קביעת Location(s) כרומוזומלית האופטימלית עבור רכיב ה-DNA ב- Escherichia coli באמצעות גישה מוזרה בתיווך Transposon

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לקבוע את המיקום הכרומוזומלי האופטימלי של כל אלמנט DNA נתון באמצעות החדרה אקראית בתיווך טרנספוזון, ניסויי תחרות וריצוף גנום שלם. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום שכפול ה-DNA כגון החשיבות של מיקום כרומוזומלי של יסוד גנטי. היתרון של טכניקה זו הוא שהיא מצמידה החדרה אקראית מבוססת טרנספוזון עם בחירת השיבוט המתאים ביותר על ידי יתרון גדילה.

כאן, זה מפושט על ידי אזור E.coli DARS2. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הארגון הכרומוזומלי של Escherichia coli, ניתן ליישם אותה גם על חיידקים אחרים. לאחר הכנת תאים אלקטרוקומפטנטיים כגון MG1655 דלתא DARS2 על פי פרוטוקול הטקסט, הוסף מיקרוגרם אחד של pNKBOR DARS2 ל-40 מיקרוליטר תאים והעביר את התערובת לקובטה סטרילית מקוררת מראש של 0.2 סנטימטר.

הכנס את הקובט לתא האלקטרופורציה. לאחר מכן, אלקטרופורציה של התאים ב -18 קילו-וולט, 500 אוהם ו -25 מיקרופאראד. קבוע הזמן צריך להיות כחמש אלפיות השנייה ולא אמורה להתרחש קשתות.

שחזר במהירות את תרחיף החיידקים על ידי השעיה מחדש במיליליטר אחד של מרק LB שחומם מראש והעביר למבחנה של 15 מיליליטר. דגרו על התאים בתנאי גידול מוגזים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ללא ברירה אנטיביוטית. לאחר מכן, צלחו את החיידקים על צלחות אגר LB בתוספת 50 מיקרוגרם למיליליטר קנמיצין ודגרו על הצלחות ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

למחרת, ספרו את המושבות מהאלקטרופורציה. מושבה אחת נחשבת שווה להכנסת טרנספוזון כרומוזומלי אחד. מוסיפים מיליליטר אחד של מרק LB לכל צלחת ושוטפים את כל המושבות.

השתמש שוב באותו מיליליטר אחד של מרק LB כדי להגדיל את ריכוז החיידקים. לאחר מכן, אסוף את כל המושבות באותו צינור של 50 מיליליטר. מערבל את הצינור כדי להקפיא את חומר המוצא ולערבב מיליליטר אחד של תרחיף תאים עם מיליליטר אחד של 50% גליצרול על קרח.

מעבירים את הצינורות לקרח יבש למשך 10 דקות. לאחר הקפאת התרביות, העבירו אותן למקפיא שלילי של 80 מעלות צלזיוס. להפשיר את ספריית הטרנספוזונים מ-80 מעלות צלזיוס על קרח.

מערבבים על ידי פיפטינג, ואז מעבירים 100 מיקרוליטר מספריית הטרנספוזון ל-10 מיליליטר LB במבחנה של 15 מיליליטר. גדל את התאים מאווררים בטלטול מתמשך ב-37 מעלות צלזיוס למשך שמונה שעות עד לשלב הנייח. התאם את הפרמטרים לתנאי גידול שונים כרצונך.

כדי להפיץ את אוכלוסיית החיידקים בערך כל 10 דורות, העבירו 10 מיקרוליטר מהשלב הנייח הקודם ל-10 מיליליטר של מדיום טרי שחומם מראש וגדלו את התרבית למשך שמונה שעות נוספות לשלב נייח. לאחר כל 100 דורות של תחרות, שמרו חמש דגימות של מיליליטר אחד ואחסנו אותן בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס. הכן את הגשושית לכתם הדרומי כנגד קטע של קילו-בייט אחד של ה-NKBOR על ידי הגברת PCR באמצעות פריימרים ספציפיים כמפורט כאן.

הפעל את הדוגמאות באמצעות התוכנית הבאה. סמן את שבר ה-PCR שנוצר עם dATP עם תווית P32 באמצעות מערכת הפריימר האקראית על פי סמית והכן את ה-DNA התאי הכולל בהתאם לפרוטוקול הטקסט. עכל את ה-DNA התאי הכולל עם Pvul שחותך את ה-NKBOR המכיל את אזור העניין מחוץ לאזור המכוסה על ידי הגשושית.

בצע כתם דרומי באמצעות ג'ל אגרוז 0.7% על פי Loebner-Olsen ו-von Freiesleben. כדי להשתמש בהליכה קלה של גנים כדי לזהות אתרי החדרת DARS2 משיבוטים בודדים, לאחר 700 דורות משוערים של תחרות, בודד DNA גנומי לתבנית ה-PCR על ידי פיזור חיידקים תחילה על צלחת אגר LB ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס בן לילה. חסנו מרק LB במושבות בודדות וגידלו אותן למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, העבירו 20 מיקרוליטר ל-200 מיקרוליטר מים מזוקקים חיטוי. מערבלים את המושבות לתמיסה, ואז מחממים את התערובת בחום של 100 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. צנטריפוגה את הדגימות במהירות מקסימלית למשך חמש דקות, ולאחר מכן שמור את הליזאט של התא במינוס 20 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.

לאחר מכן, עצב שלושה פריימרים מקוננים לחישול בתוך הטרנספוזון לבחירה כפי שמוצג כאן. השתמש ב-200 ננוגרם של DNA גנומי, פריימר אחד מקונן ופריימר אקראי כדי להכין תגובת PCR של 20 מיקרוליטר. לאחר מכן, הפעל את הדוגמאות באמצעות התוכנית הבאה.

עבור ההגברה השנייה, השתמש במיקרוליטר אחד של התגובה הראשונה כתבנית והשתמש בפריימר מקונן שניים ובאותו פריימר אקראי. בצע תגובה שלישית באופן דומה באמצעות פריימר מקונן שלוש, אותו פריימר אקראי ומיקרוליטר אחד מהתגובה השנייה כמו התבנית. יש למרוח את המוצרים מתגובת ה-PCR הסופית על ג'ל אגרוז 1.5% וסטטין עם אתידיום ברומיד.

גזרו רצועה בטווח של 100 עד 800 זוגות בסיסים ובודדו את ה-DNA באמצעות כל ערכת מיצוי ג'ל DNA מסחרית בהתאם להוראות היצרן. כדי לבצע ציטומטריית זרימה, יש לאזן כל תרבית חיידקים על ידי שמירתה בשלב הצמיחה האקספוננציאלית למשך 10 דורות לפחות. מדוד את ה-OD600 וודא שהוא לעולם לא יעלה על 0.3.

כדי לבצע ריצת ריפמפיצין לפי פרוטוקול הטקסט, העבירו מיליליטר אחד של תרבית לשפופרת של 15 מיליליטר המכילה 30 מיקרוליטר של RIF-CEF. דגרו את הצינור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור למשך ארבע שעות לפחות. עבור דגימת ה-EXP, העבירו מיליליטר אחד של תרבית הגדלה באופן אקספוננציאלי לצינור של 1.5 מיליליטר על קרח.

לאחר מכן, קצרו את התאים על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 15, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. השעו מחדש את הגלולה ב-100 מיקרוליטר של 10 מילי-מולרי טריס pH 7.5 קר כקרח והוסיפו מיליליטר אחד של אתנול 77% קר כקרח. אחסן את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס עד לשימוש.

מכתים את התאים על ידי קצירת 100 עד 300 מיקרוליטר של תאים קבועים על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 15,000 פעמים G למשך 15 דקות. הסר את הסופרנטנט והשתמש ב-130 מיקרוליטר של תמיסת צביעת DNA כדי להשעות מחדש את הגלולה. לאחר מכן, דגרו את הדגימות על קרח ובחושך למשך 10 דקות.

לבסוף, השתמש בזרימה ציטומטרית כדי לקבוע את המקור לתא, את מסת התא היחסית ואת תכולת ה- DNA היחסית. לאחר מיצוי ה-DNA ממאגר הטרנספוזונים הראשוני וכל 100 מתוך 700 דורות של תחרות, ה-DNA נחתך עם Pvul שידוע כחותך טרנספוזון NKBOR DARS2 פעם אחת באזור שלא כוסה על ידי הגשושית ובוצע כתם דרומי. כפי שמוצג כאן, למאגר הראשוני של DARS2 היו חסרים רצועות מובהקות, מה שמראה ש-DARS2 הוכנס באופן אקראי בכל הכרומוזום.

עם הזמן, נוצר דפוס שבו המאגר הגדול הראשוני של שיבוטי DARS2 התפתח לשיבוט DARS2 אחד או כמה מתמידים בלבד. ריצוף גנום שלם שימש לזיהוי אתרי החדרת DARS2 ממאגר ההתחלה. ולאחר 400, 500 ו-700 דורות של תחרות בתת-קבוצה מייצגת של רצף החדרה, 98% מכלל החדרות DARS2 נמצאו קרוב למיקום הכרומוזומלי של DARS2 מהסוג הפראי.

ו-2% נמצאו במקומות אחרים בכרומוזום. תאים חסרי DARS2 הוכחו בעבר כמתחילים שכפול בסנכרון ויש להם ירידה בריכוז המקור ביחס לתאים מסוג בר. כאן, הנוכחות של אלמנט DARS2 בקצה אינה משחזרת את הסינכרון או את תוכן המקור הסלולרי לרמות מסוג פרא בעוד ששיבוטי ה-DARS2 שנבחרו IR ו-RPPH אכן יוזמים שכפול בסנכרון.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לקבוע את המיקום הכרומוזומלי האופטימלי של אלמנט DNA נתון. זה נעשה על ידי החדרות אקראיות מבוססות טרנספוזון ואחריהם ניסויי תחרות ולבסוף ריצוף גנום שלם.