שיטת אפיון מופרה ב תודרנית

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לאפיין את דפוס היווצרות העוברים במהלך עובריות צמחים באמצעות אורגניזם המודל. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום החומר הצמחי, כגון אמבריוגנזה בארבידופסיס. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לאפיין היווצרות דפוס עובר בצמח המודל Arabidopsis על ידי הפעולה המומלצת.

מי שמדגים את ההליך הוא ג'ינלין פנג, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. כדי להתחיל בהליך זה, הוסף 100 זרעים לצינור של 1.5 מיליליטר. הוסף מיליליטר אחד של נתרן היפוכלוריט כדי לעקר את הזרעים.

הפוך את הצינור מספר פעמים כדי להבטיח שהזרעים והתמיסה מעורבבים היטב. לאחר חמש דקות, צנטריפוגה את הצינור ב -1200 Gs למשך 30 שניות. הסר את הסופרנטנט ושטוף את הזרעים במים סטריליים ארבע פעמים כדי להסיר שאריות נתרן היפוכלוריט.

לאחר מכן, הוסף 4.4 גרם תערובת מלח בסיסי MS ו -10 גרם סוכרוז לליטר אחד של מים טהורים במיוחד. מערבבים להמסת המלח והסוכרוז. בעזרת אשלגן הידרוקסיד במול אחד, התאם את ה-pH של התמיסה ל-5.8.

לאחר מכן, הוסיפו שלושה גרם חומר ג'ל ועיקרו את התמיסה בחום של 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. שופכים 30 מיליליטר ממדיום MS שנוצר לכלי תרבות בגודל 12 סנטימטר. מניחים את הזרעים המעוקרים על צלחת MS.

מעבירים את הצלחת למקרר, ושומרים אותה בחושך ארבע מעלות צלזיוס למשך שלושה ימים כדי לרבד את הזרעים. לאחר מכן, שמור את הצלחת בתא גידול בתנאי יום ארוך למשך שמונה ימים. לאחר מכן, העבירו את הצמחים לאדמה במגש.

מכסים את המגש במכסה לבן שקוף כדי למנוע אובדן מים. השארת פער קטן כדי למנוע זיגוג של הצמחים. לאחר חמישה ימים, הסר את המכסה וטפח את הצמחים בתא כניסה בתנאי יום ארוך.

לאחר כ -20 יום של צמיחה, השתמש בחוט כדי לסמן 10 עד 15 ניצני פרחים במיקום גבעולי הזרעים והתפרחת בשעה 20:00. הגדר את תחילת ההאבקה של הביצית כאשר הניצנים המסומנים נפתחים לפריחה כ-8:00 בבוקר למחרת. כדי להתחיל בהכנת תמיסת הוייר, הוסף 24 גרם כלורוהידרט לצינור של 50 מיליליטר. עטפו את הצינור לחלוטין בנייר אלומיניום, וודאו שהרדיד אוטם את כל האור.

הוסף תשעה מיליליטר מים טהורים במיוחד, ושלושה מיליליטר גליצרול. לנער את הצינור כדי להמיס את הכלורהידרט. לאחר מכן, הניחו לתמיסת הוייר המוכנה לעמוד למשך הלילה בטמפרטורת החדר כדי לחסל בועות.

כדי להתחיל, חבר חתיכת סרט דבק דו צדדי לשקופית זכוכית מיקרוסקופ. הניחו סיליק, שגדל למספר הימים הרצוי לאחר ההאבקה על הצד כשהפסאודוספקטום בניצב לפני השטח. בעזרת מחט מזרק מפצלים את הקרפלים משני צידי הפסאודוספטום.

לאחר מכן, חבר את שני הקרפלים המנותחים למגלשה כך שהביציות והסיליק ייראו תחת סטריאוסקופ. הוציאו 70 מיקרוליטר מהתמיסה של הוייר על מגלשת הזכוכית. לאחר מכן טבלו זוג פינצטה עדינה בתמיסה כדי להרטיב את הקצה.

בעזרת הסטריאוסקופ והפינצטה, העבירו את הביציות לתמיסת הוייר כדי לנקות את העוברים. לאחר מכן, החל בעדינות החלקת כיסוי על המגלשה, הקפד לא ליצור בועות. הניחו את השקופית המוגמרת לקופסה בחדר חשוך למשך שעתיים עד 12 שעות בטמפרטורת החדר.

לאחר שחלף הזמן הדרוש, השתמש בפונקציית ה-DIC של המיקרוסקופ כדי לבחון את הביציות הנקיות. אתר את העוברים תחת שדה בעל עוצמה נמוכה, ולאחר מכן שנה לשדה בעל עוצמה גבוהה כדי להתבונן בדפוס התאי בעוברים המפותחים. לאחר מכן, בדוק את העוברים בשלבי התפתחות שונים.

כדי להתחיל, הכינו את הפלסמיד DR5 GFP והכניסו אותו לצמחים מסוג הבר על ידי אגרובקטריום לטרנספורמציה מתווכת מתאסיאנים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. בחר את צמחי T1 באמצעות צלחות בינוניות MS המכילות הידרוליזין. לאחר מכן, העבירו וטפחו את הצמחים כמתואר בפרוטוקול הטקסט כדי להשיג צמחי T3.

בעזרת חוט סמנו את ניצני הפרחים של צמח T3 ההומוזיגוטי במיקום גבעולי הזרעים בתפרחת בשעה 20:00. לאחר מכן, מערבבים שלושה מיליליטר גליצרול עם 47 מיליליטר מים טהורים במיוחד ליצירת תמיסת גליצרול של 6%. לאחר מכן חבר חתיכת סרט דבק דו צדדי לשקופית זכוכית מיקרוסקופ. הניחו סיליק של צמח T3 על המגלשה כשהפסאודוספטום בניצב לפני השטח.

בעזרת מחט מזרק מפצלים את הקרפלים משני צידי הפסאודוספטום. חבר את שני הקרפלים המנותחים למגלשה כך שהביציות והסיליק ייראו מתחת לסטריאוסקופ. לאחר מכן, הוציאו 30 מיקרוליטר של 6% גליצרול על השקופית.

טבלו בתמיסה זוג פינצטה עדינה כדי להרטיב את הקצה. בעזרת הסטריאוסקופ והפינצטה, העבירו את הביציות לתמיסת הגליצרול. הנח בעדינות החלקת כיסוי על המגלשה.

לאחר מכן, הקש על השקופית במהירות ובעדינות כדי להוציא את העובר מהביצית. לאחר מכן, השתמש במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי כדי לבחון את השקופית עבור פלואורסצנטיות חלבון פלואורסצנטי ירוק. מצא את העוברים המבודדים מתחת לשדה בעל עוצמה נמוכה, ורשום את מיקומם.

שנה לשדה בעל עוצמה גבוהה והגדר את מקור אור העירור ל-488 ננומטר כדי לצפות בביטוי GR5 GFP בעוברים. לאחר מכן, זהה את ביטוי ה-GFP, ואפיין את היווצרות דפוס העובר כמתואר בפרוטוקול הטקסט. במחקר זה, האמבריוגנזה בארבידופסיס נצפית באמצעות פינוי ביציות, כפי שניתן לראות.

לאחר פינוי הביציות, ניתן להבחין בין העוברים בשלבי התפתחות שונים באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות הפרעות דיפרנציאליות. דפוס הביטוי של GR5 GFP במהלך האמבריוגנזה נרשם לאחר מכן במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי. נראה כי DR5 מתבטא בקוטב השורש של עוברים כדוריים ועוברים בצורת לב.

DR5 נראה מתבטא בקצות הקוטילדון העובריים, ובכלי הדם של עוברים בוגרים מסוג בר. לאחר מכן, תפקידו של naa10 בארבידופסיס במהלך האמבריוגנזה בוחן אותו. ההשערה נצפתה כמחולקת באופן חריג, עם חלוקה עקומה ואנכית ב-naa10 בהשוואה לחלוקה אסימטרית רוחבית בצמחי בר.

כפי שניתן לראות כאן, לשוורים יש תפוצה כמעט אחידה ברוב עוברי ה-naa10 בשלב הכדורי, והם שומרים על אות רחב יותר בהשערות בהשוואה לעוברים מסוג בר. תוצאות אלה מצביעות על כך ש-naa10 נדרש לאמבריוגנזה, וכי ניתן לעורר אותו דרך מסלול איתות השוורים ב-Arabidopsis. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כיצד לגדל ארבידופסיס כחומר צמחי.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע אמצעים אחרים כמו הכלאה באתרה על מנת לענות על שאלות נוספות כמו ביטוי גנים ספציפיים לתא. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום האמבריוגנזה לחקור את המנגנון המולקולרי שבאמצעותו גנים ספציפיים מתווכים את האמבריוגנזה בארבידופסיס. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לאפיין אמבריוגנזה בארבידופסיס.