א Caenorhabditis elegans מצב תזונתיים מבוססי Assay Assersion

המטרה הכוללת של בדיקת סלידה מנחושת מבוססת מצב תזונתי זו היא להעריך נמטודה המגיבה לכימיקל מרתיע ולמקור מזון במשך תקופה של ארבע שעות. זה מאפשר הערכה בו זמנית של המצב התזונתי. שיטה זו יכולה לסייע לתחום מדעי המוח ההתנהגותיים על ידי זיהוי מוטנטים שאינם מצליחים לווסת דפוסי תנועה ותגובה לכימיקל מרתיע למרות תנאי רעב.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבצע אותה לאורך פרק זמן ממושך, המאפשר ניתוח מצב תזונתי כאשר תולעים נעשות מורעבות יותר ויותר במשך ארבע שעות. כדי להכין אורגניזמים ניסיוניים לבדיקה, בחר 10 נמטודות שלב L4 לכל זרם, 24 שעות לפני תחילת הבדיקה, כדי לוודא שהאורגניזמים הם בוגרים צעירים בעת הבדיקה. עבור כל מוטציה או נמטודת ביקורת שנבדקה, בחר 10 L4s.

שמור על אורגניזמים L4, תוך שימוש בשיטות סטנדרטיות למשך 24 שעות על צלחות אגר סטנדרטיות שנזרעו עם OP50 E.Coli. 24 שעות לפני הבדיקה, השתמש בסרגל ובטוש קבוע עבה כדי לצייר קו בצד התחתון של מצע גידול נמטודה שהוכן בעבר או צלחת NGM לאורך הקצה החיצוני. סמן מחסום קו אמצע במרחק שווה מכל קצה של הצלחת.

זרעו את הצלחת עם 50 מיקרוליטר של OP50 E.Coli בצד אחד בלבד של מחסום הנחושת ליצירת מדשאה אחידה. השתמש בקווים המסומנים בצד התחתון של הצלחת כדי להבטיח שהחיידקים לא ייגעו בתמיסת הנחושת. ודא שתמיסת הנחושת תצפה את קצה הצלחת ותיצור מחסום קו אמצע ותעביר את החיידקים כך שתמיסת הנחושת לא תיגע במקור המזון.

סמן סט שני של צלחות ללא OP50 E.Coli, כדי לשמש כבקרה שלילית. הניחו לחיידקים להתייבש, ואז דגרו על הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. ודא כי כתמי החיידקים אינם מופרעים בעת העברת הנמטודות לחממה של 37 מעלות צלזיוס.

הפרעה מוגזמת עלולה לשנות את המיקום או הצורה של כתם המזון. לאחר דגירה של לילה, הוציאו צלחות מהחממה והשתמשו בחלק התחתון המסומן של הצלחת כמדריך, פיפטה 100 מיקרוליטר של תמיסת נחושת (II) סולפט טרייה שהוכנה על קצה האגר, ליצירת מחסום נחושת חיצוני. פיפטה 25 מיקרוליטר של תמיסת נחושת (II) סולפט ליצירת מחסום קו אמצע.

ודא שתמיסת הנחושת (II) סולפט אינה יוצרת קשר עם כתם החיידקים ואפשר לתמיסת נחושת להתייבש על הצלחת. בדוק אם יש יובש כל חמש דקות לאחר ההעברה, עם רקמת מעבדה על ידי טפיחה קלה של התמיסה ליד קצה הצלחת כדי להבחין. מיד לפני הבדיקה, העבירו את אורגניזמי הניסוי לצלחת אגר נטולת חיידקים ואפשרו לנמטודות לנוע בחופשיות במשך דקה אחת כדי להסיר עודפי חיידקים.

לאחר מכן, פיפטה מיליליטר אחד של M9 על הצלחת עם מבוגרים צעירים, שהועברו 24 שעות קודם לכן על מנת לשטוף תולעים לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה. צנטריפוגה את הנמטודות ב -3, 000 x G למשך דקה אחת. תולעים צריכות ליצור כדור בתחתית הצינור.

שאפו תמיסת M9 מבלי לשבש את כדור התולעת. הוסף מיליליטר אחד של תמיסת M9 לכדור התולעת. הפוך את הצינור כדי לערבב תולעים עם התמיסה.

אם עודפי חיידקים הועברו בתחילה עם התולעים, חזרו על הפעולה בסך הכל חמש פעמים. לאחר הכביסה הסופית, שאפו את הסופרנטנט עד 100 מיקרוליטר של תמיסת M9 וכדור התולעת נשאר. העבירו מיד תולעים מהתמיסה לאחר השלמת השטיפה.

פיפטה 20 מיקרוליטר של כדור התולעת מתחתית הצינור על מחצית לוחית הבדיקה ללא חיידקים, מבטיחה ש-10 תולעים מועברות לצלחת הבדיקה ושאין מזון מזהם. אין להעביר חיידקים לצלחות מירוץ המזון הנחושת. הסר עודף תמיסת M9 מהנמטודות עם רקמת מעבדה תוך דקה אחת.

ודא שתמיסת M9 אינה באה במגע עם תמיסת הנחושת (II) סולפט וכי התולעים ומשטח האגר נשארים שלמים. השלך תולעים שהוסרו בטעות עם רקמת המעבדה. לאחר שתמיסת M9 הוסרה, וכל התולעים החלו בדפוסי תנועה לא נוזליים, כלומר כאשר הם הפסיקו להכות.

הפעל את שעון העצר של הבדיקה, אם תולעים נוספות נכללו בטעות, הסר אותן על ידי קטיף בשמן הלוקרבון כדי להבטיח שלא יתווספו חיידקים לצלחת. בדוק את לוחיות הבדיקה כל 30 דקות. עבור צלחות הבדיקה עם מדבקות חיידקים, ציין חיובי אורגניזמים אם הם מגיעים לתיקון המזון במשך תקופה של ארבע שעות.

עבור לוחות הבקרה השליליים, ציין חיובי אורגניזמים אם הם חצו את המחסום. השתמשנו במוטציה של אובדן תפקוד N2 ו-npr-9 וזן ביטוי יתר של npr-9, המכונה npr-9 gain a function, כדי להעריך תגובות לרעב וסלידה מנחושת. עד סוף הבדיקה, 100% מהאורגניזמים מסוג הבר עברו למקור המזון, בעוד שאורגניזמים בעלי ביטוי יתר של npr-9 לא מווסתים דפוסי תנועה בתגובה למזון והמשיכו לחצות את המחסום המרתיע גם לאחר מגע עם מקור המזון.

בצלחת ללא מזון, אורגניזמים של אובדן תפקוד n2 או npr9 חצו לעתים רחוקות את מחסום הנחושת בעוד שנמטודות ביטוי יתר של npr-9 חוצות שוב ושוב את המחסום קדימה ואחורה. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להימנע משיבוש מחסום הנחושת בעת העברת נמטודות ו-M9 וגם לשמור על תנאים עקביים עבור כל זן כדי למנוע גורמים מבלבלים.