בתיווך פלורסצנטיות טומוגרפיה זיהוי, כימות הקשורות מקרופאג דלקת מעיים מאתר
15 בדצמבר 2017
הגששים במטרה לייצג כלי חדשני עבור ניתוח המנגנונים המולקולריים, כגון חלבון ביטוי בסוגים שונים של המחלה (למשל, דלקת, זיהום, ו- tumorigenesis). במחקר זה, אנו מתארים הערכה כמותית טומוגרפי תלת מימדי של הסתננות מקרופאג מעיים במודל מאתר של קוליטיס באמצעות טומוגרפיה בתיווך פלורסצנטיות F4/80-ספציפיות.
המטרה הכוללת של גישת הדמיה in vivo ספציפית למטרה זו היא לדמיין סמנים מולקולריים של פעילות מחלה במחלות מעי דלקתיות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מחלות המעי הדלקתיות, ומחקר טיפולי קשור על ההשפעה של טיפולים ניסיוניים או אירועים תאיים ספציפיים על דלקת. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לעקוב אחר פעילות המחלה לאורך ולא פולשני.
למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הפרעות דלקתיות, ניתן ליישם אותה גם לחקר מחלות אחרות, כגון סרטן או מחלות הקשורות למערכת החיסון. כדי לגרום לקוליטיס, מלאו את אספקת השתייה של עכברי הניסוי בשני גרם של נתרן גופרתי דקסטרן, או DSS, מומס ב-100 מיליליטר של מי שתייה אוטוקלאביים, והעריכו חמישה מיליליטר מים לעכבר ליום. 24 שעות לפני הסריקה, טען את קוקטייל הנוגדנים המעניין למזרק סטרילי המוגן מפני אור והזריק את הנוגדנים לווריד לוורידי הזנב של חיות הניסוי.
ביום הניסוי, השתמשו בסכין גילוח חשמלי כדי לגלח את הפרווה באזור הבטן של חיות הניסוי כדי למזער את השתקפות האור וספיגתו. באמצעות פנטום המחקה רקמות בעובי ומאפייני ספיגה מוגדרים, מלאו את הפנטום בנפח ספציפי של תמיסת הנוגדנים המעניינת ומדדו את הקרינה במכשיר ה-FMT. לאחר מכן, בטומוגרפיה בתיווך פלואורסצנטי וטרינרי, או מכשיר FMT לבעלי חיים קטנים, לחץ על מחקר חדש וכלול את העוקבים הרלוונטיים בתיאור המחקר, כולל פרמטרי ההדמיה והמינונים.
יצירת קבוצות לימוד בהתאם לתכנון הניסוי, צייד כל קבוצה במספר המתאים של בעלי חיים. כאשר המערכת כוילה עבור מבני המעקב, הנח את העכבר המורדם הראשון במצב שכיבה לתוך קלטת בדיקה ניתנת לחימום של 42 מעלות צלזיוס. הכנס את הקסטה למערכת ההדמיה ובחר את הדגימה המתאימה מקבוצת המחקר המתאימה.
בחר את העוקב המנוהל כדי להבטיח שערכי ריכוז העוקב מחושבים כהלכה, וקבל את תמונת החזר הקרינה באורך הגל המתאים לסריקה. לחץ על רכוש תמונה כדי לתאר את שדה הסריקה ולאשר ששדה הסריקה מופיע כשכבת-על על תמונת החזר הקרינה. התאם את שדה הסריקה עד שהוא מקיף את אזור העניין, הקפד למנוע טעויות או אזורים של פרווה שנותרה.
בהתאם ליעד התמונה, בחר רזולוציית שדה סריקה כדי להגדיר את מספר נקודות הנתונים של התמונה בשדה הסריקה. לאחר מכן לחץ על סרוק כדי להתחיל ברכישת התמונה באורך הגל שנבחר. בסיום הסריקה, הוציאו את החיה מהקסטה כדי לאפשר לבעל החיים להתאושש לחלוטין עם ניטור לפני החזרה לכלוב שלו.
לאחר מכן ניתן לחזור על ה-FMT בנקודות זמן שונות בהתאם לניסוי. כדי לנתח את התמונות שנרכשו, פתח את תוכנת ניתוח ההדמיה המתאימה ובחר את הנתונים הגולמיים לסריקה הראשונה. בעזרת כלי השחזור, צור מפות תלת-ממדיות של התפלגות הקרינה.
לאחר שכל הסריקות נוספו למערך נתוני השחזור המתאים, פתח את מערך הנתונים הראשון המעניין. כל הסריקות שבוצעו עבור חיית הניסוי הבודדת שנבחרה יוצגו. בחר את הסריקה המתאימה ולחץ על Load.
שחזור תלת מימדי של התפלגות העוקב יופיע כשכבת-על של תמונת ההשתקפות הקרינה שנרכשה בתחילה. לאחר מכן, זהה את מוקדי הצטברות התווית הלא ספציפית במפות התלת-ממדיות המשוחזרות והשתמש בכלי המדידה כדי לבחור את אזור העניין. לאחר מכן התוכנה תייצר עוצמת פלואורסצנטיות עבור אזור העניין, כמו גם מדידות כמות פיקומולרית של העוקב שעבורו כוילה הסריקה.
בניסוי זה, נעשה שימוש בנוגדנים מצומדים פלואורסצנטיים כנגד עכברים F4/80 כדי להמחיש ישירות את המקרופאגים המופעלים. הצטברות מוגברת משמעותית של עוקב פלואורסצנטי נמדדה על ידי טומוגרפיה בתיווך פלואורסצנטי במעי הגס של עכברים קוליטיים בהשוואה לחיות ביקורת שאינן קוליטיות, מה שמצביע על עלייה בחדירת מונוציטים והתמיינות למקרופאגים פעילים בבעלי חיים קוליטיים. לעומת זאת, יישום של נוגדן IgG מצומד פלואורסצנטי לא ספציפי לא אסר תגובת פלואורסצנטיות ניתנת לזיהוי בבטן או במעי בקבוצת הביקורת הקוליטית או הלא קוליטית, מה שמדגים את הספציפיות של האינטראקציה בין הבדיקה למטרה של נוגדן F4/80.
מדידות ex vivo של הצטברות עוקב מכוונת F4/80 במעי הגס הנטוע מאמתות עוד יותר את המקור המעי הגס של הצטברות אות העוקב F4/80 שזוהתה in vivo. ואכן, כמויות מחושבות של נוגדנים קשורים מתואמות היטב עם מספרים שנקבעו היסטולוגית של מקרופאגים חודרים, מה שמאשר שהדמיה in vivo עם עוקבים ספציפיים יכולה להעיד על פעילות מחלה מקומית. לאחר השליטה, ניתן לבצע ולנתח זאת תוך מספר דקות אם הוא מבוצע כראוי.
שלבי ההכנה, כולל ייצור עוקבים ספציפיים מבוססי נוגדנים, נמשכים בדרך כלל יומיים עד שלושה. כאשר מתכננים הליך ניסיוני כמו זה, חשוב לכלול בקרות מתאימות ואמינות, הן עבור הנוגדן והן עבור מודל המחלה של בעלי החיים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו קולונוסקופיה, או ציטומטריית זרימה כדי לענות על שאלות נוספות ולאמת ולכמת את הנתונים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג גישה לדימות in vivo ספציפית למטרה להמחשת סמנים מולקולריים של פעילות מחלתית במחלות מעי דלקתיות. תוך שימוש בהערכה טומוגרפית תלת-ממדית כמותית, המחקר מתמקד בחדירת מקרופאגים במעי במודל עכברי של קוליטיס.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- אימונולוגיה
- מחלות מעי דלקתיות
רקע
- חומרים מגוונים ספציפיים למטרה הם כלים חדשניים לניתוח מנגנונים מולקולריים.
- ניתן להשתמש בהם לחקר ביטוי חלבונים במחלות שונות.
- שיטה זו מאפשרת ניטור אורכי ולא פולשני של פעילות מחלתית.
- ניתן ליישם אותה על הפרעות דלקתיות, סרטן ומחלות קשורות לחיסון.
מטרת המחקר
- להמחיש סמנים מולקולריים של פעילות מחלתית במחלות מעי דלקתיות.
- לטפל בשאלות מרכזיות במחקר טיפולי הקשורות לדלקת.
- להעריך את ההשפעה של טיפולים ניסיוניים על הדלקת.
שיטות ששימשו
- גרימת קוליטיס באמצעות דקסטרן סולפט נתרן (DSS).
- מתן קוקטייל נוגדנים דרך הווריד לעכברים ניסיוניים.
- טומוגרפיה בתיווך פלואורסצנטי להמחשת חדירת מקרופאגים.
- ניטור אורכי של פעילות המחלה in vivo.
תוצאות עיקריות
- המחשה מוצלחת של חדירת מקרופאגים במעי.
- הוכחה על היכולת לנטר את פעילות המחלה באופן לא פולשני.
- סיפקה תובנות לגבי הדינמיקה של הדלקת בקוליטיס.
- זוהו יישומים פוטנציאליים לחקר מחלות אחרות.
מסקנות
- הגישה הספציפית למטרה לדימות היא יעילה לחקר מחלות מעי דלקתיות.
- שיטה זו יכולה לשפר את ההבנה של מנגנוני מחלה והשפעות טיפוליות.
- מחקר עתידי יכול להרחיב את יישומה למחלות דלקתיות וקשורות לחיסון אחרות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Non-invasive longitudinal imaging of macrophage infiltration enables early detection of inflammatory responses in preclinical models, reducing reliance on terminal endpoints and supporting mechanistic de-risking of anti-inflammatory therapeutics. Quantitative 3D fluorescence-mediated tomography provides predictive confidence in target engagement and disease-modifying effects, informing go/no-go decisions in IBD and immune-mediated disease programs. This approach enhances translational continuity by aligning in vivo imaging readouts with histopathological validation, improving portfolio triage and resource allocation in discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing F4/80-positive macrophage accumulation as a functional readout of intestinal inflammation.
- Operational Value: Supports biological de-risking through specific probe-target interactions, demonstrated by lack of signal with non-specific IgG controls.
- Predictive Value: Correlates in vivo tracer accumulation with ex vivo antibody binding and histologic macrophage counts, strengthening target confidence for immunomodulator screening.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantitative 3D fluorescence maps and picomolar tracer measurements, enabling reproducible compound screening in colitis models.
- Scalability: Facilitates longitudinal monitoring across time points, reducing animal use and increasing statistical power in therapeutic efficacy studies.
- Platform Reuse: Compatible with downstream validation via colonoscopy or flow cytometry, supporting integrated workflows for target validation and biomarker alignment.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models intestinal inflammation through DSS-induced colitis, a widely used system for studying IBD pathogenesis and therapeutic response.
- Translational Continuity: Links non-invasive imaging to histologic endpoints, enabling risk-adjusted advancement decisions based on concordant in vivo and ex vivo data.
- Mechanistic De-risking: Tracks monocyte infiltration and macrophage differentiation dynamics, providing insight into cellular mechanisms of action for experimental therapeutics.
Pipeline & Workflow Integration
Fluorescence-mediated tomography fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, particularly for immune-modulating compounds in gastrointestinal inflammation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying macrophage infiltration as a pharmacodynamic readout of pathway modulation in colitis models.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs (fluorescence intensity, tracer concentration) that enable comparison across treatment groups and time points.
- Analytics: Provides reconstructable 3D datasets and region-of-interest measurements that facilitate statistical analysis of treatment effects on immune cell localization.
- Translational Research: Connects in vivo imaging to ex vivo validation, strengthening biomarker alignment and preclinical continuity for IBD-targeted candidates.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable imaging capability applicable across immune cell tracking, stem cell studies, and oncology models beyond intestinal inflammation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through specific, quantifiable imaging of macrophage activity.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via calibrated tracer quantification and longitudinal intra-individual tracking.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early go/no-go decisions based on non-invasive disease activity monitoring, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through concordant imaging and histologic data, refining advancement criteria in immunomodulator pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence imaging, tracer preparation, and small animal handling for intravenous injection and anesthesia protocols.
- Dependent on access to a small animal fluorescence-mediated tomography system with appropriate wavelength selection and reconstruction software.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols, tracer dosing, and region-of-interest analysis for consistent data interpretation.
- Involves adaptation considerations across model systems, including fur removal and abdominal imaging optimization to minimize signal interference.
- Includes practical limitations such as the 2–3 day tracer preparation timeline and the need for appropriate isotype and disease controls to ensure specificity.
