בתיווך פלורסצנטיות טומוגרפיה זיהוי, כימות הקשורות מקרופאג דלקת מעיים מאתר
15 בדצמבר 2017
הגששים במטרה לייצג כלי חדשני עבור ניתוח המנגנונים המולקולריים, כגון חלבון ביטוי בסוגים שונים של המחלה (למשל, דלקת, זיהום, ו- tumorigenesis). במחקר זה, אנו מתארים הערכה כמותית טומוגרפי תלת מימדי של הסתננות מקרופאג מעיים במודל מאתר של קוליטיס באמצעות טומוגרפיה בתיווך פלורסצנטיות F4/80-ספציפיות.
המטרה הכללית של גישה זו לדימות in vivo ספציפי למטרה היא ויזואליזציה של סמנים מולקולריים של פעילות מחלה במחלה דלקתית של המעי. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום של מחלה דלקתית של המעי, ובמחקר טיפולי קשור בנוגע להשפעה של טיפולים ניסיוניים או אירועים תאיים ספציפיים על הדלקת. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לנטר את פעילות המחלה באופן אlongitudinal ולא פולשני.
למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי הפרעות דלקתיות, ניתן ליישמה גם לחקר מחלות אחרות, כגון סרטן או מחלות הקשורות למערכת החיסון. כדי להשרות קוליטיס, מלאו את אספקת מי השתייה של העכברים הניסויים בשני גרמים של dextran sodium sulfate, או DSS, המומסים ב-100 milliliters של מי שתייה שעברו אוטוקלאב, בהערכה של חמישה milliliters מים לעכבר ליום. 24 שעות לפני הסריקה, טענו את תערובת הנוגדנים הרצויה למזרק סטרילי המוגן מאור, והזריקו את הנוגדנים תוך-ורידית לוורידי הזנב של חיות הניסוי.
ביום הניסוי, השתמשו במכונת גילוח חשמלית כדי לגלח את הפרווה באזור הבטן של חיות הניסוי, על מנת לצמצם את החזר האור והבליעה שלו. באמצעות פנטום מדמה-רקמה בעובי ובמאפייני בליעה מוגדרים, מלאו את הפנטום בנפח ספציפי של תמיסת הנוגדן הרלוונטית ומדדו את הפלורסצנציה במכשיר ה-FMT. לאחר מכן, במכשיר טומוגרפיה מתווכת-פלורסצנציה (FMT) וטרינרי לבעלי חיים קטנים, לחצו על New Study וכללו בתיאור המחקר את הסמנים הרלוונטיים, כולל את פרמטרי ההדמיה והמינונים.
צרו קבוצות מחקר בהתאם למערך הניסוי, תוך הקצאת מספר החיות המתאים לכל קבוצה. כאשר המערכת כוילה עבור מבני הסמן, הניחו את העכבר הראשון המורדם בתנוחת גב (supine) בתוך קסטת בדיקה ניתנת לחימום בטמפרטורה של 42 °C. הכניסו את הקסטה למערכת ההדמיה ובחרו את הדגימה המתאימה מקבוצת המחקר הרלוונטית.
בחר את הסמן שהוחדר כדי להבטיח שערכי ריכוז הסמן יחושבו כראוי, ורכוש את תמונת ההחזרה הפלואורסצנטית באורך הגל המתאים לסריקה. לחץ על Acquire Image כדי להגדיר את שטח הסריקה, ואשר ששטח הסריקה מופיע כשכבה מעל תמונת ההחזרה הפלואורסצנטית. התאם את שטח הסריקה עד שיקיף את אזור העניין, תוך הקפדה להימנע משגיאות או מאזורים שבהם נותר פרווה.
בהתאם למטרת הדימוי, בחרו רזולוציית שדה סריקה כדי לקבוע את מספר נקודות נתוני הדימוי בתוך שדה הסריקה. לאחר מכן לחצו על Scan כדי להתחיל ברכישת הדימוי באורך הגל שנבחר. בסיום הסריקה, הוציאו את בעל החיים מהקסטה כדי לאפשר לו להתאושש באופן מלא תחת ניטור לפני החזרתו לכלובו.
ניתן לחזור על ה-FMT בנקודות זמן שונות בהתאם לדרישות הניסוייות. כדי לנתח את התמונות שהתקבלו, פתח את תוכנת ניתוח הדימות המתאימה ובחר את נתוני הגלם עבור הסריקה הראשונה. באמצעות כלי השחזור, צור מפות תלת-ממדיות (3D) של התפלגות הפלואורסצנציה.
כאשר כל הסריקות נוספו למערך הנתונים המתאים לשחזור, פתח את מערך הנתונים הראשון הרלוונטי. יוצגו כל הסריקות שבוצעו עבור בעל החיים הניסויי שנבחר. בחר את הסריקה המתאימה ולחץ על Load.
שחזור תלת-ממדי של התפלגות הסמן יופיע כשכבה מעל תמונת רפלקטנציית הפלואורסצנציה שנרכשה בתחילה. לאחר מכן, זהו את מוקדי הצטברות הסימון הבלתי ספציפיים במפות התלת-ממדיות המשוחזרות והשתמש בכלי המדידה כדי לבחור את אזור העניין. התוכנה תפיק לאחר מכן עוצמת פלואורסצנציה עבור אזור העניין, וכן מדידות של כמות הסמן בפיקומולר (picomolar) עבורן כוילב הסריקה.
בניסוי זה, נעשה שימוש בנוגדן מצומד פלואורסצנציה נגד F4/80 עכברי כדי לדמיין באופן ישיר את המקרופאגים הפעילים. נמדדה הצטברות מוגברת משמעותית של סמן פלואורסצנטי באמצעות טומוגרפיה מתווכת פלואורסצנציה במעי הגס של עכברים עם קוליטיס בהשוואה לבעלי החיים בקבוצת הביקורת ללא קוליטיס, מה שמעיד על עלייה בחדירת מונוציטים ובידולם למקרופאגים פעילים בבעלי החיים עם הקוליטיס. לעומת זאת, יישום של נוגדן IgG לא ספציפי מצומד פלואורסצנציה לא עורר תגובת פלואורסצנציה ניתנת לגילוי בבטן או במעי, הן בקבוצת הקוליטיס והן בקבוצת הביקורת ללא קוליטיס, מה שמוכיח את הספציפיות של האינטראקציה בין הגשוש למטרה של נוגדן F4/80.
מדידות ex vivo של הצטברות סמן המכוון ל-F4/80 במעי הגס שהוצא מהגוף מאששות עוד יותר את מקורו של אות הצטברות הסמן F4/80 שזוהה in vivo במעי הגס. ואכן, כמויות הנוגדן הקשור שחושבו נמצאות במתאם טוב עם מספר המקרופאגים המסתננים שנקבעו היסטולוגית, מה שמאשר כי דימיון in vivo עם סמנים ספציפיים יכול להעיד על פעילות מחלה מקומית. ברגע שהטכניקה נשלטת, ניתן לבצע אותה ולנתח אותה בתוך דקות ספורות אם היא מבוצעת כראוי.
שלבי ההכנה, הכוללים ייצור של סמנים ספציפיים מבוססי נוגדנים, נמשכים בדרך כלל יומיים עד שלושה ימים. בעת תכנון פרוצדורה ניסויית כזו, חשוב לכלול בקרות מתאימות ואמינות, הן עבור הנוגדן והן עבור מודל מחלת בעלי החיים. לאחר פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון קולונוסקופיה או ציטומטריית זרימה, כדי לענות על שאלות נוספות ולתקף ולכמת את הנתונים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג גישה של דימות in vivo ספציפית למטרה לצורך ויזואליזציה של סמנים מולקולריים של פעילות מחלה במחלה דלקתית של המעי. באמצעות הערכה טומוגרפית תלת-ממדית כמותית, המחקר מתמקד בחדירה של מקרופגים למעי במודל עכברי של קוליטיס.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי העצבים
- אימונולוגיה
- מחלה דלקתית של המעיים
רקע
- גששים ספציפיים למטרה הם כלים חדשניים לניתוח מנגנונים מולקולריים.
- ניתן להשתמש בהם כדי לחקור ביטוי חלבונים במחלות שונות.
- שיטה זו מאפשרת ניטור אורכי ולא פולשני של פעילות המחלה.
- ניתן ליישם אותה על הפרעות דלקתיות, סרטן ומחלות הקשורות למערכת החיסון.
מטרת המחקר
- להדמיה של סמנים מולקולריים של פעילות מחלה במחלה דלקתית של המעי.
- למענה על שאלות מפתח במחקר טיפולי הקשור לדלקת.
- להערכת ההשפעה של טיפולים ניסיוניים על דלקת.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- השראה של קוליטיס באמצעות dextran sodium sulfate (DSS).
- מתן תערובת נוגדנים בווריד לעכברים ניסוייים.
- טומוגרפיה מתווכת פלואורסצנציה להדמיית חדירת מקרופאגים.
- ניטור אורך של פעילות המחלה in vivo.
תוצאות עיקריות
- הדמיה מוצלחת של חדירת מקרופאגים למעי.
- הוכחת היכולת לנטר את פעילות המחלה באופן לא פולשני.
- מתן תובנות לגבי דינמיקת הדלקת בקוליטיס.
- זיהוי יישומים פוטנציאליים לחקר מחלות אחרות.
מסקנות
- גישת הדימות הספציפית למטרה יעילה לחקר מחלות מעי דלקתיות.
- שיטה זו יכולה להעמיק את ההבנה של מנגנוני המחלה והשפעות טיפוליות.
- מחקרים עתידיים יכולים להרחיב את יישומה למחלות דלקתיות וחיסוניות אחרות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימות אורכי לא פולשני של חדירת מקרופאגים מאפשר זיהוי מוקדם של תגובות דלקתיות במודלים פרה-קליניים, ובכך מפחית את ההסתמכות על נקודות סיום טרמינליות ותומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים של תרופות אנטי-דלקתיות. טומוגרפיה כמותית תלת-ממדית מתווכת פלואורסצנציה מספקת ביטחון חיזוי לגבי מעורבות המטרה והשפעות המשנות את המחלה, ומסייעת בקבלת החלטות המשך (go/no-go) בתוכניות למחלות מעי דלקתיות (IBD) ומחלות ממסרות חיסוניות. גישה זו משפרת את הרצף התרגומי על ידי סנכרון של תוצאות דימות in vivo עם תיקוף היסטופתולוגי, ובכך משפרת את תעדוף הפורטפוליו והקצאת המשאבים בצינורות הפיתוח של תגליות חדשות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות ויזואליזציה של הצטברות מקרופאגים חיוביים ל-F4/80 כמדד תפקודי לדלקת במעיים.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות אינטראקציות ספציפיות בין הגשוש למטרה, כפי שהודגם על ידי היעדר אות בביקורות IgG לא ספציפיות.
- ערך ניבוי: מקשר בין הצטברות הגשוש in vivo לבין קישור נוגדנים ex vivo וספירת מקרופאגים היסטולוגית, ובכך מחזק את הביטחון במטרה לצורך סריקת אימונומודולטורים.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מוכנות הבדיקה: מייצרת מפות פלואורסצנציה תלת-ממדיות כמותיות וסטנדרטיות ומדידות סמן בטווח של picomolar, המאפשרות סריקת תרכובות הניתנת לשחזור במודלים של קוליטיס.
- סקלאביליות: מאפשרת ניטור אורך (longitudinal monitoring) לאורך נקודות זמן שונות, מה שמפחית את מספר בעלי החיים הנדרשים ומגביר את העוצמה הסטטיסטית במחקרי יעילות טיפולית.
- שימוש חוזר בפלטפורמה: תואמת לתיקוף המשכי באמצעות קולונוסקופיה או ציטומטריה של זרימה (flow cytometry), ובכך תומכת בתהליכי עבודה אינטגרטיביים לתיקוף מטרות והתאמה של סמנים ביולוגיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדגים דלקת במעיים באמצעות קוליטיס המושרה על ידי DSS, מערכת נפוצה לחקר הפתוגנזה של IBD ותגובה טיפולית.
- המשכיות תרגומית: מקשר בין דימות לא פולשני לבין נקודות קצה היסטולוגיות, ובכך מאפשר קבלת החלטות על קידום מותאם סיכון המבוסס על נתונים תואמים in vivo ו-ex vivo.
- הפחתת סיכונים מנגנונית: עוקב אחר חדירת מונוציטים ודינמיקה של התמיינות מקרופאגים, ובכך מספק תובנה לגבי מנגנוני פעולה תאיים עבור טיפולים ניסיוניים.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד (Pipeline)
טומוגרפיה מתווכת פלואורסצנציה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה, דרך זיהוי מובילים ועד לבדיקת יעילות פרה-קלינית, במיוחד עבור תרכובות מווסתות חיסון בדלקות של מערכת העיכול.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות באמצעות כימות חדירת מקרופאגים כמדד פרמקודינמי של מודולציה של מסלולים במודלים של קוליטיס.
- סריקה: מספק פלטים כמותיים המוכנים לבדיקה (עוצמת פלואורסצנציה, ריכוז סמן) המאפשרים השוואה בין קבוצות טיפול ונקודות זמן.
- אנליטיקה: מספק מערכי נתונים תלת-ממדיים הניתנים לשחזור ומדידות של אזורי עניין (region-of-interest) המקלים על ניתוח סטטיסטי של השפעות הטיפול על לוקליזציה של תאי חיסון.
- מחקר טרנסלציונלי: מקשר בין דימות in vivo לתיקוף ex vivo, ובכך מחזק את ההלימה של סמנים ביולוגיים ואת הרצף הפרה-קליני עבור מועמדים לטיפול ב-IBD.
- שימוש חוזר ארגוני: מהווה יכולת דימות ניתנת לשימוש חוזר, ישימה למעקב אחר תאי חיסון, מחקרי תאי גזע ומודלים של אונקולוגיה מעבר לדלקות במעי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת עמימות מכניסטית באמצעות דימות ספציפי וכמותי של פעילות מקרופאגים.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והסטנדרטיזציה באמצעות כימות כיול של סמני מעקב ומעקב אורכי תוך-אינדיבידואלי.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות לקבלת החלטות מוקדמות של המשך או הפסקה (go/no-go) בהתבסס על ניטור לא פולשני של פעילות המחלה, ובכך מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים באמצעות נתוני דימות והיסטולוגיה תואמים, תוך זיקוק של קריטריוני ההתקדמות בקווי פיתוח של תרופות אימונומודולטוריות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדימות פלואורסצנטי, הכנת סממנים (tracers), וטיפול בבעלי חיים קטנים לצורך פרוטוקולים של הזרקה תוורידית והרדמה.
- תלוי בגישה למערכת טומוגרפיה מתווכת פלואורסצנציה לבעלי חיים קטנים, עם בחירת אורך גל מתאימה ותוכנה לשחזור תמונה.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי דימות, מינוני סממנים וניתוח אזורי עניין (ROI) לצורך פרשנות עקבית של הנתונים.
- כולל שיקולי התאמה בין מערכות מודל שונות, כולל הסרת פרווה ואופטימיזציה של דימות בטני, כדי למזער הפרעות באות.
- כולל מגבלות מעשיות כגון לוח זמנים של 2–3 ימים להכנת הסממנים, והצורך בביקורות איסוטיפ ומחלה מתאימות להבטחת ספציפיות.
