronal+populations+located+in+close+proximity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Use of two anterograde axon tracers to label distinct cortical neuronal populations located in close proximity.</a> J Neurosci Methods. 104, 177-182 (2001).</li>
<li>Kobbert, C., Apps, R., Bechmann, I., Lanciego, J. L., Mey, J., Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+concepts+in+neuroanatomical+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Current concepts in neuroanatomical tracing.</a> Prog Neurobiol. 62, 327-351 (2000).</li>
<li>Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+techniques+for+tracing+pathways+in+the+central+nervous+system+of+developing+and+adult+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals.</a> Brain Res Bull. 51, 11-28 (2000).</li>
<li>Liao, C. C., Reed, J. L., Kaas, J. H., Qi, H. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracortical+connections+are+altered+after+long-standing+deprivation+of+dorsal+column+inputs+in+the+hand+region+of+area+3b+in+squirrel+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Intracortical connections are altered after long-standing deprivation of dorsal column inputs in the hand region of area 3b in squirrel monkeys.</a> J Comp Neurol. 524, 1494-1526 (2016).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

בחירת מכשיר מעקב ראוי הוא שלב קריטי עבור ניסוי מוצלח עקיבה עצבית. במשפחה של BDA, משקל מולקולרי גבוה BDA (משקל מולקולרי 10,000) הומלץ מעדיפים להיות מועבר דרך מסלול עצבי anterograde בניגוד נמוך משקל מולקולרי BDA (משקל מולקולרי 3,000)2,3 , 11 , 12 , 13. עם זאת, מחקרים רבים גם הציע את משקל מולקולרי גבוה BDA אולי פוטנציאל לשמש גם לצורך מעקב אחר מסלול רטרוגרדית במקב...

משקל מולקולרי גבוה BDA (10,000 מולקולרית משקל), מכשיר מעקב רגישים, שימש במשך מעקב מסלולים עצביים במערכת העצבים המרכזית עבור יותר מ-20 שנים1. למרות השימוש BDA הוא משחק טרקטו עצבית נפוצות עקיבה טכניקה, האיכות של BDA תיוג עשויה להיות מושפעת בבעלי חיים שונים גורמים1,2,3. מחקר שנערך שלנו ציינו כי המבנה האופטימלי של BDA תיוג זה המשויך זמן הישרדות שלאחר הזרקה נכונה אלא גם בקורלציה עם שיטת צביעת4. עד עכשיו, מתחם אבידין-ביוטין-peroxidase קונבנציונאלי (ABC), streptavidin-fluorescein isothiocyanate, streptavidin-AF594 שיטות מכתימים שימשו חשיפת BDA תיוג הקודם מחקרים2,3, 4,5. לשם השוואה, צביעת פלורסנט עבור BDA ניתן בקלות לבצע.
על מנת להרחיב את היישום של משקל מולקולרי גבוה BDA, הוצג פרוטוקול מעודן במחקר הנוכחי. לאחר ההזרקה של BDA לתוך VPM של התלמוס במוח עכברוש, תיוג BDA היה חשף בשיטה הרגילה של צביעת ABC סטנדרטיים, כמו גם על ידי זוגי פלורסנט מכתים, אשר בוצע להתבוננות הקורלציה של BDA תיוג, בסיסי אלמנטים עצבית או interneurons בתוך המטרה קורטיקלית עם streptavidin-AF594, להסטולוגיה Nissl פלורסנט או PV-נוגדנים, בהתאמה. דרך מסלולים עצביים הדדיים בין VPM של קליפת המגע העיקרית (S1)6,7,8, התמקדנו שלנו תצפית על BDA תיוג thalamocortical מוקרן אקסונים ו corticothalamic somas תא המתוכננת ב ו- S1. באמצעות תהליך זה, אנו אמורים לספק לא רק פרוטוקול מפורט להשגת האיכות הגבוהה של תיוג עצביים עם משקל מולקולרי גבוה BDA, אלא גם פרוטוקול מעודנת על השילוב של תיוג BDA פלורסנט, סמנים עצביים אחרים פלורסנט עם להסטולוגיה או נוגדנים. גישה זו עדיפה ללמוד את המעגלים העצביים מקומיים ו שלהם מאפיינים כימיים תחת לייזר קונפוקלי סורק מיקרוסקופ.

<table><tbody><tr><td>ביוטינילציה דקסטרן אמין (BDA)</td> <td>בדיקות מולקולריות</td><td>D1956</td><td>10,000 משקל מולקולרי</td></tr><tr><td>Streptavidin-Alexa Fluor 594</td><td>בדיקות מולקולריות</td><td>S32356</td><td>הגן מפני אור</td></tr><tr><td>500/525 ירוק פלואורסצנטי Nissl כתם</td><td>בדיקות מולקולריות</td><td>N21480</td><td>הגן מפני אור</td></tr><tr><td>מכשיר סטריאוטקסיס מוח</td><td>Narishige</td><td>SR-50</td><td></td></tr><tr><td>הקפאת מיקרוטום</td><td>Thermo</td><td>Microm International GmbH</td><td></td></tr><tr><td>הדמיה קונפוקלית</td> מערכת <td>אולימפוס</td><td>FV1200</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מקדחה</td><td>Saeyang Microtech</td><td>מרתון-N7</td><td></td></tr><tr><td>Sprague מכון דולי</td><td>למדעי חיות מעבדה, האקדמיה הסינית למדעי הרפואה</td><td>SCKX (יוני) 2012-004</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain ABC Kit</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-4000</td><td></td></tr><tr><td>סופרפרוסט פלוס מיקרוסקופ שקופיות</td><td>Thermo</td><td>#4951PLUS-001</td><td>25x75x1mm</td></tr><tr><td>פוטושופ ואיור</td><td>Adobe</td><td>CS5</td><td></td></tr></tbody></table>

שיפור היישום של משקל מולקולרי גבוה biotinylated לתוספי אמין עבור היטל thalamocortical עקיבה בחולדה

Improving the Application of High Molecular Weight Biotinylated Dextran Amine for Thalamocortical Projection Tracing in the Rat

משקל מולקולרי גבוה biotinylated לתוספי אמין (BDA) שימש בתור מכשיר מעקב neuroanatomical רגישה מאוד במשך עשורים רבים. מאז האיכות של תיוג שלה הושפע על ידי גורמים שונים, כאן, אנו מספקים פרוטוקול מעודן של יישום משקל מולקולרי גבוה BDA לימוד אופטימליים תיוג עצבי במערכת העצבים המרכזית. לאחר הזרקת סטיאוטטי BDA לתוך הגרעין הגחוני posteromedial (VPM) של התלמוס בחולדה באמצעות פיפטה מזכוכית עדינה, BDA היה מוכתם streptavidin פלורסנט-(AF) 594 אלקסה, counterstained עם Nissl פלורסנט הכתם AF500/525. על הרקע של צביעת Nissl ירוק, אדום BDA תיוג, כולל מסופים עצב, וגופי תאים עצביים היה ביתר בירור הפגינו קליפת המגע. יתר על כן, להכפיל מכתים פלורסנט עבור BDA וביצעו סידן מחייב חלבון parvalbumin (PV) היה להתבונן הקורלציה של BDA תיוג ו interneurons PV-חיובית בתוך המטרה קורטיקלית, מתן הזדמנות ללמוד המקומי עצבית מעגלים ומאפיינים הכימי שלהם. לכן, בשיטה זו מעודן מתאים לא רק להמחיש באיכות גבוהה עצבית תיוג עם משקל מולקולרי BDA גבוהה דרך מסלולים עצביים הדדיים בין קליפת המוח תלמוס, אבל גם יאפשרו הדגמה סימולטני של סמנים עצביים אחרים עם להסטולוגיה פלורסנט או נוגדנים.

הישרדות של 10 ימים שלאחר הזרקה של BDA לתוך VPM היה מספיקות לייצור אינטנסיבי עצבית תיוג על אזורים קורטיקליים המתאימים חולשת לצד הזרקה (איור 2). קונבנציונלי ABC והן פלורסנט מכתימה את ההליכים עבור BDA חשף דפוס דומה של תיוג עצבית על ו- S1, כולל anterogradely הנקרא thalamocortical אקסונים ומתויגים retrogradely corticothalamic נוירונים (איור 2C, D ).
Anterogr...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מעודן לחשוף ביעילות biotinylated לתוספי אמין (BDA) תיוג עם פלורסנט צביעת שיטת דרך מסלול עצבי הדדיים. היא מתאימה לניתוח המבנה קנס של BDA תיוג, המבדיל אותו רכיבים עצביים אחרים תחת מיקרוסקופ סורק לייזר קונפוקלי.

שיפור היישום של משקל מולקולרי גבוה Biotinylated לתוספי אמין עבור היטל Thalamocortical עקיבה בחולדה

High molecular weight biotinylated dextran amine (BDA) has been used as a highly sensitive neuroanatomical tracer for many decades. Since the quality of ...

המטרה הכללית של סרטון זה היא להדגים פרוטוקול מעודכן ליישום של BDA בעל משקל מולקולרי גבוה לצורך חקר סימון עצבי אופטימלי במערכת העצבים המרכזית. מדד זה יכול לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הרשתות העצביות, באמצעות ויזואליזציה של מבנה המסגרת של הסימון העצבי דרך מעגלים עצביים.היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לחקור מעגלים עצביים מקומיים ואת מאפייניהם הכימיים. הכין מיקרוסרינגה של 1 µL, המצוידת במיקרופיפטת זכוכית, ובדוק אותה על ידי שאיבת פראפין נוזלי. לאחר הרדמת החולדה בהתאם לפרוטוקול מאושר, ודא הרדמה עמוקה על ידי היעדר תגובה לצביטה בזנב.לאחר מכן, גדלו את חלקו העליון של ראש החיה באמצעות תספורת חשמלית ושפשפו את אזור הניתוח ב-10% povidone iodine, ולאחר מכן ב-70% ethanol. קבעו את החולדה במכשיר הסטריאוטקסי באמצעות החדרת מוטות אוזניים קהות לאוזניים והנחת השיניים הקדמיות העליונות של החולדה לתוך תומך הפה. מרחו משחה עינית על העיניים.השתמשו בכפפות כירורגיות ובסדינים סטריליים כדי לשמור על תנאים סטריליים. נקו שוב את עור הראש באזור הניתוח באמצעות 70% ethanol. לאחר ביצוע חתך סגיטלי בעור באמצעות סכין ניתוח, לאורך התפר הסגיטלי, השתמשו במקלות צמר גפן סטריליים כדי לקלף את השריר ואת הפריוסטום מהגולגולת.בעזרת קואורדינטות שהוגדרו מראש מתוך אטלס, קבעו את המיקום עבור הקרניוטומי (פתיחת הגולגולת). בצעו קרניוטומי באמצעות מקדח בורר (burr drill) בעל ראש עגול, וקדחו לעומק של כ-1 mm עד להופעת קרומי המוח (meninges). הסִירו את קרום המוח הקשה (dura mater) באמצעות פינצטה מיקרוסקופית כדי לחשוף את קליפת המוח (cerebral cortex) מעל אתר ההזרקה.רוקנו את הפרפין הנוזלי מהמיקרו-מזרק ולאחר מכן שאבו תמיסת 10% BDA. התקינו את המזרק במכשיר המיקרו-הזרקה וחברו את המיקרו-משאבה. תמנרו את מכשיר המיקרו-הזרקה תחת מיקרוסקופ סטריאו.החדירו את המיקרופיפט הזכוכית הממולא אל ה-VPM דרך פני השטח הקורטיקליים של המוח, לעומק של 5.8 מילימטרים. לאחר מכן, השתמשו במיקרו-משאבה כדי להזריק בלחץ 100 ננוליטרים של 10% BDA אל ה-VPM, לאורך תקופה של שלוש דקות. לאחר חמישה דקות, הוציאו את הפיפט באיטיות.תפרו את הפצע באמצעות חוט סטרילי, ולאחר מכן הניחו את החולדה באזור התאוששות חם, עד שתחזור להכרה ותהיה מחלימה לחלוטין. לאחר המתנת החולדה (euthanasia), השתמשו במספריים ובפינצטה כדי לפתוח את חלל בית החזה של החולדה ולגשת ללב. הכניסו קטטר תו-ורידי לחדר השמאלי, לכיוון האורטה, ולאחר מכן פתחו את העליה הימנית.ראשית, בצעו פרפוזיה עם תמיסת סלין 0.9% בטמפרטורה פיזיולוגית, למשך כדקה עד שתיים, עד שהדם היוצא מהלב שקוף. לאחר מכן, המשיכו עם 250 עד 300 מיליליטר של 4%paraformaldehyde, בבופר פוספט 0.1 מולרי. בצעו קיבוע משני (post-fix) למוח שחוזר למשך שעתיים ב-4%paraformaldehyde בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, העבירו את המוח לתוך סוכרוז בריכוז 30% ב-PBS 0.1 מולרי ובצעו קריו-הגנה במשך שלושה ימים בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר שלושה ימים, כאשר המוח שקע בתמיסה, חלקו את המוח לשלושה בלוקים בכיוון הקורונלי (חזיתי) בעזרת מטריצת מוח. הבלוק המרכזי מכיל את הגרעין הוונטרלי פוסטרו-מדיאלי של התלמוס בקליפת המוח הסומטוסנסורית הראשונית.הניחו את הבלוק המרכזי של המוח על במת ההקפאה של המיקרוטום הגלישה עבור חיתוך במישור הקורונלי, ובצעו חיתוכים בעובי 40 microns כאשר הדגימה קפואה. אספו את החתכים לתוך צלחת בעלת שישה בארות, המכילה 0.1 molar PBS. התחילו את הצביעה על ידי שטיפת החתכים ב-0.1 molar PBS למשך כדקה תוך כדי נטילה.לאחר מכן, העבירו את החתכים לתמיסה מעורבת של streptavidin-AF594 בתוך צבע Nissl פלואורסצנטי ירוק AF500/525 ב-PBS בריכוז 0.1 molar המכיל 0.3% Triton X-100, והדגירו למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. לאחר הצביעה, שטפו את החתכים שלוש פעמים ב-PB בריכוז 0.1 molar תוך כדי נדנוד (rocking). הצמידו את החתכים לעששית המיקרוסקופ באמצעות טכניקות היסטוכימיות סטנדרטיות.ייבשו את החתכים באוויר למשך כשעה. מרחו גליצרין 50% במים מזוקקים על החתכים הפלורסצנטיים והניחו זכוכית כיסוי לפני הדמיית השקופיות. מיקרוגרפיה זו מייצגת את אתר ההזרקה של BDA באדום בגרעין הוונטרלי פוסטרומדיאלי של התלמוס על רקע צביעת ניסל (Nissl) בירוק.סימון BDA פלואורסצנטי מוצג כאן, כולל אקסונים תלמיים-קורטיקליים בשכבה ארבע ונוירונים תלמיים קורטיקליים בשכבות חמש ושש. לצורך השוואה, מיקרוגרפיה זו מדגימה כי סימון BDA קונבנציונלי באמצעות הליך סטנדרטי של אווידין-ביוטין פראוקסידאז חושף תבנית סימון עצבית דומה לזו של סימון BDA פלואורסצנטי. תצפית זו, בהגדלה גבוהה יותר של חיתוך המסומן ב-BDA פלואורסצנטי, מראה בפירוט את עצי האקסונים שסומנו באנטרוגרדה, בצבע אדום.גוף התא העצבי, הדנדריטים והקוצים הדנדריטיים המסומנים באופן רטרוגרדי מוצגים כאן בפירוט. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע קרניאוטומי והזרקה סטריאוטקסית תוך 20 עד 30 דקות, במידה והתהליך מבוצע כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של אופן היישום של BDA בעל משקל מולקולרי גבוה לשחזור קשרי עצבים ולמבנה המפורט של סימון עצבי.

improving-application-high-molecular-weight-biotinylated-dextran

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

שיטה מתוארת לתיוג נוירונים עם צבעי ניאון בתחומי מייקר מראש תפקודיים של הניאוקורטקס. ראשית, דימות אופטי אות פנימית משמש להשגת מפה תפקודית. אז מיקרוסקופ שני פוטונים משמש לתווית ונוירונים תמונה בתוך תחום מייקרו של המפה.

תיוג ממוקד של תאי עצב בתחומים ספציפיים מייקר פונקציונליים של הניאוקורטקס ידי שילוב אותות פנימיים והדמית שני פוטונים

מעקב טרנס-סינפטי הפך לכלי רב עוצמה לניתוח זרמים מרכזיים המווסתים מטרות היקפיות באמצעות מעגלים רב-סינפטיים. כאן אנו מציגים פרוטוקול המנצל את נגיף הפסאודו-כלבת הטרנס-סינפטי כדי לזהות ולמקם מעגל מוחי פונקציונלי, ואחריו טכניקות מעקב דרכי קלאסיות כדי לאמת קשרים ספציפיים במעגל בין קבוצות מזוהות של נוירונים.

Transsynaptic איתור ממטרות היקפית עם וירוס Pseudorabies אחריו רעלן כולרה ותיוג Biotinylated Dextran אמינים זוגי

שיטה כירורגית מתוארת לחשוף את גולגולת הגחון בחולדות ילוד. שימוש בגישה זו ניתן לפתוח craniotomy לבצע אלקטרופיזיולוגיה חריפה וניסויים במיקרוסקופ שני פוטונים בגזע המוח של גורים מורדמים.

שיטה להרוויח Craniotomy על גולגולת הגחון של מכרסמים ילוד

כדי להבין את המבנה של רשתות נוירונים, אפיון פונקציונלי וצורני של נוירונים בודדים הוא הכרח. הנה, אנחנו מדגימים תיוג juxtasomal biocytin, המאפשר הקלטות אלקטרו בתצורה תאית, ועם זאת שמירה על היכולת לתייג את הנוירון לפוסט הוק שחזור של הדנדריטים ואדריכלות אקסון intracellularly.

Juxtasomal Biocytin תיוג לחקר קשר בין מבנה לתפקוד של פרט נוירונים קליפתיים

פרוטוקולי אימונוהיסטוכימיה משמשים ללמוד את הלוקליזציה של חלבון מסוים ברשתית. טכניקות הדמיה סידן מועסקות ללמוד דינמיקת סידן בתאי הגנגליון ברשתית והאקסונים שלהם.

שיטות הדמיה אימונוהיסטוכימיים וסידן בWholemount עכברוש הרשתית

על מנת לחקור ארגון מחדש של המוח בתנאים פתולוגיים השתמשנו במשאבות זעירות להעברת חלבון ישירה למוח תוך עקיפת מחסום הדם-מוח. לאחר מכן מוזרקים עוקבי דרכי כדי לחקור שינויים בקישוריות המוח בהשפעת החלבון.

השרשה של Miniosmotic משאבות ומשלוח של קליעים נותבים בדרכי לחקר מוח בארגון מחדש תנאי pathophysiological

אנו מתארים טכניקה לתייג נוירונים והתהליכים שלהם באמצעות זריקות אנטרוגרדית או נותב מדרדר לגרעיני מוח באמצעות הכנה במבחנה. אנחנו שונה בשיטה הקיימת שלי n המבחנה electroporation נותב על ידי ניצול של שכותרתו fluorescently מוטציות עכבר וציוד אופטי בסיסי כדי להגדיל את דיוק תיוג.

Explants מוח מונחי לייזר עצבי איתור ב

פרוטוקול זה מדגים מתודולוגיות עבור מודל העכבר של פגיעה במוח הגולגולת טראומה טראומטית השתלת הגוף האנושי המושרה pluripotent שפעה התאים הנגזר לתוך האתר פציעה. מבחנים התנהגותיים והיסטולוגיים של תוצאות מהליכים אלה מתוארים גם בקצרה.

מבוקרת מודל השפעה בקליפת המוח של פגיעה במוחו של העכבר עם השתלת הטיפולית של האדם המושרה Pluripotent תא גזע תאים הנגזרים

הפרוטוקול הנוכחי מדגים שיטה פשוטה להתחקות אחר תחזיות גלוטמט אזור טגמנטלי גחוני (VTA) להיפוקמפוס. פוטוטימולציה של נוירונים גלוטמט VTA שולב עם הקלטת CA1 כדי להדגים כיצד מסופי גלוטמט VTA לווסת CA1 קצב ירי פירמידלי putative ב vivo.

מעקב אנטומי ותפקודי משולב של מסופי גלוטמט באזור הגונטם הגחמני בהיפוקמפוס

כאן אנו מציגים שיטת ניקוי רקמות הידרופובית המאפשרת צפייה במולקולות יעד כחלק ממבני מוח שלמים. טכניקה זו אומתה כעת לשליטה F344/N ו- HIV-1 חולדות מהונדסות משני המינים.

שיטת ניקוי רקמות הידרופובית לרקמת מוח חולדה

דימות טומוגרפיה טורית של שני פוטונים (STPT) היא טכניקה לדימוי מסה של רקמה בצורתה התלת-ממדית על ידי שילוב של דימות דו-פוטוני עם בקרת במה אוטומטית וחיתוך מיקרוטום. כאן אנו מתארים פרוטוקול ליישומו עבור מוחות מרמוסטים כדי להבין טוב יותר את התכונות המבניות שלהם.

טומוגרפיה טורית של שני פוטונים של כל המוח המרמוסטי לניתוחים נוירואנטומיים

למד פרוטוקול משופר להחלת BDA במשקל מולקולרי גבוה למעקב אחר מעגלים עצביים במערכת העצבים המרכזית של חולדות. שיטה זו מאפשרת הדמיה ברורה של מבנים עצביים ותכונות כימיות מקומיות.

שיפור היישום של משקל מולקולרי גבוה Biotinylated לתוספי אמין עבור היטל Thalamocortical עקיבה בחולדה

גלה סרטונים נוספים