א
26 ביולי 2017
כאן, אנו מציגים assay Caenorhabditis elegans- Specific שנועד להעריך שינויים התנהגות הנטייה נחושת ואת היכולת לאתר מקור מזון משותף, כמו האורגניזם מתקדמת ממצב תזונה רעב עד כדי רעב.
המטרה הכוללת של מבחן הסלידה לנחושת המבוסס על מצב תזונתי זה היא להעריך את התגובה של הנמטודות לכימיקל מגעיל ומקור מזון לאורך תקופה של ארבע שעות. זה מאפשר הערכה בו-זמנית של המצב התזונתי. שיטה זו יכולה לסייע בתחום מדעי ההתנהגות הנוירולוגיים על ידי זיהוי מוטציות שלא מצליחות לווסת דפוסי תנועה ותגובה לכימיקל מגעיל למרות תנאי רעב.
היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבצע אותה לאורך תקופה ממושכת, מה שמאפשר ניתוח מצב תזונתי כאשר התולעים נעשות מורעבות יותר ויותר לאורך ארבע שעות. כדי להכין אורגניזמים ניסויים למבחן, קחו 10 נמטודות שלב L4 לכל זרם, 24 שעות לפני תחילת המבחן, כדי להבטיח שהאורגניזמים הם מבוגרים צעירים בעת הבדיקה. עבור כל מוטציה או נמטודה בקרה שנבדקת, קחו 10 L4.
שמרו את האורגניזמים של שלב L4, תוך שימוש בשיטות סטנדרטיות למשך 24 שעות על צלחות אגר סטנדרטיות שנזרעו ב-OP50 E.Coli. 24 שעות לפני המבחן, השתמשו בסרגל ובטוש קבוע עבה כדי לצייר קו בצד התחתון של צלחת מדיום גידול נמטודות שהוכנה מראש או צלחת NGM לאורך הקצה החיצוני. סמנו מחסום אמצע מרוחק שווה מכל קצה של הצלחת.
זרעו את הצלחת עם 50 מיקרוליטר של OP50 E.Coli רק בצד אחד של מחסום הנחושת כדי ליצור מרעה אחיד. השתמשו בקווים המסומנים בצד התחתון של הצלחת כדי לוודא שהחיידקים לא יבואו במגע עם תמיסת הנחושת. וודאו שתמיסת הנחושת תשרטט את קצה הצלחת ותיצור מחסום אמצע ולהעביר את החיידקים כך שתמיסת הנחושת לא תיגע במקור המזון.
סמנו סט צלחות שני ללא OP50 E.Coli, כדי לשמש שליטה שלילית. אפשרו לחיידקים להתייבש ואז הכניסו את הצלחות לדגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. וודאו שהפצעים של החיידקים לא מופרעים בעת העברת הנמטודות לדגירה ב-37 מעלות צלזיוס.
הפרעה מופרזת עלולה לשנות את המיקום או את הצורה של פצע המזון. לאחר דגירה לילית, הסירו את הצלחות מהדגירה ובעזרת הצד התחתון המסומן של הצלחת כמדריך, פיפטטו 100 מיקרוליטר של תמיסת גופרת נחושת(II) 0.5 מולרית טרייה על קצה האגר, כדי ליצור מחסום נחושת חיצוני. פיפטטו 25 מיקרוליטר מתמיסת גופרת הנחושת כדי ליצור מחסום אמצע.
ודאו שתמיסת גופרת הנחושת(II) לא תיגע בפצע החיידקים והניחו לתמיסת הנחושת להתייבש על הצלחת. בדקו אם יבש כל חמש דקות לאחר ההעברה, בעזרת נייר רקמה מעבדתי על ידי טפיחה קלה של התמיסה ליד קצה הצלחת כדי להבחין. מיד לפני המבחן, העבירו את האורגניזמים הניסויים לצלחת אגר נטולת חיידקים והניחו לנמטודות לנוע בחופשיות למשך דקה אחת כדי להסיר עודף חיידקים.
לאחר מכן, פיפטטו מיליליטר אחד של M9 על הצלחת עם מבוגרים צעירים, שהועברו 24 שעות קודם לכן על מנת לשטוף תולעים לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה. צנטריפוגו את הנמטודות ב-3,000 x G למשך דקה אחת. התולעים אמורות ליצור גלולה בתחתית הצינור.
שאבו את תמיסת M9 מבלי להפר את גלולה התולעים. הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת M9 לגלולה התולעים. הפכו את הצינור כדי לערבב את התולעים עם התמיסה.
אם הועברו חיידקים עודפים בתחילה עם התולעים, חזרו על הפעולה במשך חמש פעמים בסך הכל. לאחר הכביסה הסופית, שאבו את הסופרנטנט עד שנותרו 100 מיקרוליטר של תמיסת M9 והגלולה התולעים. העבירו מיד את התולעים מהתמיסה לאחר השלמת הכביסות.
פיפטטו 20 מיקרוליטר מהגלולה התולעים מתחתית הצינור על צד האגר נטול החיידקים של צלחת המבחן, וודאו ש-10 תולעים הועברו לצלחת המבחן וכי אין מזון מזהם. אין להעביר חיידקים לצלחות מרוץ המזון של הנחושת
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג בדיקה ספציפית ל-Caenorhabditis elegans להערכת התנהגות של סלידה מנחושת ואיתור מקור מזון בעת מעבר של האורגניזם ממצב של תזונה טובה למצב של הרעבה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח ההתנהגותיים
- ביולוגיה של נמטודות
רקע
- הבדיקה מעריכה תגובות של נמטודות לחומר כימי דוחה ולמקור מזון.
- היא בוחנת שינויים התנהגותיים לאורך תקופה של ארבע שעות.
- שיטה זו מזהה מוטנטים שאינם מתאימים את דפוסי התנועה שלהם תחת תנאי הרעבה.
- היא מאפשרת ניתוח של המצב התזונתי ככל שהתולעים עוברות הרעבה הדרגתית.
מטרת המחקר
- להערכת שינויים בהתנהגות של סמיות לנחושת ב-C. elegans.
- להערכת היכולת לאתר מקורות מזון תחת מצבים תזונתיים שונים.
- לתרומה להבנת תגובות התנהגותיות בתנאי הרעבה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ביצוע הבדיקה לאורך תקופה של ארבע שעות.
- שימוש בנמטודות בשלב L4 לצורך הבדיקה.
- הערכה סימולטנית של המצב התזונתי וההתנהגות.
- בחירה של 10 נמטודות בשלב L4 לכל זרימה עבור הניסוי.
תוצאות עיקריות
- זיהוי שינויים התנהגותיים בתגובה לסלידה מנחושת.
- הדגמת יכולתם של נמטודות לאתר מקורות מזון למרות הרעבה.
- הדגשת יעילות הבדיקה במחקרים בנוירו-מדע התנהגותי.
- הוכחה כי ניתן להאריך את משך הבדיקה לאורך זמן לצורך ניתוח מקיף.
מסקנות
- הבדיקה היא כלי בעל ערך לחקר תגובות התנהגותיות ב-C. elegans.
- היא מסייעת בזיהוי מוטנטים בעלי תגובות סמיות משתנות.
- שיטה זו משפרת את ההבנה של השפעות המצב התזונתי על ההתנהגות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בדיקה זו מאפשרת לחוקרים בתחום מדעי העצבים ההתנהגותיים להעריך כיצד מצב תזונתי מווסת תגובות סלידה במודל שניתן לטיפול גנטי. באמצעות מעקב אחר סלידה מנחושת והתנהגות של חיפוש מזון לאורך זמן, היא תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטית של מטרות המעורבות באינטגרציה חושית ובבקרת האכלה. השיטה מספקת ביטחון חיזוי לתיקוף מטרות במסלולים הקושרים בין מצב מטבולי לבין תפוקה התנהגותית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות לגבי האופן שבו מצב תזונתי משמש כשער לתגובות כימיות סותרות.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף של מטרות תפקודיות על ידי מדידתה של מודולציה בדפוסי תנועה בתגובה לרמזים חושיים משולבים.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי זיהוי מוטנטים שאינם מצליחים לשלב אותות של הרעבה עם התנהגות סותרת.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: הכנת מערכות ביולוגיות מתוקפות לסריקה של תרכובות המשפיעות על אינטגרציה חושית.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של מדדים התנהגותיים כמותיים לאורך מסלולי זמן ממושכים לשיפור השחזוריות של הבדיקה.
- יכולת הרחבה: מאפשר הגדלת גודל המדגם להערכה סימולטנית של אוכלוסיות גדולות, ובכך משפר את תפוקת הסריקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מקשרת בין פנוטיפים התנהגותיים בשלב הגילוי למודלים פרה-קליניים של ויסות הזנה ועיבוד חושי.
- קידום מותאם סיכונים: תומך בהחלטות המשך/עצירה (go/no-go) על ידי חשיפת השאלה האם יעדים משפיעים על התנהגות אדפטיבית תחת תנאים מטבוליים משתנים.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מתמקדת ביעדים המווסתים גמישות התנהגותית במקום סלידה או משיכה סטטיות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
הבדיקה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזה של מטרה ועד לזיהוי מוביל, ובמיוחד עבור מסלולים המקשרים בין מצב תזונתי לתוצר התנהגותי.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי האופן שבו רמזים מטבוליים מווסתים תגובות סלידה במעגלים עצביים.
- סינון: מספק מוכנות של הבדיקה באמצעות כימות סטנדרטי וניתן לשחזור של התנהגות חציית מחסום לאורך ארבע שעות.
- אנליטיקה: מייצר מדידות התנהגותיות תלויות-זמן המאפשרות השוואה בין תנאים גנטיים או פרמקולוגיים.
- מחקר תרגומי: מקשר לרציפות פרה-קלינית על ידי מידול האופן שבו מצב תזונתי משפיע על קבלת החלטות במערכות עצביות פשוטות.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כפלטפורמה לשימוש חוזר להערכת יעדים מרובים במסלולי אינטגרציה חושית והתנהגות האכלה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה על ידי חשיפת תגובות התנהגותיות דינמיות לרמזים סבבים ודחופים משולבים.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה והדירות באמצעות דירוג מתוזמן ותנאים סביבתיים מבוקרים.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות להפחתת סיכונים מוקדמת של מטרות שהמודולציה שלהן אינה מצליחה להתאימו את ההתנהגות תחת עקה מטבולית.
- השפעה על הפורטפוליו: מסייע בתיעדוף מותאם סיכונים על ידי הבחנה בין פגמים חושיים סטטיים לבין ליקויי אינטגרציה דינמיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בנמטודות, תצפית התנהגותית וביצוע בדיקות מתוזמנות.
- תלוי בשימוש בצלחות אגר סטנדרטיות, הכנת תמיסת נחושת גופרתית ובקרת השכבה הבקטריאלית.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של קריטריוני הניקוד להגעה למכתב המזון ולאירועי חציית מחסום.
- כולל שיקולי התאמה בעת העברת הבדיקה לרקעים גנטיים שונים או לגורמי עקה סביבתיים.
- כולל מגבלות מעשיות, כגון הימנעות מהפרעה פיזית למחסומי הנחושת במהלך העברת התולעים ושמירה על תנאי דגירה עקביים.
