Name: טיהור של קרום התא עבור הקשורים רשתית תוך-פלזמית השפלה של אנטיגנים אקסוגני במצגת-קרוס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: למד פרוטוקול לבידוד וסיקול של קרום התא עבור חקר עיבוד אנטיגנים אקסוגני במצגת-קרוס. שיטה זו משפרת את הבנת מנגנוני הדגרדציה ב-ERAD ומסייעת במחקר אימונולוגי מתקדם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי אוניברסיטת טקסאקי של בריאות ורווחה.

1. גידול תאים, תוספת של אנטיגנים אקסוגני <ol><li>הכן בווה באמצעות תיוג של ביוטין-חלבון קיט בעקבות היצרן &#39; פרוטוקול s. 
	הערה: בדרך כלל, בווה מכיל 2 מ' ביוטין לכל ביצית 1 מ' בממוצע-</li>
	<li>DC2.4 לגדל תאים RPMI-1640 בתוספת 2 מ מגלוטמין 1 מ"מ נתרן פירובט, חומצות אמינו שאינן חיוניות 0.1 מ מ, פניצילין U/mL 100-סטרפטומיצין, 55 מ"מ מרקפטואתנול, 10 מ מ HEPES (pH 7.5), סרום עגל עוברית 10% (להלן RPMI) ב 37 ° C 5 % CO 2 ב חממה humidified (להלן ללא אזכור, תאים מודגרת ב מצב זה). אפשרי גם להשתמש בתוספת 10% עגל עוברית סרום, 3.7 g/L NaHCO 3 (להלן DMEM) במקום RPMI DMEM.</li>
	<li>ביום אחד לפני טיהור, פצל את התאים RPMI עונה 1 פרק 10 5 תאים/מ בצלחת תרביות רקמה. הימנע להשאיר את התאים במצב confluent. תאים DC2.4 יכול מאוד לשלב אנטיגנים אקסוגני עד מדינה confluent למחצה, אבל במהירות מאבדים את היכולת כשמגיעים למצב של יתר confluent.</li>
	תאים <li>לפני DC2.4 הם confluent למחצה, להוסיף µg/mL 250 של בווה עבור 1 x 10 6 תאים למ"ל, תקופת דגירה של 2-4 ה 
	הערה: במהלך הניסויים במורד הזרם, כל מאגרי, ריאגנטים נשמרים ב 4 ° C אלא אם צוין אחרת.</li>
</ol> 2. הכנת Microsomes <ol><li>לקצור את התאים DC2.4 על ידי pipetting עדין מהצלחת רקמה לתוך צינור חרוטי 50 מ ל.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 1,000 x g למשך 5 דקות, 4 ° C בזהירות להסיר את המדיום עם בווה על-ידי שאיפה.</li>
	<li>לרחוץ את התאים DC2.4 פעמיים עם 40 מ של מאגר PBS (1.37 מ מ NaCl, 8.1 מ מ נה 2 HPO 4, 2.68 מ מ אשלגן כלורי, 2 PO 1.47 אינץ מ מ ח' 4) על ידי צנטריפוגה-1000 g x עבור 5 דקות, 4 ° C ולמחוק את תגובת שיקוע בכל פעם על ידי שאיפה.</li>
	<li>Resuspend בגדר בשלב 2.3 ב- 1 - 2 מ ל (כרך 1/20-1/10 של תרבות בינוני) המגון בינוני (0.25 M סוכרוז, 1 מ"מ EDTA, 10 מ מ HEPES-NaOH [pH 7.4]) עם נפח 1/1000 של קוקטיילים מעכב פרוטאז והעברה DC2.4 resuspended תאים לתוך מהמגן דאונס קר כקרח.</li>
	<li>לשבש את התאים DC2.4 resuspended בעדינות על ידי 10-20 משיחות עם מהמגן דאונס קר כקרח. 
	הערה: במהלך השלב שיבושים, מהמגן דאונס הוא מקורר על קרח</li>
	<li>להעביר את המתלים שיבשו תא צינור חרוטי 15 mL-</li>
	<li>להוסיף 8-9 מ ל המגון בינוני הכולל 10 מ"ל, centrifuge את הצינור חרוט 10 דקות ב 2,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס</li>
	<li>להעביר את תגובת שיקוע צינור חרוטי 15-mL החדש כדי להסיר תאים רצופה, גרעינים, centrifuge את צינור חרוטי שוב 10 דקות ב 2,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס</li>
	<li>להעביר את תגובת שיקוע לתוך צינור ultracentrifugation חדש צנטריפוגה למשך 45 דקות ב 100,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס</li>
	<li>וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend בגדר בקפידה תוך 1-2 מ של המגון בינוני עם נפח 1/1000 של קוקטיילים מעכב פרוטאז מאת pipetting הפתרון לאורך מספר פעמים כדי להפוך שבר microsome לניסויים במורד הזרם.</li>
	<li>להעביר את השבר microsome לתוך צינור התחתון עגול 5-mL- 
	הערה: לאחר שלב זה, זה אפשרי להעשיר microsomes אובייקטיבי על ידי צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות iodixanol על פי היצרן &#39; פרוטוקול s, כדי להסיר את microsomes שאינם ספציפיים. שברים שיא אנטיגנים אקסוגני של נאספים וכוח נתון אז השלב הבא של טיהור (שלב 3).</li>
</ol> 3. טיהור של Microsomes עם בווה עירד שעברו <ol><li>נפח הוסף 1/100 מערכו של טרי חרוזים SA-מגנטי כדי השבר microsome של צעד 2.11 ב 5 mL סיבוב התחתית התחתונה. 
	הערה: לפני שלב זה, זה אפשרי לנקות את השבר microsome מראש על ידי חרוזים שליטה-מגנטי כדי להפחית את contaminations של microsomes שאינם ספציפיים.</li>
	<li>מערבבים היטב ובעדינות לסובב את הצינור התחתון עגול לאט במשך 30 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס</li>
	<li>להוסיף 2-3 מ"ל של מדיום המגון הכולל 4 מ"ל לתוך הצינור התחתון עגול ומערבבים בעדינות היטב.</li>
	<li>למקם את הצינור התחתון עגול על דוכן מגנטי, תקופת דגירה של מינימום 10-4 מעלות צלזיוס. מאז החרוזים קשורה השלפוחיות המוגלתיות נמשכים למגנט, חום מיקרו-חרוזים יצטברו בהדרגה אל הקיר הצינור הקרוב למגנט.</li>
	<li>עם הצינור שנותרו הדוכן מגנטי, בזהירות למחוק את supernatants על ידי השאיפה להסיר את השלפוחיות המוגלתיות לא מאוגד.</li>
	<li>לשטוף החרוזים מגנטי קשורה השלפוחיות המוגלתיות פעמיים עם 5 מיליליטר המגון בינוני על ידי המגנטי לעמוד 10 דקות ב 4 ° C ולמחוק את תגובת שיקוע בכל פעם על ידי השאיפה בזהירות. 
	הערה: ללא העמדה מגנטי, טיהור על ידי centrifugations ב g x 2,000 למשך 10 דקות, 4 ° C זמין גם.</li>
	<li>Resuspend החרוזים מגנטי קשורה השלפוחיות המוגלתיות היטב במדיום 100 µL המגון על-ידי pipetting הפתרון לאורך מספר פעמים.</li>
	<li>להעביר השלפוחיות המוגלתיות resuspended microtube חדשים כמו microsome מטוהרים לניסויים במורד הזרם. 
	הערה: בדרך כלל, 50 שבר microsome של µL, המכיל 5-20 חלבונים µg מתאי 7 עונה 1 פרק 10 ניתן לבודד.</li>
</ol> 4. ניתוח של Microsomes לטהר <ol><li>Resuspend המגנטי חרוזים מאוגדים השלפוחיות המוגלתיות מ 3.8 צעד 100-200 µL TNE מאגר (20 מ מ טריס-HCl pH 7.4, 150 מ מ NaCl, 0.5 M EDTA, 1% Nonidet P-40) עם נפח 1/1000 של קוקטיילים מעכב פרוטאז במקום המדיום המגון.</li>
	<li>להעביר את lysate שלב 4.1 microtube החדש 1.5-mL-</li>
	<li>לקבוע ריכוז חלבון שלב 4.2 באמצעות ערכת assay BCA לכל היצרן &#39; פרוטוקול s. 
	הערה: בדרך כלל, 5-10 µL lysate מהשלב 4.2 מספיקה כדי לקבוע ריכוז חלבון.</li>
	<li>להעביר את lysate מהשלב 4.2 (2 µg של חלבון עבור צביעת כסף ו 10 µg של חלבון עבור סופג המערבי) לתוך חדש microtubes.</li>
	<li>לשים את microtubes על גוש חום-95 ° C ומרתיחים חלבונים 1 x מרחביות ג'ל-טעינת מאגר (100 מ מ טריס-HCl pH 6.8, 200 מ"מ dithiothreitol, 4% מרחביות, 0.2% bromophenol כחול, 20% גליצרול) עבור 5 דק</li>
	<li>Centrifuge את microtubes 10 דקות ב 21, 500 x g ו- 4 מעלות צלזיוס. לאסוף את supernatants לתוך microtubes חדש כדי להסיר את השברים לא מסיסים.</li>
	<li>לנתח את החלבונים נפתרה בשלב 4.6 (2 µg) מאת SD רגיל-דף.</li>
	<li>Visualize הלהקות חלבונים על ידי כסף מכתים באמצעות צביעת כסף קיט בעקבות היצרן &#39; פרוטוקול s.</li>
	<li>לנתח את החלבונים נפתרה בשלב 4.6 (10 µg) על ידי SD-דף רגיל סופג-מערבי. השתמש הכימית (SA-HRP) לכל היצרן &#39; s פרוטוקול והמחש מאת fluorography.</li>
</ol> 5. במבחנה בנייתו מחדש של עירד Ubiquitination של בווה באמצעות מטוהר Microsomes microsomes <ol><li>העברה מטוהרים (5-10 µg של חלבון) משלב 3.8 עם נפח 50% של רטיקולוציט lysate (RL), 1 x תגובת מאגר (50 מ מ טריס pH 7.4, 3 מ מ ATP, 0.5 מ מ MgCl 2), ו- 0-שתיים pM מתויג דגל אוביקוויטין ב microtube החדש. הנפח הסופי של הניסוי הזה הוא 20-40 µL.</li>
	<li>Incubate microtube עבור 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס. 
	הערה: אם כמות ubiquitinated בווה בשלב 5.12 הוא קטן מדי כדי לזהות סופג המערבי, להוסיף 10 מיקרומטר של MG132 או 2 מיקרומטר של lactacystin כדי לעכב את העיבוד של בווה ubiquitinated מאת proteasomes.</li>
	<li>לעצור את התגובה על ידי הצבת את microtube על קרח</li>
	<li>לפתור את microsomes על-ידי הוספת 500 מאגר TNE µL עם נפח 1/1000 של קוקטיילים מעכב פרוטאז.</li>
	<li>צנטריפוגה microtube 10 דקות ב- 21,500 x g ו- 4 מעלות צלזיוס. לאסוף את supernatants לתוך microtube חדשים להסיר את השברים לא מסיסים, אשר מכילים בווה ubiquitinated ב DC2.4 לפני וזמינותו ubiquitination במבחנה.</li>
	<li>להעביר את תגובת שיקוע microtube חדש ולהוסיף 1/100 בכמויות החרוזים SA-מגנטי חדש (בדרך כלל 5 µL עבור 500 µL של supernatants).</li>
	<li>מערבבים היטב ובעדינות לסובב את microtube לאט לאט במשך 30 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס</li>
	<li>Centrifuge את microtube 10 דקות ב 21, 500 x g ו- 4 ° C. להשליך תגובת שיקוע על ידי השאיפה לשחזר את בווה ואת ubiquitinated בווה מאוגד עם החרוזים SA-מגנטית.</li>
	<li>לשטוף פעמיים את החרוזים SA-מגנטית שנאספו עם 1 מ"ל של מאגר TNE על ידי צנטריפוגה 10 דקות ב 21, 500 x g ו- 4 ° C. להשליך תגובת שיקוע בכל פעם על ידי שאיפה.</li>
	<li>להרתיח את החרוזים SA-מגנטית 1 x ג'ל מרחביות טעינת מאגר עבור 5 דקות ב 95 מעלות צלזיוס על חום-בלוק לפתור את החלבונים מטוהרת על-ידי החרוזים SA-מגנטית.</li>
	<li>Centrifuge את microtube 10 דקות ב 21, 500 x g ו- 4 מעלות צלזיוס. לאסוף את supernatants לתוך microtube חדשים להסיר את השברים לא מסיסים.</li>
	<li>לנתח את החרוזים SA-מגנטית חייבים את החלבונים על ידי עמודים SD סטנדרטי, לא סופג-מערבי. השימוש של נוגדנים (אנטי-דגל נגד-multi-Ub, העכבר אנטי איג-HRP) ו הכימית (SA-HRP) הוא לפי היצרן &#39; פרוטוקול s ודמיינו ידי fluorography.</li>
</ol>

<ol><li>van Endert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Providing+ligands+for+MHC+class+I+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Providing ligands for MHC class I molecules.</a> Cell Mol Life Sci. 68 (9), 1467-1469 (2011).</li>
<li>Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJaneway%2C+C+%22Immunobiology%3A+The+Immune+System+in+Health+and+Disease%22">Immunobiology: The Immune System in Health and Disease</a>. , 5th ed, Garland Press. New York. (2001).</li>
<li>McDevitt, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+the+role+of+the+major+histocompatibility+complex+in+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Discovering the role of the major histocompatibility complex in the immune response.</a> Annu Rev Immunol. 18 (1), 1-17 (2000).</li>
<li>Bedoui, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-presentation+of+viral+and+self+antigens+by+skin-derived+CD103%2B+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cross-presentation of viral and self antigens by skin-derived CD103+ dendritic cells.</a> Nat Immunol. 10 (5), 488-495 (2009).</li>
<li>Segura, E., Villadangos, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+presentation+by+dendritic+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen presentation by dendritic cells in vivo.</a> Curr Opin Immunol. 21 (1), 105-110 (2009).</li>
<li>Cheong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+stimulation+fully+differentiates+monocytes+to+DC-SIGN%2FCD209%28%2B%29+dendritic+cells+for+immune+T+cell+areas%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Microbial stimulation fully differentiates monocytes to DC-SIGN/CD209(+) dendritic cells for immune T cell areas.</a> Cell. 143 (3), 416-429 (2010).</li>
<li>Henri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD207%2B+CD103%2B+dermal+dendritic+cells+cross-present+keratinocyte-derived+antigens+irrespective+of+the+presence+of+Langerhans+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">CD207+ CD103+ dermal dendritic cells cross-present keratinocyte-derived antigens irrespective of the presence of Langerhans cells.</a> J Exp Med. 207 (2), 189-206 (2010).</li>
<li>Shortman, K., Heath, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CD8%2B+dendritic+cell+subset%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The CD8+ dendritic cell subset.</a> Immunol. Rev. 234 (1), 18-31 (2010).</li>
<li>Carbone, F. R., Kurts, C., Bennett, S. R., Miller, J. F., Heath, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-presentation%3A+a+general+mechanism+for+CTL+immunity+and+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Today%22%5BJournal%5D)">Cross-presentation: a general mechanism for CTL immunity and tolerance.</a> Immunol Today. 19 (8), 368-373 (1998).</li>
<li>Nair-Gupta, P., Blander, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+updated+view+of+the+intracellular+mechanisms+regulating+cross-presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">An updated view of the intracellular mechanisms regulating cross-presentation.</a> Front Immunol. , (2013).</li>
<li>Joffre, O. P., Segura, E., Savina, A., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-presentation+by+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cross-presentation by dendritic cells.</a> Nat Rev Immunol. 12 (8), 557-569 (2012).</li>
<li>Kurts, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+class+I-restricted+exogenous+presentation+of+self+antigens+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo.</a> J Exp Med. 184 (3), 923-930 (1996).</li>
<li>Kurts, C., Kosaka, H., Carbone, F. R., Miller, J. F., Heath, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class+I-restricted+cross-presentation+of+exogenous+self-antigens+leads+to+deletion+of+autoreactive+CD8%28%2B%29+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Class I-restricted cross-presentation of exogenous self-antigens leads to deletion of autoreactive CD8(+) T cells.</a> J Exp Med. 186 (2), 239-245 (1997).</li>
<li>Bonifaz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeting+of+protein+antigen+to+the+dendritic+cell+receptor+DEC-205+in+the+steady+state+leads+to+antigen+presentation+on+major+histocompatibility+complex+class+I+products+and+peripheral+CD8%2B+T+cell+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Efficient targeting of protein antigen to the dendritic cell receptor DEC-205 in the steady state leads to antigen presentation on major histocompatibility complex class I products and peripheral CD8+ T cell tolerance.</a> J Exp Med. 196 (12), 1627-1638 (2002).</li>
<li>Heath, W. R., Carbone, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-presentation+in+viral+immunity+and+self-tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cross-presentation in viral immunity and self-tolerance.</a> Nat Rev Immunol. 1 (2), 126-134 (2001).</li>
<li>Imai, J., Hasegawa, H., Maruya, M., Koyasu, S., Yahara, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+antigens+are+processed+through+the+endoplasmic+reticulum-associated+degradation+%28ERAD%29+in+cross-presentation+by+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exogenous antigens are processed through the endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD) in cross-presentation by dendritic cells.</a> Int Immunol. 17 (1), 45-53 (2005).</li>
<li>Houde, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosomes+are+competent+organelles+for+antigen+cross-presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phagosomes are competent organelles for antigen cross-presentation.</a> Nature. 425 (6956), 402-406 (2003).</li>
<li>Guermonprez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER-phagosome+fusion+defines+an+MHC+class+I+cross-presentation+compartment+in+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">ER-phagosome fusion defines an MHC class I cross-presentation compartment in dendritic cells.</a> Nature. 425 (6956), 397-402 (2003).</li>
<li>Burgdorf, S., Scholz, C., Kautz, A., Tampe, R., Kurts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+mechanistic+separation+of+cross-presentation+and+endogenous+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Spatial and mechanistic separation of cross-presentation and endogenous antigen presentation.</a> Nat Immunol. 9 (5), 558-566 (2008).</li>
<li>Lizée, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+dendritic+cell+cross-presentation+by+the+major+histocompatibility+complex+class+I+cytoplasmic+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Control of dendritic cell cross-presentation by the major histocompatibility complex class I cytoplasmic domain.</a> Nat Immunol. 4 (11), 1065-1073 (2003).</li>
<li>Basha, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CD74-dependent+MHC+class+I+endolysosomal+cross-presentation+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">A CD74-dependent MHC class I endolysosomal cross-presentation pathway.</a> Nat Immunol. 13 (3), 237-245 (2012).</li>
<li>Saveanu, L., Carroll, O., Hassainya, Y., van Endert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexity%2C+contradictions%2C+and+conundrums%3A+studying+post-proteasomal+proteolysis+in+HLA+class+I+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Complexity, contradictions, and conundrums: studying post-proteasomal proteolysis in HLA class I antigen presentation.</a> Immunol Rev. 207 (1), 42-59 (2005).</li>
<li>Wiertz, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sec61-mediated+transfer+of+a+membrane+protein+from+the+endoplasmic+reticulum+to+the+proteasome+for+destruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sec61-mediated transfer of a membrane protein from the endoplasmic reticulum to the proteasome for destruction.</a> Nature. 384 (6608), 432-438 (1996).</li>
<li>Hampton, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER-associated+degradation+in+protein+quality+control+and+cellular+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">ER-associated degradation in protein quality control and cellular regulation.</a> Curr Opin Cell Biol. 14 (4), 476-482 (2002).</li>
<li>Tsai, B., Ye, Y., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-translocation+of+proteins+from+the+endoplasmic+reticulum+into+the+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Retro-translocation of proteins from the endoplasmic reticulum into the cytosol.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (4), 246-255 (2002).</li>
<li>Nyathi, Y., Wilkinson, B. M., Pool, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-translational+targeting+and+translocation+of+proteins+to+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Co-translational targeting and translocation of proteins to the endoplasmic reticulum.</a> Biochim Biophys Acta. 1833 (11), 2392-2402 (2013).</li>
<li>Varabyova, A., Stojanovski, D., Chacinska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+protein+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial protein homeostasis.</a> IUBMB Life. 65 (3), 191-201 (2013).</li>
<li>Shen, Z., Reznikoff, G., Dranoff, G., Rock, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloned+dendritic+cells+can+present+exogenous+antigens+on+both+MHC+class+I+and+class+II+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cloned dendritic cells can present exogenous antigens on both MHC class I and class II molecules.</a> J Immunol. 158 (6), 2723-2730 (1997).</li>
<li>Imai, J., Otani, M., Sakai, T., Hatta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+the+subcellular+compartment+in+which+exogenous+antigens+undergo+endoplasmic+reticulum-associated+degradation+from+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Heliyon%22%5BJournal%5D)">Purification of the subcellular compartment in which exogenous antigens undergo endoplasmic reticulum-associated degradation from dendritic cells.</a> Heliyon. , (2016).</li>
<li>Kovacsovics-Bankowski, M., Rock, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phagosome-to-cytosol+pathway+for+exogenous+antigens+presented+on+MHC+class+I+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A phagosome-to-cytosol pathway for exogenous antigens presented on MHC class I molecules.</a> Science. 267 (5195), 243-246 (1995).</li>
<li>Ackerman, A. L., Giodini, A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1074761306004262">A role for the endoplasmic reticulum protein retro translocation machinery during cross presentation by dendritic cells.</a> Immunity. 25 (4), 607-617 (2006).</li>
<li>Ackerman, A. L., Kyritsis, C., Tampé, R., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+phagosomes+in+dendritic+cells+form+a+cellular+compartment+sufficient+for+cross+presentation+of+exogenous+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Early phagosomes in dendritic cells form a cellular compartment sufficient for cross presentation of exogenous antigens.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12889-12894 (2003).</li>
<li>Saveanu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRAP+identifies+an+endosomal+compartment+required+for+MHC+class+I+cross-presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">IRAP identifies an endosomal compartment required for MHC class I cross-presentation.</a> Science. 325 (5937), 213-217 (2009).</li>
<li>Zehner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+translocon+protein+Sec61+mediates+antigen+transport+from+endosomes+in+the+cytosol+for+cross-presentation+to+CD8%28%2B%29+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The translocon protein Sec61 mediates antigen transport from endosomes in the cytosol for cross-presentation to CD8(+) T cells.</a> Immunity. 42 (5), 850-863 (2015).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

במחקרים קודמים של CP, אנטיגנים אקסוגני incorporated שהצטברו באזור הסגור של אנדוזום מאוחר או מיון על ידי מיקרוסקופ immunofluorescent16,30,31,32. ההערכה היא כי עירד כמו תחבורה, עיבוד של אנטיגנים אקסוגני מתבצעות באזורים מיוחדים אלה של מיון או אנדוזום מאוחר, כמו תא הסלולר זוהה על ידי סוכרוז או iodixanol צפיפות צנטריפוגה מעבר צבע באמצעות בווה ubiquitinated כמו סמן עיבוד עירד דמוי. לאחר גירוי שלהם מו...

MHC אני מולקולות באים לידי ביטוי על פני השטח של כל התאים nucleated, עם פפטידים קצרים antigenic נגזר אנטיגנים אנדוגני, אשר מעובדות על-ידי מערכת אוביקוויטין-פרוטאוזום ציטוזול1. לאחר עיבוד, פפטידים antigenic מועברים לתוך לומן (ER) רשתית תוך-פלזמית על ידי פפטיד לגבי המעלית מהברז. ב- ER לומן, סדרה של משגיחים ספציפית לסייע ההעמסה פפטיד, הנכון קיפול של MHC אני מורכבים. סדרה זו של מולקולות נקרא המתחם פפטיד העמסה (PLC), המציינת כי המיון תא מרכזי בשביל פפטיד מעמיסים על MHC אני2. לאחר טעינה, פפטיד MHC אני מולקולות מועברים אל פני השטח של התא, לשחק את תפקיד מרכזי במערכת החיסונית מסתגלת כמו סמני עצמית, ומאפשר CD8+ לימפוציטים מסוג T ציטוטוקסיות (Ctl) כדי לזהות תאים סרטניים או מדבקים לפי antigenic פפטידים-עצמי חלבונים3.
פפטידים antigenic מ אקסוגני אנטיגנים אנטיגן הצגת תאים (APC), הם גם מוצג בעת MHC אני4,5,6,7,8 דרך CP, אשר מתבצע בעיקר ליד DCs9,10,11. CP חיוני הן עבור הפעלת תמים CD8+ T תאים וזיכרון CD8+ T תאים לתוך אנטי-זיהומית, anti-tumoral Ctl12,13, של קיום רגישות המערכת החיסונית על-ידי inactivating של בפועל עצמית תמים T תאים14,15. החפ ק ממלא תפקידים חשובים רבים במערכת החיסון מסתגלת, אולם טרם ניתן לתאר בפירוט המנגנונים המולקולריים של CP. מחקרים קודמים של CP חשף כי אנטיגנים אקסוגני נרשמו נקודתית הן המיון והן את אנדוזום, שעובדו על-ידי עירד, רומז כי אנטיגנים אקסוגני מועברים מ אנדוזום לחדר המיון עבור עירד כמו עיבוד ופפטיד טעינת16 . עם זאת, ראיות המצטבר עולה הטעינה פפטיד של CP מתבצעת לא בחדר המיון, אלא דווקא בקלאסי מדורים endocytic, יש גם את התכונות המיוחדות של ה ER (איור 1)17,18 ,19,20,21. כדי למנוע השפלה של סימנים מקדימים פפטיד antigenic על ידי פעילות גבוהה של aminopeptidase22 ציטוזול, עיבוד, פפטיד טעינה ב CP מתרחשת באזור הפרוקסימלית של אלה תאים endocytic-קלאסי (איור 1). למרות אפיוני של תאים endocytic אלה שנויים במחלוקת, יש אין מולקולות ספציפיות קיים מלבד אנטיגנים אקסוגני במחלקה הזו.
עירד הוא מסלול סלולרי, אשר במיוחד מסיר חלבונים misfolded מחדר המיון. ב מסלול עירד, חלבונים misfolded retrogradely מועבר דרך קרום אר אל הציטופלסמה, שעובדו על-ידי24,2523,מערכת אוביקוויטין-פרוטאוזום. כאשר מולקולות גדולות, כגון חלבונים, מועברים דרך ליפידית, מולקולות אלה עוברים דרך מנגנון מולקולרי הנקרא translocon, כגון Sec61 מתחם, מתחם מיון26, ו טום מורכבים Derlin וטים מתחם המיטוכונדריה27. כאשר exogenously-נוסף אנטיגנים מועברים דרך קרום בחדר המיון, הם חייבים לחדור ליפידית במתחם עם translocons, כגון המתחם Sec61. השיטה המתוארת כאן לטהר את שלפוחית ממוקד על ידי ניצול מולקולות אלה חודר ממברנה כסמני עבור התאים endocytic.
השיטה המתוארת כאן הוא פרוטוקול טיהור שלפוחית חדשה באמצעות את התא DC דמוי קו DC2.428 , biotinylated אובלבומין (בווה) כמו אנטיגן אקסוגני. התאים endocytic היו מטוהרת על-ידי streptavidin (SA)-beads מגנטי באמצעות את בווה חודר קרום כמו מכונת. זה מטוהרים microsome, כמה exogenously נוספו בווה השתמר עדיין בחלקים ממברנה אבל היו מועברים אל מחוץ microsome ולאחר מכן ubiquitinated ומעובדים במבחנה29. זה microsome מטוהרים הכיל לא רק חלבונים ספציפיים תא endocytic, אלא גם חלבוני ER-תושב עירד, את פפטיד טעינת מורכבים; רומז תא הסלולר הוא תא endocytic פוטנציאליים עבור CP29. פרוטוקול זה אינו תלוי הסוג של אנטיגנים אקסוגני, והוא גם ישימים עבור קבוצות משנה אחרים DC וסוגי תאים אחרים, כגון מקרופאגים, תאי B ותאי אנדותל, כדי להבהיר את המנגנון המולקולרי מדויק של בקרי קבוצת מחשבים CP שגורה.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>gibco by life technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Equitech bio</td><td>SFB30</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>gibco על ידי Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>MEM חומצות אמינו לא חיוניות</td><td>gibco על ידי Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>gibco על ידי Life Technologies</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>2-מרקפטואתנול</td><td>ג'יבקו על ידי Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>ג'יבקו על ידי Life Technologies</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>פניסיצילין-Sreptomycin</td><td>gibco על ידי Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>gibco על ידי Life Technologies</td><td>12100-46</td><td></td></tr><tr><td>OVA</td><td>SIGMA</td><td>A5503</td><td></td></tr><tr><td>חלבון ביוטין ערכת תיוג</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>F6347</td><td></td></tr><tr><td>MG-132</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>201270</td><td></td></tr><tr><td>לקטציסטין</td><td>SIGMA</td><td>L6785</td><td></td></tr><tr><td>Dounce הומוגנייזר</td><td>IUCHI</td><td>131703</td><td></td></tr><tr><td>קוקטיילים מעכבי פרוטאז</td><td>SIGMA</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>יודיקסנול</td><td>Cosmo bio</td><td>1114542</td><td></td></tr><tr><td>SA-חרוזים מגנטיים</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>201270</td><td></td></tr><tr><td>שליטה חרוזים מגנטיים</td><td>Chemagen</td><td>M-PVA012</td><td></td></tr><tr><td>מעמד מגנטי</td><td>BD Biosciences</td><td>552311</td><td></td></tr><tr><td>BCA ערכת בדיקת חלבון</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>ערכות צביעת כסף</td><td>Cosmo bio</td><td>423413</td><td></td></tr><tr><td>Reticulocyte Lysate</td><td>Promega</td><td></td><td></td>1730714</tr><tr><td>יוביקוויטין</td><td>SIGMA</td><td>U5382</td><td></td>מתויג בדגל</tr><tr><td>נגד אובאלבומין (OVA, עכבר)</td> <td>חנות נוגדנים</td><td>HYB 094-06</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-מולטי-יוביקוויטין (עכבר)</td><td>MBL</td><td>D058&מינוס; </td><td></td>3</tr><tr><td>נגד דגל (עכבר)</td><td>SIGMA</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין</td><td>SIGMA</td><td>85450C</td><td></td></tr></tbody></table>

טיהור של קרום התא עבור הקשורים רשתית תוך-פלזמית השפלה של אנטיגנים אקסוגני במצגת-קרוס

Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation

תאים דנדריטים (Dc) מסוגלים מאוד עיבוד והצגת אנטיגנים אקסוגני למביטה על מחלקה histocompatibility הגדולות (MHC) אני מולקולות הידוע גם בשם צלב-מצגת (CP). CP ממלא תפקיד חשוב לא רק על הגירוי של תמים CD8+ T תאים וזיכרון CD8+ T תאים עבור זיהומיות וחסינות הגידול אלא גם ב איון של self-acting תמים T תאים על-ידי anergy תא T או מחיקה תא T. למרות המנגנון המולקולרי קריטי של CP נשאר כדי להיות הובהר, ראיות המצטבר מעיד כי אנטיגנים אקסוגני מתבצעות באמצעות רשתית תוך-פלזמית-הקשורים השפלה (עירד) לאחר הייצוא מקלאסי endocytic תאים. עד לאחרונה, אפיוני של תאים endocytic אלה היו מוגבלים כי היו אין סמנים מולקולריים ספציפי חוץ אנטיגנים אקסוגני. השיטה המתוארת כאן היא חדשה שלפוחית פרוטוקול בידוד, אשר מאפשר ולטיהור אלה תאים endocytic. משתמש זה מטוהרים microsome, אנחנו מחדש את עירד כמו תחבורה, ubiquitination, עיבוד של ה אנטיגן אקסוגני במבחנה, רומז כי המערכת אוביקוויטין-פרוטאוזום מעובד אנטיגן אקסוגני לאחר ייצוא מזה תא הסלולר. פרוטוקול זה יכול להחיל עוד יותר על סוגי תאים אחרים כדי להבהיר את המנגנון המולקולרי של CP.

התירי את המנגנון המולקולרי של CP, יש צורך לזהות את התאים הסלולר, איפה אנטיגנים אקסוגני עוברים עירד כמו תחבורה, עיבוד. בעוד תצפיות באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescent או באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים מזוהה תא הסלולר איפה אנטיגנים אקסוגני שנצבר16,17,18,19, 30,31,</sup...

השיטה המתוארת כאן היא חדשה שלפוחית פרוטוקול בידוד, המאפשר הטיהור של התאים הסלולר איפה אנטיגנים אקסוגני מעובדים על ידי הקשורים רשתית תוך-פלזמית השפלה במצגת-קרוס.

Dendritic cells (DCs) are highly capable of processing and presenting internalized exogenous antigens upon major histocompatibility class (MHC) I ...

המטרה הכללית של ניסוי זה היא לטהר את המדורה הממברנלית, שבה מתבצע פירוק דמוי ERAD של אנטיגנים אקסוגניים בתהליך של הצגה צולבת (cross-presentation). שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום החסינות, כגון בירוק המדורה התאית או פירוק דמוי ERAD בהצגה צולבת. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהשלפוחיות המטוהרות מכילות את כל הפעולות המולקולריות, מה שמאפשר פירוק דמוי ERAD של כל האנטיגנים האקסוגניים. לפיכך, שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי הצגה צולבת על ידי תאי דנדריטיים, והיא יכולה להיות מיושמת גם על סוגים אחרים של תאים מציגי אנטיגן המראים יכולת הצגה צולבת. באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו עלולים להתקשות, כיוון שבלתי אפשרי להסיר לחלוטין את כל הרקע הלא-ספציפי. יום לפני הטהרה, פצלו את תאי ה-DC2.4 לריכוז של 0.1 מיליון תאים ל-mL בצלחת תרבית רקמות בבופר RPMI. הימנעו מהשארת התאים במצב של התלכדות (confluency) כדי להגדיל את ההסתברות להטמעה של אנטיגן אקסוגני. לפני שתאי ה-DC2.4 מגיעים למצב של התלכדות חלקית, הוסיפו אובלבמין ביוטינילי, או bOVA, כאנטיגן אקסוגני. לאחר מכן, דגרו למשך שעתיים עד ארבע שעות. אספו את התאים באמצעות פיפטינג עדין מהצלחת הרקמה לשפופרת קונית חדשה של 50 mL. סובבו את התאים בצנטריפוגה ב-1000 X G למשך חמש דקות ב-4

purification-membrane-compartment-for-endoplasmic-reticulum

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

אנו מתארים את גישות ההדמיה אנו משתמשים כדי לחקור את ההפצה וניידות של חלבוני ניאון transfected תושב בreticulum endoplasmic (ER) באמצעות confocal ההדמיה של תאי חיים. אנחנו גם ultrastructurally לנתח את ההשפעה של הביטוי שלהם על הארכיטקטורה של תא subcellular זה.

ויזואליזציה של תחומי משנה reticulum endoplasmic בתאים בתרבית

תת-קבוצות תאים דנדריטיות נפרדות קיימות כאוכלוסיות נדירות באיברי לימפה, ולכן הן מאתגרות לבידוד במספרים ובטוהר מספיקים לניסויים אימונולוגיים. כאן אנו מתארים שיטת יעילות גבוהה ותפוקה גבוהה לבידוד של כל תת-הקבוצות העיקריות הידועות כיום של תאים דנדריטיים של טחול עכבר.

שיטת תשואה יעילה גבוהה עבור בידוד של תת תא העכבר דנדריטים

כאן אנו מתארים שתי גישות כדי לאפיין את האירועים הקיטוב התא ב לימפוציטים B במהלך היווצרות של IS. הראשון, כולל כימות של גיוס והשלד של ארגון מחדש על הקרום סינפטית. השני הוא גישה ביוכימית, כדי לאפיין שינויים בקומפוזיציה של הסנטרוחלק, אשר עובר קיטוב לסינפסה החיסונית.

לומדת אורגל דינמיקה ב-B תאים במהלך היווצרות סינפסה החיסונית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לשיקום פעילות החילוץ Msp1 עם רכיבים מטוהרים לחלוטין בפרוטואוליפוזומים מוגדרים.

שחזור פעילות החילוץ Msp1 עם רכיבים מטוהרים לחלוטין

כאן, אנו מתארים תנאי תרבית חוץ גופית , בידוד וייצור מוגבר של שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) מ-Echinococcus granulosus. הרכבים החשמליים הקטנים התאפיינו בפיזור אור דינמי ובמיקרוסקופ אלקטרונים שידור. הספיגה על ידי תאים דנדריטיים שמקורם במח העצם והאפנון הפנוטיפי שלהם נחקרו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית וציטומטריית זרימה.

בידוד וספיגת תאים דנדריטיים של שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות מ-Echinococcus granulosus

פרוטוקול זה מתאר שיטת טיהור SERCA משופרת, הכוללת את הטרהלוז הדו-סוכר בשלב הצנטריפוגה הסופי. פחמימה זו מייצבת חלבונים בתנאים קשים. ה-SERCA המטוהר היה פעיל קטליטית והפגין טוהר גבוה, מה שהופך אותו למתאים למחקרים מבניים ופונקציונליים.

טיהור הרטיקולום הסרקו-אנדופלזמי Ca2+-ATPase משריר הארנב

שיטה ספציפית ורגישה לגיבוש תובנה לפרופיל הביטוי של אנטיגנים glycosphingolipid באיברים ותאי חיסון מתוארת. השיטה מנצלת את ספקטרומטריית מסות מלכודת היונים המאפשר פיצול צעד חכם של מולקולות glycosphingolipid לניתוח מבני בהשוואה לסטנדרטים מסונתזים כימי.

ניתוח ספקטרומטריה של אנטיגנים Glycosphingolipid

שינוי קרום התא של תאי דם אדומים (RBCs) עם polyglycerol hyperbranched (HPG) מוצג. RBCs השתנה התאפיינו מחיצות מימיות 2 שלב, שבריריות האוסמוטי ותמוגה משלים מתווכת. ההסוואה של חלבונים על פני שטח ואנטיגנים הוערכה באמצעות cytometry הזרימה ומערכת מייקר הקלדה (MTS) כרטיסי phenotyping דם.

אנטיגנים מוגנים תאי דם אדומים פונקציונליים על ידי ההשתלה של ממברנה Polyglycerols Hyperbranched הקומפקטי

שלא כמו שראה לאאוקריוטים, יש מיעוט מחקרים ששלילת קוטביות קרום פירוט וריכוז יונים שינויים בחיידקים, כגודלם הקטן בעיקר הופך את השיטות מקובלות של מדידה קשה. כאן, אנו פרוטוקולי פרט לניטור אירועים כאלה בפתוגן גראם חיובית המשמעותי Streptococcus pneumoniae תוך שימוש בטכניקות הקרינה.

ניטור שינויים בממברנה קוטביות, ממברנה יושרה, וריכוזי יון תאיים ב<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; שימוש צבעי ניאון

כאן אנו מתארים שיטה לבידוד RNA חיידקי ליסטריה מונוציטוגנס הגדלים בתוך מקרופאגים של עכברים. ניתן להשתמש בטכניקה זו עם פתוגנים תוך-תאיים אחרים ותאי מארח של יונקים.

RNA טיהור מן intracellularly Grown<em&gt; חיידקי ליסטריה</em&gt; בתאי Macrophage

למד פרוטוקול לבידוד וסיקול של קרום התא עבור חקר עיבוד אנטיגנים אקסוגני במצגת-קרוס. שיטה זו משפרת את הבנת מנגנוני הדגרדציה ב-ERAD ומסייעת במחקר אימונולוגי מתקדם.

טיהור של קרום התא עבור הקשורים רשתית תוך-פלזמית השפלה של אנטיגנים אקסוגני במצגת-קרוס

גלה סרטונים נוספים