טיהור של קרום התא עבור הקשורים רשתית תוך-פלזמית השפלה של אנטיגנים אקסוגני במצגת-קרוס
21 באוגוסט 2017
השיטה המתוארת כאן היא חדשה שלפוחית פרוטוקול בידוד, המאפשר הטיהור של התאים הסלולר איפה אנטיגנים אקסוגני מעובדים על ידי הקשורים רשתית תוך-פלזמית השפלה במצגת-קרוס.
המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לטהר את התא הקרומי, שבו מתבצעת פירוק דמוי ERAD של אנטיגנים אקסוגניים בהצגה צולבת. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתקופת החיסון, כגון הבהרת התא או השפלה דמוית ERAD בהצגה צולבת. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהשלפוחיות המטוהרות מכילות את כל הפעולות המולקולריות. זה מאפשר פירוק דמוי ERAD של כל האנטיגנים האקסוגניים. כך ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הצגה צולבת. על ידי תאים דנדריטיים, ניתן ליישם אותו גם על סוגים אחרים של תאים מציגי אנטיגן המראים יכולת הצלבה. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שאי אפשר להוציא את כל הרקע הלא ספציפי. יום לפני הטיהור, פיצל את תאי DC2.4 ל-0.1 מיליון תאים למ"ל בצלחת תרבית רקמה במאגר RPMI. הימנע משמירה על התאים במצב קונפלואנט כדי להגדיל את ההסתברות לשילוב אנטיגן אקסוגני. לפני שתאי DC2.4 מתכנסים למחצה, הוסף אובאלבומין ביוטיניל, או bOVA, כאנטיגן אקסוגני. לאחר מכן, דגרו במשך שעתיים עד ארבע שעות. קצרו את התאים על ידי פיפטינג עדין מצלחת הרקמה לתוך צינור חרוטי חדש של 50 מ"ל. צנטריפוגה של התאים ב-1000 X G למשך חמש דקות ב-4
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול חדש לבידוד שלשיות (vesicles), המאפשר טיהור של מדורים תאיים המעורבים בעיבוד של אנטיגנים חיצוניים. השיטה מתמקדת בתפקידה של פירוק הקשור לרשתית הפנימית (endoplasmic reticulum-associated degradation) בתהליך ההצגה הצולבת (cross-presentation).
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- אימונולוגיה
רקע
- הבנת עיבוד האנטיגנים היא קריטית למחקר אימונולוגי.
- פירוק הקשור לרשת האנדופלזמית (ERAD) ממלא תפקיד מפתח בבקרת איכות של חלבונים.
- הצגה צולבת (Cross-presentation) חיונית להפעלה של תאי T.
- שיטות נוכחיות לבידוד שלשקים עשויות להיות חסרות סגוליות.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול יעיל יותר לבידוד וזיקולות.
- שיפור ההבנה של מנגנוני עיבוד אנטיגנים.
- סבסוד מחקרים בנושאי הצגה צולבת (cross-presentation) ותגובות חיסוניות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- פיתוח פרוטוקול לבידוד וסיקולות.
- טכניקות טיהור עבור מדורים תאיים.
- ניתוח של פירוק הקשור לרשת האנדופלזמית.
- הערכת יעילות של הצגה צולבת.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול החדש משפר באופן משמעותי את טוהר הוזיקולות.
- הבנה משופרת של מסלולי עיבוד אנטיגנים.
- יעילות מוכחת במבדקי הצגה צולבת (cross-presentation).
- השלכות פוטנציאליות על פיתוח חיסונים ואימונותרפיה.
מסקנות
- הפרוטוקול שפותח מציע שיטה מהימנה לבידוד וסיקולות.
- התובנות שיושגו עשויות לקדם את המחקר בתחום האימונולוגיה.
- שיטה זו עשויה להוביל לאסטרטגיות טיפוליות משופרות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
טיהור של שלפוחיות הקשורות ל-ERAD מתאי דנדריטיים מאפשר בחינה מכניסטית של הצגה צולבת (cross-presentation), תהליך קריטי לעיבוד אנטיגנים ולהפעלה חיסונית. יכולת זו תומכת בביטחון ניבוי בתיקוף מטרות עבור פורטפולי גילוי ממוקדי אימוןולוגיה, ומסייעת בקידום מותאם-סיכון של מועמדים לטיפולים אימונותרפיים. התשומשיות של הפרוטוקול לתאי הצגה של אנטיגנים אחרים מרחיבה את ערכו האסטרטגי עבור צינורות מו"פ ארגוניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר מחקר ישיר של מסלולי פירוק דמויי ERAD בעיבוד אנטיגנים.
- תומך בתיקוף תפקודי של מנגנוני הצגה צולבת (cross-presentation) בתאים דנדריטיים.
- מסייע בהסרת סיכונים מנגנוניים לבחירת מטרות אימונולוגיות.
- מספק פלטפורמה לבדיקה מבוססת היפותזה של גורל האנטיגן.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מספק שלפוחיות מטוהרות המתאימות לבדיקות שחזור כמותיות in vitro.
- משפר את הדירות הבדיקה על ידי בידוד מדורים תאיים מוגדרים.
- מאפשר סטנדרטיזציה של קריאות הצגה צולבת (cross-presentation) להערכת תרכובות.
- תומך בפיתוח של פלטפורמות סריקה ניתנות להרחבה ולשימוש חוזר עבור מודולטורים של עיבוד אנטיגנים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מנגנונים חיסוניים הרלוונטיים למחלה על ידי מידול הצגה צולבת (cross-presentation) של אנטיגנים.
- מאפשר רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של חומרים מווסתים את מערכת החיסון.
- תומך בזיהוי של סמנים ביולוגיים (biomarkers) תרגומיים הקשורים לנתיבי עיבוד אנטיגנים.
- מסייע בקבלת החלטות מותאמות סיכון לקידום טיפולים אימונותרפיים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
פרוטוקול זה לניקוי שלפוחיות משלב בין שלבי הגילוי המוקדמים לאימונולוגיה פרה-קלינית, ובכך הוא תומך בתהליכי עבודה החל מתיקוף מכניסטי של מטרות ועד לזיהוי מועמדים מובילים.
- ביולוגיה של התגליות: מספק מערכת לבחינת היפותזות של עיבוד אנטיגנים ולהבהרת המעורבות של נתיב ה-ERAD.
- סריקה: מספק בדיקות כמותיות הניתנות לשחזור המבוססות על וזיקולות להערכת מודולטורים של הצגה צולבת (cross-presentation).
- אנליטיקה: מאפשר מדידה של תוצרי הובלת אנטיגנים, יוביקוויטינציה ועיבוד פרוטאוזומלי.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים מכניסטיים לתגובות חיסוניות רלוונטיות למחלה ואסטרטגיות של סממנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פרוטוקול סטנדרטי וניתן להתאמה לסוגים שונים של תאים מציגי אנטיגנים.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בתיקוף של מטרות חיסוניות ומפחית עמימות מכניסטית.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) של בדיקות עיבוד אנטיגנים.
- ערך אסטרטגי: משפר קבלת החלטות מסוג go/no-go ויעילות הון בפורטפוליו של אימונולוגיה.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים ובקידום של מועמדים לטיפול אימונותרפי.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בביולוגיה של התא, אימונולוגיה וטכניקות לניקוי וזיקוק של וזיקולות.
- דורש גישה למכשירים אנליטיים ולצנטריפוגות ייעודיות.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים כדי למזער רקע לא ספציפי.
- ניתן להתאמה למודלים שונים של תאים מציגי אנטיגן באמצעות אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- זיהום של הרקע וטוהר הוזיקולות נותרים מגבלות מעשיות שיש לטיפלן.
שאלות נפוצות בנושא ביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:13
Preparation of Microsomes
4:44
Purification of Microsomes with bOVA Underground ERAD
6:59
In Vitro Reconstruction of ERAD Ubiquination of bOVA Using Purified Microsomes
9:04
Results: Purified Microsomes and In Vitro Ubiquination of the Exogenous Antigen
11:06
Conclusion
