Name: א Caenorhabditis elegans מצב תזונתיים מבוססי Assay Assersion (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: למדו שיטת מעבדה להערכת התנהגות דחיית נחושת ב-Caenorhabditis elegans במעבר ממצב שבע לרעב. השיטה מאפשרת זיהוי מוטנטים עם תגובות התנהגותיות שונות בתנאי רעב.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מדעי הטבע והנדסה מועצת המחקר של קנדה גילוי מענק RGPIN36481-08 כדי ויליאם ג &#39;בנדנה.

1. הכנת אורגניזמים ניסיוניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר 10 L4 מבוימות נמטודות לכל זן 24 שעות לפני תחילת assay כדי להבטיח כי אורגניזמים הם צעירים כאשר נבדק. עבור כל נמטודות מוטציה או שליטה נבדק, לבחור 10 L4s (10 עבור שליטה 10 עבור assay). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחזק L4 אורגניזמים בשיטות סטנדרטיות 26 , 27 במשך 24 שעות על לוחות אגר סטנדרטי seeded עם OP50 Escherichia coli . אם אורגניזמים אבדו במהלך הצעדים הבאים לשטוף, לפצות על ידי הגדלת גודל המדגם החל ( כלומר לבחור 20 תולעים במקום 10). הערה: התנהגות היא פנוטיפ משתנה באופן פנימי. בצע את השיטה בשלושה עותקים עבור כל זן על שלושה ימים נפרדים. כלול זנים נוספים שליטה ותנאים עבור זנים הרומן, כפי שמוצג בסעיף הדיון. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לפני assay, העברת אורגה ניסיוניNisms על צלחת אגר ללא חיידקים ולאפשר נמטודות לנוע בחופשיות במשך 1 דקות כדי להסיר חיידקים עודפים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אורגניזמים ניסיוני חווה תנאי זיהום במהלך 24 שעות לפני assay, להשליך אותם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 1 מ&quot;ל של M9 על צלחת ללא חיידקים לשטוף תולעים לתוך צינור microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 3000 במשך 1 דקות. תולעים צריך ליצור גלולה בחלק התחתון של הצינור. לשאוב M9 פתרון מבלי לשבש את גלולה תולעת. הוסף 1 מ&quot;ל של M9 כדי גלולה תולעת, להפוך צינור לערבב תולעים עם הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.4 שלוש פעמים נוספות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם חיידקים עודפים הועבר בתחילה עם תולעים, לחזור על סך של 5 פעמים. אין חיידקים צריכים להיות מועברים צלחות גזע מזון נחושת. אם המזון מועבר צלחת assay, זה יפריע איסוף נתונים מדויקים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לשטוף הסופי, לשאוב supernatant עד 10081, L של M9 ואת גלולה תולעת נשאר. זהירות: התנהגויות הקשורות רעב להתברר לאחר 30 דקות. כתוצאה מכך תולעים צריך להיות מועבר מיד מן הפתרון לאחר השלבים השלמה הושלמו. </li></ol> 2. הכנת לוחות Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת לוחות אגר NGM סטנדרטי יומיים לפני assay. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הצלחות נשמרות בסביבה לחה, לעשות צלחות אגר 3 ימים לפני assay. לחלופין, להסיר את המכסה של הצלחת במשך 3-6 שעות כדי להבטיח יובש נאות (אם בסביבה סטרילית). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם סמן קבוע עבה, לעשות קו על החלק התחתון של הצלחת לאורך הקצה החיצוני ועוד כדי ליצור מחסום קו באמצע ( איור 1 ). מחסום קו אמצע צריך להיות שווה מכל קצה של הצלחת. השתמש בסרגל כדי להבטיח מדידות מדויקות. קווים אלה ישמשו כמדריך בעת העברת חיידקים פתרון נחושת. ובלבדE. coli מועבר לפני הפתרון נחושת, שורות אלה ישמשו אינדיקטורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת זרע עם 50 μL של OP50 E. coli על צד אחד בלבד של המכשול נחושת כדי ליצור דשא אחיד ( איור 2 ). ריכוז בקטריאלי צריך להישאר עקבי על פני מבחני; עם זאת, השתנות מעט נצפתה בתגובה להבדלים מתונים בריכוז. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בקווים מסומנים על החלק התחתון של הצלחת כדי להבטיח את החיידקים לא באים במגע עם פתרון נחושת. בתנאי שתמיסת הנחושת תוחמת את קצה הצלחת ותיצור מחסום של קו אמצע, תעביר את החיידקים כך שפתרון הנחושת לא יבוא במגע עם מקור המזון. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן קבוצה שנייה של צלחות ולהעביר OP50 E. coli להם ( איור 2 ). לוחות אלה ישמשו להעריך את השליטה השלילית. צלחות אלה צריך גם להיותסימון על מחצית הצלחת כדי לציין את מקור ההעברה הראשונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר חיידקים לייבש ואז צלחות דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. ודא כי תיקוני בקטריאלי לא מופרעים בעת העברת לחממה 37 מעלות צלזיוס או בחדר. הפרעה מוגזמת יכולה לשנות את המיקום או הצורה של תיקון המזון. </li></ol> 3. Chemotaxis Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרי להכין 0.5 M נחושת (II) סולפט פתרון לפני זמן ההתחלה assay. בתנאי 125 μL של הפתרון משמש לכל צלחת, בהיקף עד נפח זה תלוי במספר צלחות assay בשימוש ( למשל 5 צלחות assay, 625 μL). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 100 μL של נחושת (II) סולפט פתרון על קצה של אגר כדי ליצור מחסום נחושת החיצוני. הצד המסומן של הצלחת צריך לשמש כמדריך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 25 μL של נחושת (II) סולפט פתרון ליצור מחסום קו האמצע. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי הפתרון נחושת (II) סולפט לעשותלא לבוא במגע עם תיקון חיידקי. השתמש בטכניקה מנוקדת כפי streaking עשוי להשפיע על תנועה עקב חריצים / שריטות על אגר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר פתרון נחושת להתייבש על צלחת. פרק הזמן יכול להשתנות בהתאם לתנאי הצלחת ולמעבדה. בדיקה ויזואלית עבור יובש כל 5 דקות לאחר ההעברה. הערה: פתרון הנחושת מציג גוון כחלחל וניתן לזיהוי בקלות. השתמש רקמות מעבדה כדי לטפטף קלות הפתרון ליד קצה הצלחת להבחין יובש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 20 μL של גלולה תולעת מהחלק התחתון של הצינור על חצי חיידקים חינם של צלחת assay. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי 10 תולעים מועברים צלחת assay. אם תולעים נוספות נכללו בטעות, להסיר אותם על ידי בחירה עם שמן הלוקרבון על מנת להבטיח כי אין חיידקים מתווספים לצלחת. Assay כל צריך להיות מספר עקבי של נמטודות במהלך assay. הערה: אם תולעים מעטות מדי הן transfטעה במהלך מבחני, הגדלת גודל המדגם הראשוני יקטין הפסדים פוטנציאליים במהלך שוטף והעברות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר עודף M9 מן הצלחת עם רקמת מעבדה. M9 לא צריך לבוא במגע עם נחושת (II) סולפט פתרון. זהירות: ודא כי תולעים משטח אגר להישאר מושפע בעת ביצוע שלב זה. אם משתמשים בחומרה רבה מדי, רקמת המעבדה יכולה ליצור חריצים למשטח אגר של הצלחת והוא יכול להסיר תולעים. תולעים שהוסרו בטעות באמצעות KimWipe צריך להיות מושלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר פתרון M9 הוסר וכל התולעים החלו דפוסי קטר לא נוזלי, להתחיל את stopwatch assay. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופטימלי, להסיר את הפתרון M9 בתוך דקות. הפרמטר החיוני הוא זיהוי התנועה הסינוסואידית. תולעים מקוטעות באופן שונה, למשל מחבט ולא סינוסי, כאשר בנוזל. הפעל את assay להפסיק לצפות פעם אחת של איבר ניסיוניאיסמס מפסיק לחבוט. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק צלחות assay כל 30 דקות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת צלחות assay עם תיקונים חיידקיים, ציון חיובי אורגניזמים אם הם מגיעים תיקון מזון על פני 4 שעות. עבור לוחות שליטה שלילית, חיובי ציון אורגניזמים אם הם חצו את המכשול. </li></ol></li></ol>

<ol><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 314 (1165), 1-340 (1986).</li>
<li>Bargmann, C. I. Chemosensation in C. elegans (October 25, 2006). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBargmann%2C+CI+%22The+C.+elegans+Research+Community%2C+WormBook%22">The C. elegans Research Community, WormBook</a>. , wormbook.1.123.1, http://www.wormbook.org (2006).</li>
<li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Cell. 74 (3), 515-527 (1993).</li>
<li>Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+by+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+identification+of+attractants+and+analysis+of+the+response+by+use+of+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 70 (3), 817-821 (1973).</li>
<li>Ramot, D., MacInnis, B. L., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+temperature-sensing+by+a+single+thermosensory+neuron+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Bidirectional temperature-sensing by a single thermosensory neuron in C. elegans.</a> Nat. Neurosci. 11 (8), 908-915 (2008).</li>
<li>Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humidity+sensation+requires+both+mechanosensory+and+thermosensory+pathways+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (22), 8269-8274 (2014).</li>
<li>van Campen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+modulation+disorders+in+childhood+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurodev.+Disord%22%5BJournal%5D)">Sensory modulation disorders in childhood epilepsy.</a> J. Neurodev. Disord. 7 (34), (2015).</li>
<li>Festa, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortical+disconnectivity+disrupts+sensory+integration+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsych%22%5BJournal%5D)">Neocortical disconnectivity disrupts sensory integration in Alzheimer's disease.</a> Neuropsych. 19 (6), 728-738 (2005).</li>
<li>Boecker, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+processing+in+Parkinson%27s+and+Huntington%27s+disease%3A+investigations+with+3D+H%282%29%2815%29O-PET%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Sensory processing in Parkinson's and Huntington's disease: investigations with 3D H(2)(15)O-PET.</a> Brain. 122 (9), 1651-1665 (1999).</li>
<li>Markaki, M., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21154667">Modeling human disease in Caenorhabditis elegans.</a> Biotechnol. J. 5 (12), 1261-1276 (2010).</li>
<li>O'Reilly, L. P., Luke, C. J., Perlmutter, D. H., Silverman, G. A., Pak, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+in+high-throughput+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">C. elegans in high-throughput drug discovery.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 0, 247-253 (2014).</li>
<li>Thompson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+million+mutation+project%3A+a+new+approach+to+genetics+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The million mutation project: a new approach to genetics in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Res. 23 (10), 1749-1762 (2013).</li>
<li>Chao, M. Y., Komatsu, H., Fukuto, H. S., Dionne, H. M., Hart, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeding+status+and+serotonin+rapidly+and+reversibly+modulate+a+Caenorhabditis+elegans+chemosensory+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Feeding status and serotonin rapidly and reversibly modulate a Caenorhabditis elegans chemosensory circuit.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101 (43), 15512-15517 (2004).</li>
<li>Maricq, A. V., Peckol, E., Driscoll, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nature/journal/v378/n6552/abs/378078a0.html">Mechanosensory signaling in C. elegans mediated by the GLR-1 glutamate receptor.</a> Nat. 378 (6552), 78-81 (1995).</li>
<li>Chalasani, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+a+circuit+for+olfactory+behaviour+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat%22%5BJournal%5D)">Dissecting a circuit for olfactory behaviour in Caenorhabditis elegans.</a> Nat. 450 (7166), 63-70 (2007).</li>
<li>Hilliard, M. A., Bargmann, C. I., Bazzicalupo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+responds+to+chemical+repellents+by+integrating+sensory+inputs+from+the+head+and+the+tail%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">C. elegans responds to chemical repellents by integrating sensory inputs from the head and the tail.</a> Curr. Biol. 12 (9), 730-734 (2002).</li>
<li>Hart, A. C., Kass, J., Shapiro, J. E., Kaplan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+signaling+pathways+mediate+touch+and+osmosensory+responses+in+a+polymodal+sensory+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct signaling pathways mediate touch and osmosensory responses in a polymodal sensory neuron.</a> J. Neurosci. 19 (6), 1952-1958 (1999).</li>
<li>Ishihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEN-1%2C+a+secretory+protein+with+an+LDL+receptor+motif%2C+regulates+sensory+integration+and+learning+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">HEN-1, a secretory protein with an LDL receptor motif, regulates sensory integration and learning in Caenorhabditis elegans.</a> Cell. 109 (5), 639-649 (2002).</li>
<li>Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+chemotaxis+revealed+by+paired+presentation+of+a+chemoattractant+and+starvation+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> J. Exp. Biol. 204 (10), 1757-1764 (2001).</li>
<li>Chao, M. Y., Komatsu, H., Fukuto, H. S., Dionne, H. M., Hart, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeding+status+and+serotonin+rapidly+and+reversibly+modulate+a+Caenorhabditis+elegans+chemosensory+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Feeding status and serotonin rapidly and reversibly modulate a Caenorhabditis elegans chemosensory circuit.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (43), 15512-15517 (2004).</li>
<li>Campbell, J. C., Polan-Couillard, L. F., Chin-Sang, I. D., Bendena, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NPR-9%2C+a+Galanin-Like+G-Protein+Coupled+Receptor%2C+and+GLR-1+Regulate+Interneuronal+Circuitry+Underlying+Multisensory+Integration+of+Environmental+Cues+in+Caenorhabdities+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">NPR-9, a Galanin-Like G-Protein Coupled Receptor, and GLR-1 Regulate Interneuronal Circuitry Underlying Multisensory Integration of Environmental Cues in Caenorhabdities elegans.</a> PLoS Genet. 12 (5), (2016).</li>
<li>Harris, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+distinct+amine+receptors+operating+at+different+levels+within+the+locomotory+circuit+are+each+essential+for+the+serotonergic+modulation+of+chemosensation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Three distinct amine receptors operating at different levels within the locomotory circuit are each essential for the serotonergic modulation of chemosensation in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurosci. 29 (5), 1446-1456 (2009).</li>
<li>Harris, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+serotonergic+food+signal+stimulating+sensory-mediated+aversive+behavior+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dissecting the serotonergic food signal stimulating sensory-mediated aversive behavior in C. elegans.</a> PLoS One. 6 (7), (2011).</li>
<li>Mitchell, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+differential+role+for+neuropeptides+in+acute+and+chronic+adaptive+responses+to+alcohol%3A+behavioural+and+genetic+analysis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A differential role for neuropeptides in acute and chronic adaptive responses to alcohol: behavioural and genetic analysis in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 5 (5), (2010).</li>
<li>Colbert, H. A., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+signals+modulate+olfactory+acuity%2C+discrimination%2C+and+memory+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Environmental signals modulate olfactory acuity, discrimination, and memory in Caenorhabditis elegans.</a> Learn Mem. 4 (2), 179-191 (1997).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/4366476">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genet. 77 (1), 71-71 (1974).</li>
<li>Behavior (July 3, 2006). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+C.+elegans+Research+Community%2C+WormBook%22">The C. elegans Research Community, WormBook</a>. Hart, A. C. , wormbook.1.87.1, http://www.wormbook.org (2006).</li>
<li>Sambongi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+of+cadmium+and+copper+ions+by+externally+exposed+ADL%2C+ASE%2C+ASH+neurons+elicits+avoidance+response+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroReport%22%5BJournal%5D)">Sensing of cadmium and copper ions by externally exposed ADL, ASE, ASH neurons elicits avoidance response in Caenorhabditis elegans.</a> NeuroReport. 10 (4), 753-757 (1999).</li>
<li>Gray, J. M., Hill, J. J., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+circuit+for+navigation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A circuit for navigation in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 102 (9), 3184-3191 (2004).</li>
<li>Rechavi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Starvation-Induced+Transgenerational+Inheritance+of+Small+RNAs+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Starvation-Induced Transgenerational Inheritance of Small RNAs in C. elegans.</a> Cell. 158 (2), 277-287 (2014).</li>
<li>Gloria-Soria, A., Azevedo, R. B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((npr-1+Regulates+Foraging+and+Dispersal+Strategies+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">npr-1 Regulates Foraging and Dispersal Strategies in Caenorhabditis elegans.</a> Cell. 18 (21), 1694-1699 (2008).</li>
<li>Beron, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+burrowing+behavior+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+A+new+assay+for+the+study+of+neuromuscular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Brain+Behav%22%5BJournal%5D)">The burrowing behavior of the nematode Caenorhabditis elegans: A new assay for the study of neuromuscular disorders.</a> Genes Brain Behav. 14 (4), 357-368 (2015).</li>
<li>Wang, S. J., Wang, Z. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Track-A-Worm%2C+An+Open-Source+System+for+Quantitative+Assessment+of+C.+elegans+Locomotory+and+Bending+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Track-A-Worm, An Open-Source System for Quantitative Assessment of C. elegans Locomotory and Bending Behavior.</a> PLoS One. 8 (7), (2013).</li>
</ol>

אין לנו מה לגלות.

עיצוב assay זה משנה את assay גזע מזון 24 לכלול פתרון נחושת כדי ליצור מחסום midline מרתיע סביב קצה הצלחת כדי למנוע אובדן של נמטודות. אורגניזמים נבדקים על יכולתם לחצות את מחסום מרתיע ולהגיע תיקון מזון על פני 4 שעות. בהקשר של npr-9 (GF) , יש לנו ניצלו assay זה כדי להעריך כיצד תנאי רעב יכול להשפיע על תגובות מרתיעה ואיתור מזון. בהינתן שהיינו מאופיינים בעבר ב- Npr-9 (GF) כעל פגמים בהיענות למזון ורמזים מרתיעים, שילבנו רמזים סביבתיים של כפולות עם ...

Caenorhabditis elegans שימש מודל לחקר הנוירוביולוגיה במשך עשרות שנים בשל הקלות היחסית בניתוח המעגל של מערכת העצבים המורכבת רק 302 נוירונים 1 . בתנאי שהאורגניזם מסתמך על תגובה לרמזים סביבתיים, חלק גדול ממערכת העצבים מוקדש לוויסות השילוב של אותות סביבתיים 2 . למרות הפשטות של מערכת העצבים שלה, C. elegans יכול לזהות ולהגיב על אותות סביבתיים מגוונים כולל repellents 3 , 4 , 5 טמפרטורות 5 , ואפילו לחות 6 . כישלון לשלב אותות סביבתיים כמו שצריך נקשר מספר הפרעות התנהגותיות תנאים ניווניות במערכות מודל יונקים 7- 9. עם מגוון של מודלים של מחלות עצביות זמינות<html> 10 ב C. elegans ופיתוח של nematode מסכי התרופות 11 , אורגניזם זה הוכיח להיות מערכת שימושית לחקר נוירוביולוגיה. בהתחשב בזמינות של מיפוי nematode connectome 1 ומוטציות כמעט כל גן בגנום nematode 12 , ההבנה שלנו של מערכת העצבים nematode, ועל ידי הארכה שלנו, מוגבל חלקית על ידי העיצוב של מבחני המתאים מבחינה יצירתית. מספר מבחני chemotaxis פותחו במהלך 40 השנים האחרונות כדי להעריך היענות nematode לגירויים מגוונים שונים 3 , 4 , 13 , 14 , 15 . הניסוי הראשוני כלל את ההקדמה של גירוי סביבתי חריף בעוד תולעת בודדת משוטטת על צלחת אגר= &quot;Xref&quot;&gt; 3 , 14 , 16 . נרשמו שינויים מיידיים בתגובות קטריות. לדוגמה, octorol ריחניים נדיפים ניתן להחיל על השיער ו wafted מול האף nematode כדי לעורר את החניכה של תנועה לאחור בתולעים סוג בר 17 . מבחנים מורכבים יותר פותחו גם כדי לשלב משתנים מרובים כאמצעי להערכת בחירה התנהגותית 18 . וריאציה של assay זה כרוך בשימוש של פתרון נחושת כדי ליצור מחסום midline מרתיע 4 . אטרקציה, כלומר דיאכטיל, הונחה על צד אחד של המכשול הכימי עם תולעים שהועברו ממקור הדיאצטיל. תולעים פגומות לתגובות נחושת נחפזות חצו מיד את המכשול כדי להגיע לדיאצטיל, בעוד שתולעים מסוג בר נדחקו בתחילה על ידי המכשול. התגובות נצבעו כאשר התולעים התקרבו לראשונה למחסום הנחושתללא תצפיות לטווח ארוך. כאשר תולעים מוערכים לאחר עוברים תנאי רעב, הרגישות שלהם לגירויים סביבתיים הוא ירד 19 . כאשר octanol כימית מרתיעה הוא wfted מול האף nematode, אורגניזמים סוג בר לעורר תנועה לאחור בתוך 3 - 5 s כאשר על מזון. לאחר אורגניזמים אלה הוסרו מן המזון במשך 10 דקות, הם מפגינים תגובה מאוחרת של 8 - 10 s 20 . לכן, עם רעב מוגבר, נמטודות להציג תגובה מרתיעה מופחתת אותות סביבתיים מזיקים כמו החיפוש אחר מזון הופך חיוני יותר להישרדות. לעומת זאת, נמטודות כי over-express קולטן neuropeptide 9 ( npr-9) , לא מגיבים אוקטנול על או ביטול מזון ולהציג חוסר היכולת להגיב על מספר גירויים מרתיעה 21 . אלה npr-9 (GF) אורגניזמים גם לא לשנות את תדירות היפוך שלהם בנוכחות מזון, אבל יכולהפוך בתגובה לגירויים מגע קשים המציין כי הם מסוגלים תנועה לאחור 21 . יש לנו גם העריכו npr-9 (LF) מוטציות בהתחשב בכך שהם מפגינים תדירות היפוך ירד באופן חריג את האוכל עדיין יכול לווסת את התנהגותם בנוכחות מזון 21 . צימוד המצב התזונתי של התולעת עם ההקדמה של גירויים חיצוניים חריפים סייעה בבירור המנגנונים שבאמצעותם מסלול הקשור למזון יכול לשנות את מסלולי האיתות החושי 22 , 23 . הנוכחות של מזון בסביבה נמטודות שימש גם כדי להעריך תגובות אתנול הנסיגה 24 . בניסוי זה, תולעים הודגרו בריכוזים שונים של אתנול ולאחר מכן הונחו על צלחת אגר עם כתם של מזון המכונה &quot;assay גזע מזון&quot;. תיקון המזון הונח על קצה אחד של הצלחת בעוד נמטודות wEre הניח ממקור המזון. נסיגה אתנול הוערך על ידי מדידת משך הזמן הנדרש עבור תולעים להגיע חתיכת מזון. זה מבוסס תזונת נחושת assay מבוסס בונה על assay גזע מזון לשלב משתנים סביבתיים נוספים, כלומר מזון ונחושת, תוך הערכת שינויים התנהגותיים לאורך זמן. זוהי הסתגלות של פרוטוקול שימוש נפוץ ברחבי הקהילה elegans C. 4 . פרוטוקול זה נעשה שימוש כדי להעריך תגובות מרתיעה ואיתור מזון על פני תקופה של ארבע שעות 21 . מאז התולעת של התנהגויות רעב התערוכה לאחר 30 דקות של מניעת מזון 25 , אנחנו גם מסוגלים להעריך כיצד שינויים במצב התזונתי יכול להשפיע על תגובות סביבתיות. התנאים של assay זה למדוד כיצד אורגניזמים ניסיוני לשנות את התגובה לגירויים מרתיעה לאורך זמן, ומכאן זה מעריך שינויים התנהגותיים כמואורגניזמים מתקדמים לעבר מדינה מורעבת (והמשיכו מדידות של רעב ממושך). מאחר שחיות ה- NF-9 (GF) אינן משנות את התנהגותן בתגובה לאוכל או לרמזים מרתיעים רבים, ביקשנו לזהות אם הגירעונות ההתנהגותיים הללו ימשיכו להתקיים בהקשר של רעב. בסופו של דבר, זה עיצוב assay כבר ניסח במיוחד כדי להעריך את npr-9 (GF) מוטציות אבל יכול להיות מותאם נוספת גם לאפיין זנים חדשניים.

<table><tbody><tr><td>פתרון M9 [3 גרם KH2PO4, 6 גרם Na2HPO4, 5 גרם NaCl, 1 מ"ל 1 M MgSO4, H2O עד לליטר אחד. יש לעקר באטוקלב לפני השימוש.]</td><td></td><td></td><td>מיוצר במעבדה</td></tr><tr><td>סולפט נחושתי</td><td>סיגמה</td><td>C-1297</td><td>יש להשתמש במים כדי לתלות כראוי לריכוז של 0.5M</td></tr></tbody></table>

א<em&gt; caenorhabditis elegans</em&gt; מצב תזונתיים מבוססי assay assersion

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

כדי להבטיח הישרדות, אורגניזמים חייבים להיות מסוגלים להימנע בתי גידול שלילי תוך הבטחת מקור מזון עקבי. Caenorhabditis elegans לשנות את דפוסי locomotory שלהם על זיהוי של גירויים סביבתיים שונים והוא יכול לווסת את חבילת תגובות התנהגותיות בתגובה לתנאי רעב. נמטודות בדרך כלל התערוכה תגובה מרתיעה ירידה כאשר הוסרו ממקור מזון במשך 30 דקות. התבוננות בשינויים התנהגותיים בתגובה למעמד תזונתי משתנה יכולה לספק תובנה לגבי המנגנונים המסדירים את המעבר ממצב של רעב עד רעב. פיתחנו assay אשר מודד יכולת של נמטודות לעבור מחסום מרתיע ( כלומר נחושת) ואז להגיע למקור מזון על פני תקופה ממושכת של זמן. פרוטוקול זה בונה על עבודה קודמת על ידי שילוב משתנים מרובים באופן המאפשר איסוף נתונים המשיך כמו האורגניזמים לנוע לעברמצב יותר ויותר מורעב. יתר על כן, assay זה מאפשר הגדלת גודל המדגם, כך אוכלוסיות גדולות יותר של נמטודות ניתן להעריך בו זמנית. אורגניזמים פגומים ביכולת לזהות או להגיב לנחושת מיד לחצות את המכשול הכימי, בעוד נמטודות סוג בר בתחילה דחו. כמו תולעים סוג בר הם יותר ויותר מורעבים, הם מתחילים לחצות את המכשול ולהגיע למקור המזון. עיצבנו assay זה כדי להעריך מוטציה כי הוא מסוגל להגיב על רמזים סביבתיים מגוונים, כולל תחושת מזון או זיהוי של כימיקלים מרתיעה. כאשר מוערכים באמצעות פרוטוקול זה, אורגניזמים פגומים מיד חצה את המכשול, אבל גם לא היו מסוגלים לאתר מקור מזון. לפיכך, מוטציות אלה שוב ושוב לחצות את המכשול הכימי למרות להגיע באופן זמני למקור מזון. Assay זה יכול בקלות לבדוק אוכלוסיות של תולעים להעריך פגמים פוטנציאליים המסלול הקשורים סלידה והרעב.

השתמשנו סוג בר (N2), npr-9 (tm1652), ואת npr-9 overexpression זן, כלומר npr-9 (GF) (IC836 - npr-9 :: npr-9; sur-5 :: gfp; odr ), כדי להעריך תגובות לרעב ודחיקת נחושת. אורגניזמים מסוג בר מסוגלים לזהות ולהגיב על מחסום נחושת מרתיעה, ואילו מוטציות npr-9 (GF) אינן יוזמות תגובה מרתיעה לנחושת מעל assay 4 שעות 21 . לאחר 30 דקות של רעב, בערך 50 - 60% של סוג בר (N2) אורגניזמים לחצות...

כאן, אנו מציגים assay Caenorhabditis elegans- Specific שנועד להעריך שינויים התנהגות הנטייה נחושת ואת היכולת לאתר מקור מזון משותף, כמו האורגניזם מתקדמת ממצב תזונה רעב עד כדי רעב.

א<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; מצב תזונתיים מבוססי Assay Assersion

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their ...

המטרה הכוללת של מבחן הסלידה לנחושת המבוסס על מצב תזונתי זה היא להעריך את התגובה של הנמטודות לכימיקל מגעיל ומקור מזון לאורך תקופה של ארבע שעות. זה מאפשר הערכה בו-זמנית של המצב התזונתי. שיטה זו יכולה לסייע בתחום מדעי ההתנהגות הנוירולוגיים על ידי זיהוי מוטציות שלא מצליחות לווסת דפוסי תנועה ותגובה לכימיקל מגעיל למרות תנאי רעב.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבצע אותה לאורך תקופה ממושכת, מה שמאפשר ניתוח מצב תזונתי כאשר התולעים נעשות מורעבות יותר ויותר לאורך ארבע שעות. כדי להכין אורגניזמים ניסויים למבחן, קחו 10 נמטודות שלב L4 לכל זרם, 24 שעות לפני תחילת המבחן, כדי להבטיח שהאורגניזמים הם מבוגרים צעירים בעת הבדיקה. עבור כל מוטציה או נמטודה בקרה שנבדקת, קחו 10 L4.שמרו את האורגניזמים של שלב L4, תוך שימוש בשיטות סטנדרטיות למשך 24 שעות על צלחות אגר סטנדרטיות שנזרעו ב-OP50 E.Coli. 24 שעות לפני המבחן, השתמשו בסרגל ובטוש קבוע עבה כדי לצייר קו בצד התחתון של צלחת מדיום גידול נמטודות שהוכנה מראש או צלחת NGM לאורך הקצה החיצוני. סמנו מחסום אמצע מרוחק שווה מכל קצה של הצלחת.זרעו את הצלחת עם 50 מיקרוליטר של OP50 E.Coli רק בצד אחד של מחסום הנחושת כדי ליצור מרעה אחיד. השתמשו בקווים המסומנים בצד התחתון של הצלחת כדי לוודא שהחיידקים לא יבואו במגע עם תמיסת הנחושת. וודאו שתמיסת הנחושת תשרטט את קצה הצלחת ותיצור מחסום אמצע ולהעביר את החיידקים כך שתמיסת הנחושת לא תיגע במקור המזון.סמנו סט צלחות שני ללא OP50 E.Coli, כדי לשמש שליטה שלילית. אפשרו לחיידקים להתייבש ואז הכניסו את הצלחות לדגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. וודאו שהפצעים של החיידקים לא מופרעים בעת העברת הנמטודות לדגירה ב-37 מעלות צלזיוס.הפרעה מופרזת עלולה לשנות את המיקום או את הצורה של פצע המזון. לאחר דגירה לילית, הסירו את הצלחות מהדגירה ובעזרת הצד התחתון המסומן של הצלחת כמדריך, פיפטטו 100 מיקרוליטר של תמיסת גופרת נחושת(II) 0.5 מולרית טרייה על קצה האגר, כדי ליצור מחסום נחושת חיצוני. פיפטטו 25 מיקרוליטר מתמיסת גופרת הנחושת כדי ליצור מחסום אמצע.ודאו שתמיסת גופרת הנחושת(II) לא תיגע בפצע החיידקים והניחו לתמיסת הנחושת להתייבש על הצלחת. בדקו אם יבש כל חמש דקות לאחר ההעברה, בעזרת נייר רקמה מעבדתי על ידי טפיחה קלה של התמיסה ליד קצה הצלחת כדי להבחין. מיד לפני המבחן, העבירו את האורגניזמים הניסויים לצלחת אגר נטולת חיידקים והניחו לנמטודות לנוע בחופשיות למשך דקה אחת כדי להסיר עודף חיידקים.לאחר מכן, פיפטטו מיליליטר אחד של M9 על הצלחת עם מבוגרים צעירים, שהועברו 24 שעות קודם לכן על מנת לשטוף תולעים לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה. צנטריפוגו את הנמטודות ב-3,000 x G למשך דקה אחת. התולעים אמורות ליצור גלולה בתחתית הצינור.שאבו את תמיסת M9 מבלי להפר את גלולה התולעים. הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת M9 לגלולה התולעים. הפכו את הצינור כדי לערבב את התולעים עם התמיסה.אם הועברו חיידקים עודפים בתחילה עם התולעים, חזרו על הפעולה במשך חמש פעמים בסך הכל. לאחר הכביסה הסופית, שאבו את הסופרנטנט עד שנותרו 100 מיקרוליטר של תמיסת M9 והגלולה התולעים. העבירו מיד את התולעים מהתמיסה לאחר השלמת הכביסות.פיפטטו 20 מיקרוליטר מהגלולה התולעים מתחתית הצינור על צד האגר נטול החיידקים של צלחת המבחן, וודאו ש-10 תולעים הועברו לצלחת המבחן וכי אין מזון מזהם. אין להעביר חיידקים לצלחות מרוץ המזון של הנחושת

a-caenorhabditis-elegans-nutritional-status-based-copper-aversion

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

כאן אנו מציגים פרוטוקול לביצוע הגבלה מוצק צלחת מבוססי...

Solid פלייט מבוססי הגבלת תזונתיים ב Caenorhabditis elegans</em

סרטון זה מציג בדיקת הישרדות לטווח קצר שבודקת טיפול ברעילות חריפה או בודקת זן גנטי לעמידות למצב רעיל. הפרוטוקול לדוגמה מציג בדיקת הישרדות לדוגמה שבה תולעים נבדקות על יכולתן להתנגד לעקה חמצונית הנגרמת על ידי פרקוואט (PQ).

ג. אלגנס בדיקת הישרדות: מבחן רעילות לטווח קצר

סרטון זה מציג כימוטקסיס בנמטודה C. elegans ומציג פרוטוקול לדוגמה הבודק סלידה כימוטקטית מנחושת גופרתית.

ג. אלגנס בדיקת כימוטקסיס: שיטה לבדיקת כימוסנסציה בתולעים

כדי לחקור את הקשר בין הומאוסטזיס חלבון, מתח והזדקנות, עקבנו אחר שינויים בקיפול החלבון על ידי מעקב אחר תפקוד לקוי של חלבון, לוקליזציה של חלבון בתא ויציבות החלבון ברמת האורגניזם, התא והחלבון, תוך שימוש במטזואן Caenorhabditis elegans הניתן לטיפול גנטי כמערכת מודל.

שימוש ב-Caenorhabditis elegans כמערכת מודל לחקר הומאוסטזיס חלבון באורגניזם רב-תאי

C. elegans הוא מודל שימושי לחקר ההשפעות של אתנול על ההתנהגות. אנו מציגים בדיקת התנהגותית שמכמתת את ההשפעות של אתנול על מהירות התנועה של תולעים זוחלות; ניתן למדוד עם הבדיקה הזו גם את הרגישות הראשונית וגם את התפתחות הסובלנות התפקודית החריפה לאתנול.

Assay למדידת ההשפעות של אתנול במהירות התנועה של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

C. elegans הוא אורגניזם מודל אטרקטיבי לחקר מסלולי העברת אותות המעורבים בעמידות לעקה חמצונית. כאן אנו מספקים פרוטוקול למדידת עמידות לעקה חמצונית של בעלי חיים C. elegans בשלב נוזלי, באמצעות מספר חומרים מחמצנים ב-96 לוחות בארות.

מדידת התנגדות סטרס חמצוני של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; בצלחות microtiter 96-היטב

אנו מציגים התנהגות הקלטה הקלטה ופרוטוקול המאפשר ניתוח אוטומטי של נמטודות, Caenorhabditis elegans 'העדפת תרכובות מסיסות באסאי מבוסס האוכלוסייה. מאמר זה מתאר את הבנייה של תא התנהגות, פרוטוקול assay התנהגותי, וניתוח וידאו השימוש בתוכנה.

ניתוח אוטומטי של אוכלוסיה מבוססת נמטודות מבוססי Assay העדפה

שיטה כמותית פותחה כדי לזהות ולחזות את רעילות חריפה של כימיקלים על-ידי ניתוח באופן אוטומטי את פרופיל פנוטיפי של Caenorhabditis elegans. פרוטוקול זה מתאר כיצד להתייחס תולעים עם כימיקלים בצלחת 384-ובכן, לכידת וידאו, לכמת פנוטיפים קשורים רעילות.

וזמינותו תפוקה גבוהה עבור חיזוי של רעילות כימית על ידי אוטומטית פרופילים פנוטיפי של Caenorhabditis elegans

כאן, אנו מאפיינים את התגובות הסלולר מדגיש התגובה התאית ב-נמטודות C. אלגיה על ידי מדידת ההפעלה של כתבים פלורסנט ההמרה ולומר רגישות ללחץ פיזיולוגי.

מדידות התגובות הפיזיולוגיות של הלחץ בג. אלגיה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לתרבית נמטודות בודדות על מדיה מוצקה למעקב אחר פרמטרים פיזיולוגיים לכל החיים וכימות פלואורסצנטי. מערכת תרבית זו כוללת מחסום חומצה פלמיטית סביב בארות תולעים בודדות כדי למנוע מבעלי חיים לברוח, ומאפשרת שימוש בהתערבויות מרתיעות, כולל חיידקים פתוגניים וגורמי עקה כימיים.

תרבות ארוכת טווח של Caenorhabditis elegans בודדים על מדיה מוצקה לניטור פלואורסצנטי אורכי והתערבויות מרתיעות

פרוטוקול זה מתאר בדיקה לכימות קצב ההזנה של Caenorhabditis elegans בהתבסס על מדידת פינוי החיידקים בתרבית נוזלית.

כימות צריכת המזון ב- Caenorhabditis elegans על ידי מדידת פינוי חיידקים

למדו שיטת מעבדה להערכת התנהגות דחיית נחושת ב-Caenorhabditis elegans במעבר ממצב שבע לרעב. השיטה מאפשרת זיהוי מוטנטים עם תגובות התנהגותיות שונות בתנאי רעב.

א

גלה סרטונים נוספים