Name: שיטת אפיון מופרה ב תודרנית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-04T10:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: למד שיטת אפיון מופרה ב-Arabidopsis באמצעות מיקרוסקופיית DIC ו-GFP. הפרוטוקול מאפשר ניתוח מורפולוגיה עוברית, מספר תאים ותבניות ביטוי גנים בביולוגיה התפתחותית של צמחים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים ד ר ג ' סיקה Habashi על קריאה ביקורתית של כתב היד. אנו מודים דוקטור שנג Xianyong של מרכז הדמיה, המכללה למדעי החיים, אוניברסיטת הון (בייג'ינג, סין), על ביצוע הלוקליזציה של DR5-GFP וזמינותו. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של קרן המדע בייג'ינג הממשל העירוני (CIT &#38; TCD20150102) את נבחרת מדעי הטבע קרן של סין וממנה (31600248).

הערה: פרוטוקול זה יש שלושה חלקים: 1) התבוננות היווצרות תבנית בפראי-סוג תודרנית עוברי באמצעות מיקרוסקופ DIC; 2) אפיון של העובר דפוס היווצרות דרך התבוננות סמן ביטוי חלבון באמצעות לייזר קונפוקלי סורק מיקרוסקופ; ו 3) קביעת התפקיד של גן מסוים ב מופרה (באמצעות המוטציה naa10 בתור דוגמה).
1. ביצית סליקה
<ol>
	<li>הכנת חומרים צמח הערה: פרוטוקול המתואר כאן הוא דוגמה על איך לגדל צמחים בריאים; דרכים אחרות כדי לגדל צמחים בריאים גם לעבוד.<ol>
		<li>להוסיף זרעים 100 צינור 1.5 mL, ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל של 1.5% נתרן תת-כלורי (mix 15 מ"ל של 10% כלור עם 85 מ ל מים) כדי לחטא הזרעים במשך 5 דק ' היפוך ' ברכבת התחתית מספר פעמים כדי להבטיח כי הזרעים ואת הפתרון מעורבב היטב כדי לחטא את הזרעים משטח לחלוטין.</li>
		<li>לכפות את הזרעים לתחתית הצינור על ידי צנטריפוגה ב-30 s-g 1,200 x, להסיר את תגובת שיקוע, ולשטוף את הזרעים במים סטריליים ארבע פעמים על ספסל כדי להסיר שאריות נתרן תת-כלורי.</li>
		<li>להוסיף 4.4 g של Murashige ו- Skoog (MS) תערובת מלח הבזליים ו- 10 גר' סוכרוז 1 ליטר של מים הנדסה גנטית. מערבבים את התערובת כדי להמיס את מלחי וסוכרוז. להתאים את פתרון ה-pH 5.8 עם 1 מ' KOH, להוסיף דור 3 של הסוכן ג'לי, כגון Phytagel, הפתרון MS-סוכרוז, לעקר את הפתרון ב 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות להפוך MS בינוני.</li>
		<li>יוצקים 30 מ של המדיום MS לתוך תבשיל תרבות 12 ס מ כדי ליצור לוחות בינוני MS.</li>
		<li>מקם את הזרעים סטיריליים בצלחת MS. להעביר את הצלחת אל. התא צמיחה ולשמור את הצלחת בתנאים היום (22 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות האור, 18 ° C עבור 8 שעות בחושך) לאחר ריבוד זרע (3 ימים ב 4 ° C בחושך).</li>
		<li>לאחר 8 ימים של צמיחה, להעביר את הצמחים בקרקע (תערובת אדמה עשירות, ורמיקוליט ביחס של 1:1) מגש, מכסים את המגש עם מכסה לבן, שקוף 5 ימים למנוע אובדן מים, יש מספיק כדי להימנע ויטריפיקציה של הצמחים.</li>
		<li>הרם את המכסה המגש ולטפח את הצמחים בתוך תא ותא בתנאים יום ארוך (ראה 1.1.5). להדליק את האור בשעה 6 בבוקר לסירוגין בשעה 10 בערב. לאחר כ 20 ימים של גידול תא ותא, הצמחים פרחונית, המיוצר siliques.</li>
		<li>מארק פקעי עם חוט במיקום של הזרע עוקב אחרי ב התפרחת בשעה 8 בערב (אל תשתמש הראשון עד השלישי פקעי; siliques שנוצר מתוך אלה פרוח ניצנים בדרך כלל לפתח כמה זרעים מופלים, ואת זה עשוי לשנות את הפרופורציה של הנורמה כדי ovules לא תקין). הגדר תחילתו של האבקת להפרייה כמו ניצן מסומן נפתח פרח בשעה 8:00 בבוקר למחרת.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>הכנה של הפתרון של שותפה עסקית
	<ol>
		<li>להוסיף 24 גר' קלוראל-הידרייט שפופרת 50-mL, לעטוף את הצינור לחלוטין עם רדיד אלומיניום (פתרונות של קלוראל-הידרייט אינם יציבים תחת אור).</li>
		<li>בשלב הבא, להוסיף 9 מ של מים הנדסה גנטית ו- 3 מ"ל של גליצרול הפתרון ומנערים את הצינור כדי להמיס את קלוראל-הידרייט. כדי להפוך את הפתרון של שותפה עסקית, תן את הצינור לעמוד במשך הלילה בטמפרטורת החדר לחסל בועות.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>סיווג והגליונות ביצית
	<ol>
		<li>צרף פיסת סקוטש דו צדדי לשקופית זכוכית מיקרוסקופ. המקום של silique גדל במשך מספר ימים לאחר ההאבקה (DAP) על השקופית עם pseudoseptum בניצב למשטח; הרצוי זה יהיה קל. לפצל את carpels (דמויות 1A ו 1B).</li>
		<li>לפצל את carpels משני צידי pseudoseptum עם מחט מזרק ולצרף את carpels גזור שני לשקופית, כך ovules, silique גלויים תחת סטריאוסקופ (דמויות 1C וד' 1).</li>
		<li>לוותר על µL 70 בפתרון של שותפה עסקית על גבי השקופית זכוכית ולאחר מכן להרטיב את קצה זוג מלקחיים שקצהו בסדר עם הפתרון של שותפה עסקית על ידי טבילה. באמצעות את סטריאוסקופ, להזיז את ovules לתוך הפתרון של שותפה עסקית בשקופית עם הפינצטה לנקות את העוברים. להחיל את coverslip של השקופית בעדינות כדי למנוע יצירת בועות.</li>
		<li>לשים את השקופית סיים לתוך תיבת בחדר חשוך עבור h 2-12 (מפותח יותר ביצית הוא, יהיה צורך זמן רב יותר) בטמפרטורת החדר. יכול להיות שנצפו העוברים בשלב 2/4 תאים (1-2 DAP) ברמה המיקרוסקופית לאחר 2 h, בעוד העוברים בין octant לבין בשלבים המוקדמים הכדוריים (3 DAP) יכול להיות שנצפו לאחר 4 שעות. יכול להיות שנצפו עוברי בוגרים יותר (4-8 DAP) לאחר 12 שעות.</li>
		<li>לבחון את ovules שנוקה באמצעות הפונקציה DIC של מיקרוסקופ. לאתר את העוברים תחת שדה צריכת חשמל נמוכה (10 X) ולאחר מכן שנה לשדה ובעוצמת (100 X שמן טבילה עדשה) כדי לבחון את דפוס הסלולר של העוברים מפותחת.</li>
		<li>לבחון את העוברים בשלבים התפתחותיים שונים.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. אפיון של העובר המתבנת וזהות התא באמצעות התבוננות סמן ביטוי חלבון
<ol>
	<li>הכנה של חומרים צמח
	<ol>
		<li>שיבוט האמרגן וקידוד רצף של סמן גנטי או הורמון התגובה יסוד, ואז הפתיל זה עם חלבון פלואורסצנטי (כגון GFP); לאחר מכן, הכנס הבונה הווקטור בינארי (כגון pCambia1300). כאן, הרכיב התגובה אוקסין DR5 מוצג בדוגמה10.</li>
		<li>להציג את פלסמיד DR5-GFP שנוצר לתוך פראי-סוג הצמחים מאת Agrobacterium tumefaciens-מתווכת טרנספורמציה11. בחר את הצמחים T1 באמצעות MS צלחות בינוניות המכילים hygromycin (50 מ"ג/מ"ל של אמא ליקר, מדולל 1:1, 000). הצמחים הטרנסגניים התערוכה שורשים ארוכים וצור שני עלים רוזט לאחר 8 ימים של גידול בתנאים המתוארים 1.1.5.</li>
		<li>להעביר את הצמחים הטרנסגניים אדמה ולטפח אותם כמצוין 1.1.6 ו 1.1.7.</li>
		<li>לאסוף את הזרעים T2 הקווים T1 עצמאית. לזרוע את הזרעים על צלחות MS-hygromycin, בחר את הצמחים נושאת עותק אחד של ההכנסה DR5-GFP (היחס בין צמחים עמידים צמחים רגישים יהיו בערך 3:1) ולאחר להעביר אותם באדמה.</li>
		<li>לטפח את הצמחים T2 כמצוין 1.1.6 ו 1.1.7.</li>
		<li>לאסוף את הזרעים T3 הצמחים T2. לזרוע את הזרעים על צלחות MS-hygromycin, בחר את הצמחים הטרנסגניים homozygous (כל הצמחים מקו אחד תערוכת hygromycin ההתנגדות) ולאחר להעביר אותם באדמה.</li>
		<li>סמן את ניצני פרחים וצמחים T3 homozygous כפי שמעידה 1.1.8.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>GFP אות התצפית
	<ol>
		<li>מערבבים 3 מ"ל של גליצרול עם 47 מ ל מים הנדסה גנטית כדי ליצור פתרון גליצרול 6%.</li>
		<li>צרף פיסת סקוטש דו צדדי לשקופית מיקרוסקופ זכוכית ולתקן silique כפי שמעידה 1.3.1.</li>
		<li>לפצל את carpels משני צידי pseudoseptum עם מחט מזרק, לצרף את carpels גזור שני השקופית תחת סטריאוסקופ כפי שמעידה 1.3.2.</li>
		<li>לוותר על 30 µL של 6% גליצרול אותן לשקופית זכוכית ומניחים כולן ovules מן carpels גזור לתוך הפתרון באמצעות פינצטה שקצהו פיין. במקום של coverslip על השקופית בעדינות.</li>
		<li>כמו המעיל הזרע ואת האנדוספרם של כל ביצית יכול למנוע את ההתבוננות GFP אותות של העובר, לחלץ את העובר להפרייה. הקש על השקופית במהירות ובעדינות כדי הבלטת העובר מתוך ביצית (מפותח יותר ביצית היא, הכוח פחות צריך להיות מוחל על השקופית).</li>
		<li>לבחון את השקופית עבור זריחה GFP באמצעות סריקת מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי. למצוא את העוברים מבודד תחת שדה צריכת חשמל נמוכה (10 X), להקליט את מיקומם ולאחר מכן לשנות שדה ובעוצמת (100 X שמן טבילה עדשה) כדי לצפות DR5-GFP ביטוי העוברים על-ידי הגדרת מקור האור עירור 488 ננומטר לגילוי של אות ה-GFP.</li>
		<li>לזהות את הביטוי GFP העוברים כדי לבחור את שורת T3 מתאימים לצורך ניתוח נוסף.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. אפיון של העובר דפוס-צורה מוטציה קטלני העובר דרך סיווג ביצית והתבוננות החלבון הסמן: Naa10 כדוגמה
<ol>
	<li>העובר המתבנת בצמחים מוטציה naa10
	<ol>
		<li>הכנת החומרים צמח כמצוין ב- 1.1.1-1.1.7.</li>
		<li>לזהות את naa10+ − צמחים על-ידי ה-PCR באמצעות גנים ספציפיים תחל5ולאחר מכן מארק פקעי של לאמילי10+ − צמחים כפי שמעידה 1.1.8.</li>
		<li>ביצית אישור לבצע בבדיקה מיקרוסקופית של לאמילי10+ − עוברי כמצוין ב- 1.2, 1.3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>סמן חלבון ניתוח באמצעות naa10 עוברי
	<ol>
		<li>להשיג מתאימים DR5-GFP הטרנסגניים קווים באמצעות ההליך שמתואר 2.1-2.2.</li>
		<li>לחצות קו homozygous DR5-GFP הטרנסגניים עם לאמילי10+ − המפעל להשיג לאמילי10/ − צמחים נמצאים homozygous של דה מרקר פלורסצנטיות GFP הדור F2 (המזוהה על ידי גנים ספציפיים PCR) כדי לאפיין naa10+ / −5 ולבחון את האות ה-GFP תחת מיקרוסקופ באמצעות קו DR5-GFP homozygous.</li>
		<li>לסמן את ניצני פרחים של לאמילי10+ − צמחים homozygous עבור DR5-GFP כפי שמעידה 2.1.7.</li>
		<li>לחפש האות ה-GFP ב עוברי naa10 כי הם homozygous על DR5-GFP כמצוין ב- 2.2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Jenik, P. D., Gillmor, C. S., Lukowitz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+patterning+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic patterning in Arabidopsis thaliana.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 207-236 (2007).</li>
<li>Lau, S., Slane, D., Herud, O., Kong, J., Jurgens, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+embryogenesis+in+flowering+plants%3A+setting+up+the+basic+body+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Early embryogenesis in flowering plants: setting up the basic body pattern.</a> Annu Rev Plant Biol. 63, 483-506 (2012).</li>
<li>Wendrich, J. R., Weijers, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+embryo+as+a+miniature+morphogenesis+model%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis embryo as a miniature morphogenesis model.</a> New Phytol. 199 (1), 14-25 (2013).</li>
<li>ten Hove, C. A., Lu, K. J., Weijers, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+plant%3A+cell+fate+specification+in+the+early+Arabidopsis+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Building a plant: cell fate specification in the early Arabidopsis embryo.</a> Development. 142 (3), 420-430 (2015).</li>
<li>Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+N-terminal+acetylation+is+required+for+embryogenesis+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Protein N-terminal acetylation is required for embryogenesis in Arabidopsis.</a> J Exp Bot. 67 (15), 4779-4789 (2016).</li>
<li>Berleth, T., Jurgens, G. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/trends/genetics/abstract/0168-9525(93)90246-E">The role of the monopteros gene in organising the basal body region of the Arabidopsis embryo.</a> Development. 118, 575-587 (1993).</li>
<li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((D-myo-inositol-3-phosphate+affects+phosphatidylinositol-mediated+endomembrane+function+in+Arabidopsis+and+is+essential+for+auxin-regulated+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">D-myo-inositol-3-phosphate affects phosphatidylinositol-mediated endomembrane function in Arabidopsis and is essential for auxin-regulated embryogenesis.</a> Plant Cell. 23 (4), 1352-1372 (2011).</li>
<li>Nodine, M. D., Yadegari, R., Tax, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RPK1+and+TOAD2+are+two+receptor-like+kinases+redundantly+required+for+Arabidopsis+embryonic+pattern+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">RPK1 and TOAD2 are two receptor-like kinases redundantly required for Arabidopsis embryonic pattern formation.</a> Dev Cell. 12 (6), 943-956 (2007).</li>
<li>Ulmasov, T., Murfett, J., Hagen, G., Guilfoyle, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aux%2FIAA+proteins+repress+expression+of+reporter+genes+containing+natural+and+highly+active+synthetic+auxin+response+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Aux/IAA proteins repress expression of reporter genes containing natural and highly active synthetic auxin response elements.</a> Plant Cell. 9 (11), 1963-1971 (1997).</li>
<li>Friml, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efflux-dependent+auxin+gradients+establish+the+apical-basal+axis+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Efflux-dependent auxin gradients establish the apical-basal axis of Arabidopsis.</a> Nature. 426 (6963), 147-153 (2003).</li>
<li>Clough, S. J., Bent, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Floral+dip%3A+a+simplified+method+for+Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.</a> Plant J. 16 (16), 735-743 (1998).</li>
<li>Fiume, E., Fletcher, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Arabidopsis+embryo+and+endosperm+development+by+the+polypeptide+signaling+molecule+CLE8%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of Arabidopsis embryo and endosperm development by the polypeptide signaling molecule CLE8.</a> Plant Cell. 24 (3), 1000-1012 (2012).</li>
<li>Jurkuta, R. J., Kaplinsky, N. J., Spindel, J. E., Barton, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partitioning+the+apical+domain+of+the+Arabidopsis+embryo+requires+the+BOBBER1+NudC+domain+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Partitioning the apical domain of the Arabidopsis embryo requires the BOBBER1 NudC domain protein.</a> Plant Cell. 21 (21), 1957-1971 (2009).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

סיווג ביצית היא שיטה שימושית עבור חלוקת התאים ולהתאושש להערכת המורפולוגיה במהלך מופרה ב תודרנית; בעזרת טכניקה זו, העוברים יכול להיות שנצפו ישירות מתחת DIC מיקרוסקופ5,12. השלב הקריטי לאישור ביצית היא צעד 1.3.4. הזמן הנדרש לאישור ביצית בשלב 1.3.4 הוא משתנה. העוברים בשלב 2/4 תאים ניתן בבירור לראות לאחר 2 h בפתרון של שותפה עסקית, ואילו הם נראים לא ברור לאחר 12 שעות. לכן, מפותח יותר ביצית הוא, ככל הזמן הנדרש לאישור.
בשלב 2.2.5, לבו...

מופרה הוא האירוע המוקדם ביותר בהתפתחות הצמח גבוה יותר. טפסים העובר בוגר מ זיגוטה דרך חלוקת התא ובידול תחת בקרת גנטי קפדנית1,2. תודרנית העוברים הם מודל שימושי ללמוד את השליטה מורפוגנזה כי הרצף של חלוקות תאים במהלך מופרה עוקב אחר3,דפוס הצפויות4. אולם, העובר תודרנית המכיל מספר תאים אחד הוא קטן מדי כדי להיות שנצפו וניתח. בנוסף, המוטציה של גנים מסוימים יכולים לגרום העובר lethality5, המציינת את התפקיד של הגנים האלה ב מופרה. האפיון של דפוס-צורה מוטנטים קטלניים העובר מספק בסיס להבנת המנגנון המולקולרי לפיה גנים חיוניים לווסת את התפתחות העובר.
שיטה מפורטת מתואר כאן על האפיון של היווצרות העובר דפוס בצמח דגם תודרנית באמצעות התבוננות מיקרוסקופית ישירה. השיטה כוללת סיווג ביצית ואחריו התצפית מיקרוסקופיים של העובר. אפיון מוטנטים קטלניים העובר גם מתואר.
המורפולוגיה של עוברי בשלבים התפתחותיים שונים יכול להיקבע ישירות על ידי מיקרוסקופ באמצעות ovules זה נוקו עם שותפה עסקית של פתרון6,7. כזה ovules התערוכה של השבירה הגבוה במדד; לכן, זה ביצית ניקוי בשיטה הוא מועיל במיוחד דגימות שאינן יש להקפיד על ידי מיקרוסקופ ניגודיות (DIC) התערבות דיפרנציאלית.
בנוסף, הגנים מבוטאים לתא מסוים או במספר מצומצם של תאים במהלך מופרה יכול לשמש סמנים לזיהוי תאי העובר. לכן, יכול להיות מבואר המפרט זהות תא במהלך מופרה על-ידי ניטור הביטוי של חלבונים מתויג GFP סמן באמצעות סריקת מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי. לעומת זאת, התבוננות למשמעות הביטוי גן פונקציונלי unknown -GFP פיוז'ן במהלך מופרה יכול מספקים קישור בין העובר המתבנת הביטוי של הגן הזה, להקל על זיהוי גנים חדשים הדרושים מופרה ב תודרנית.
השיטה המתוארת כאן יכול לשמש גם כדי לאפיין את פנוטיפ של מוטציה העובר-קטלני, וכדי לקבוע את ההשפעה של הגן המושפעים על מופרה ברמה התאית. יתר על כן, בשילוב עם השוואה של התבנית ביטוי של גנים סמן במהלך מופרה בין הצמחים פראי-סוג של מוטציה, השיטה ניתן תשואות רמזים אודות המנגנונים המולקולריים המעורבים מופרה8,9. אכן, השיטה היה מוחל על צמחים naa10 , התברר כי החלוקה לא נורמלי של hypophysis ב החשבונאי שעלול להיגרם שינוי בחלוקת אוקסין במהלך מופרה5.

<table><tbody><tr><td>Chloral Hydrate</td><td>Sigma</td><td>15307</td><td></td></tr><tr><td>Murashige and Skoog Basal Medium</td><td>Sigma</td><td>M5519</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin</td><td>Roche</td><td>10843555001</td><td></td></tr><tr><td>תא גידול</td><td>Percival</td><td>CU36L5</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>Zeiss Oberkochen</td><td>Zeiss Image M2</td><td>מצלמה: AxioCam 506 צבע</td></tr><tr><td>סריקת לייזר קונפוקלית מיקרוסקופיה</td><td>Zeiss Oberkochen</td><td>Zeiss LSM 5</td><td>מסננים: BP 495 - 555 ננומטר</td></tr><tr><td>סטריאוסקופ</td><td>Zeiss Oberkochen</td><td>Axio Zoom V16</td><td>מצלמה: AxioCam MRc5</td></tr><tr><td>אדמה עשירה בחומרים מזינים</td><td>KLASMANN, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צינור 50 מ"ל</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צינור 1.5 מ"ל</td><td>קורנינג בע"מ</td><td></td><td></td></tr><tr>תמיסת <td></td><td></td><td>נתרן היפוכלוריט 10%</td><td>מגיב אנליטי</td></tr><tr><td>ביתי סוכרוז</td><td></td><td></td><td>מגיב אנליטי ביתי</td></tr><tr><td>KOH</td><td></td><td></td><td>מגיב אנליטי ביתי</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td></td><td></td> צלחת <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>תרבית</td> ריאגנט אנליטי ביתי <td>אספקה ביתית</td></tr><tr><td>ורמיקוליט</td><td></td><td></td><td>ציוד ביתי</td></tr><tr><td>זכוכית שקופיות</td><td></td><td></td><td>ציוד ביתי</td></tr><tr><td>מחט</td><td></td><td></td> מזרק <td>ציוד ביתי</td></tr><tr><td>פינצטה</td><td></td><td></td> עדינה <td>ציוד ביתי</td></tr><tr><td>ספסל</td><td></td><td></td> סופר נקי <td>ציוד ביתי</td></tr></tbody></table>

שיטת אפיון מופרה ב תודרנית

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

בהתחשב באופי מאוד לחיזוי ההתפתחות שלהם, העוברים תודרנית שימשו כמודל ללימודי של מורפוגנזה בצמחים. עם זאת, עוברים בשלב מוקדם של הצמח הבמה הם קטנים ומכילים כמה תאים, שהופך אותם קשה להתבונן ולנתח. שיטה מתואר כאן על אפיון הדפוס-צורה צמח העוברים תחת מיקרוסקופ באמצעות האורגניזם דגם תודרנית. בעקבות פינוי של טרי ovules באמצעות הפתרון של שותפה עסקית, יכול להיות שנצפו תא במספר של המורפולוגיה של העוברים ולאחר השלב ההתפתחותי שלהם יכול להיקבע על ידי התערבות דיפרנציאלית ניגודיות מיקרוסקופ באמצעות 100 X עדשה טבילה שמן. בנוסף, הביטוי של חלבונים ספציפיים סמן מתויג עם ירוק ניאון חלבון (GFP) נוטרה כדי להוסיף ביאורים תא מפרט זהות במהלך המתבנת העובר על ידי סריקת מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי. לכן, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לצפות דפוס-צורה פראי-סוג צמח עוברי ברמות תאית ומולקולרית, לאפיין את התפקיד של גנים ספציפיים בהמתבנת העובר על-ידי השוואת צורה דפוס העוברים בין פראי-סוג צמחים מוטנטים קטלניים העובר. לכן, השיטה ניתן לאפיין מופרה ב תודרנית.

השיטה המתוארת במאמר זה יכול לשמש כדי להתבונן מופרה ישירות תחת מיקרוסקופ, ביאור המפרט את הזהות תא במהלך מופרה עם סמנים ספציפי לאפיין את התפקיד של גן מסוים במהלך מופרה.
נציג תוצאות הניתוח של העובר תכנים (החל משלב זיגוטה מוארך לבמה מקל ההליכה בוגרת) פראי-סוג תודרנית מוצגים באיור2. לאחר אישור ביצית, העוברים בשלבים התפתחותיים שונים יכולה להיות מאופיינת DIC מיקרוסקופ (איור 2<...

פרוטוקול זה מתאר שיטת התבוננות מופרה ב תודרנית באמצעות סיווג ביצית ואחריו את הבדיקה של היווצרות תבנית העובר תחת מיקרוסקופ.

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

המטרה הכללית של שיטה זו היא לאפיין את היווצרות התבנית שלו של העובר במהלך העבירה של צמחים באמצעות אורגניזם מודל. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הצמחים, כגון עבירה ב-Arabidopsis. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לאפיין את היווצרות התבנית של העובר בצמח המודל Arabidopsis באמצעות הפעולה המומלצת.מדגים את הפרוצדורה הוא Jinlin Feng, סטודנט לתואר מתקדם מהמעבדה שלי. כדי להתחיל בפרוצדורה זו, העבירו 100 seeds למבחנה של 1.5 milliliter. הוסיפו one milliliter של sodium hypochlorite כדי לעקר את ה-seeds.הפוך את המבחנה מספר פעמים כדי להבטיח שהזרעים והתמיסה מעורבבים היטב. לאחר חמש דקות, סבב את המבחנה בצנטריפוגה ב-1200 Gs למשך 30 שניות. הסר את הנוזל העליון (supernatant) ושטוף את הזרעים במים סטריליים ארבע פעמים כדי להסיר שאריות של נתרבן (sodium hypochlorite).בשלב הבא, הוסיפו 4.4 גרם של תערובת מלחים בסיסית MS ו-10 גרם סוכרוז לליטר אחד של מים אולטרה-טהורים. ערבבו כדי להמיס את המלח והסוכרוז. בעזרת פוטשום הידרוקסיד בריכוז 1 mol, התאימו את ה-pH של התמיסה ל-5.8.לאחר מכן, הוסיפו שלושה גרמים של חומר גלקטין ועקרו את התמיסה בטמפרטורה של 121 °C למשך 15 דקות. שפכו 30 milliliters של מצע MS שהתקבל לתוך צלחת תרבית של 12 סנטימטרים. הניחו את הגרעימים שעקרו על פלטת ה-MS.העבירו את הפיתח למקרר, ושמרו אותו בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס בחושך במשך שלושה ימים לצורך סטרטיפיקציה של הזרעים. לאחר מכן, שמרו את הפיתח בתא גידול בתנאי יום ארוך למשך שמונה ימים. לאחר מכן, העבירו את הצמחים לאדמה במגש.כסו את המגש במכסה לבן ושקוף כדי למנוע איבוד מים. השאירו מרווח קטן כדי למנוע ויטריפיקציה של הצמחים. לאחר חמישה ימים, הסירו את המכסה וגדלו את הצמחים בתא גידול (walk-in chamber) בתנאי יום ארוך.לאחר כ-20 ימי צמיחה, השתמש בחוט כדי לסמן 10 עד 15 ניצני פרחים במיקום של גבעולי הזרעים והתפרחת בשעה 20:00. הגדר את תחילת ההאבקה של הלולאות כאשר הניצנים המסומנים נפתחים לפרחה בשעה 8:00 למחרת בבוקר. כדי להתחיל בהכנת תמיסת Hoyer, הוסף 24 גרם של chlorhydrate לשפופרת של 50 מיליליטר. עטוף את השפופרת לחלוטין בנייר אלומיניום, וודא שהנייר חוסם את כל האור.הוסיפו תשעה מיליליטרים של מים אולטרה-טהורים ושלושה מיליליטרים של גליקרול. נערו את המבחנה כדי להמיס את הכלורהידראט. לאחר מכן, השאירו את תמיסת הוייר (Hoyer's solution) שהוכנה למשך לילה בטמפרטורת החדר כדי להעלים בועות אוויר.ראשית, הצמידו חתיכת סרט דבק דו-צדדי לעגלה של מיקרוסקופ. הניחו סיליקווה (silique), שגדלה למספר הימים הרצוי לאחר ההאבקה, כאשר הצד עם הפסאודו-ספטום (pseudoseptum) ניצב לפני השטח. באמצעות מחט של מזרק, הפרידו את הקרפלים משני צדי הפסאודו-ספטום.לאחר מכן, הצמידו את שני עצמי הקרפליס המנוסחים למשטח הזכוכית כך שהמסנניות והתירס יהיו גלויים תחת סטראיאוסקופ. טפטפו 70 µL של תמיסת Hoyer על משטח הזכוכית. לאחר מכן, טבלו פינצטה בעלת קצה דק בתמיסה כדי להרטיב את הקצה.בעזרת הסטראוסקופ ופינצטה, העבירו את הפוליקולות לתוך תמיסת Hoyer כדי לנקות את העוברים. לאחר מכן, הניחו בעדינות זכוכית כיסוי על השקופית, תוך כדי הקפדה על מניעת היווצרות בועות. הניחו את השקופית המוכנה בתוך קופסה בחדר חשוך למשך שעתיים עד 12 שעות בטמפרטורת החדר.לאחר שחלף הזמן הדרוש, השתמשו בפונקציית ה-DIC של המיקרוסקופ כדי לבחון את הלולאות ששקפו. אתרו את העובריים תחת שדה ראייה בהגדלה נמוכה, ולאחר מכן עברו לשדה ראייה בהגדלה גבוהה כדי לצפות בדפוס התאי בעובריים המפותחים. לאחר מכן, בחנו את העובריים בשלבים התפתחותיים שונים.ראשית, הכינו את פלסמיד DR5 GFP והחדירו אותו לצמחים מסוג הבר (wild-type) באמצעות טרנספורמציה המתווכת אגרובקטריום (agrobacterium) כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. בצעו סלקציה לצמחי T1 באמצעות מצע MS המכיל הידרוליזין. לאחר מכן, העבירו וגדלו את הצמחים כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט כדי לקבל צמחי T3.באמצעות חוט, סמנו את ניצני הפרחים של צמח ה-T3 ההומוזיגוט במיקום גבעולי הזרעים בתשבלה בשעה 20:00. לאחר מכן, ערבבו שלושה מיליליטר של glycerol עם 47 מיליליטר של מים אולטרה-טהורים כדי להכין תמיסת glycerol בריכוז 6%. לאחר מכן, הדביקו חתיכה של סרט דביק דו-צדדי לעששית מיקרוסקופ. הניחו silique של צמח T3 על העששית כאשר ה-pseudoseptum ניצב לפני השטח.באמצעות מחט של מזרק, הפר את הקרפלים משני צדי הפסאודו-ספטום (מעיית דמה). הצמד את שני הקרפלים המופרדים לזכוכית העצירה כך שהביצורים והסילקווה (תרמיל) יהיו גלויים תחת סטראוסקופ. לאחר מכן, טפטף 30 µL של 6% glycerol על זכוכית העצירה.טבול זוג פינצטות בעלות קצה דק לתוך התמיסה כדי להרטיב את הקצה. באמצעות הסטראיאוסקופ והפינצטות, העבר את הלולאות למסך הגליצרול. הנח בעדינות זכוכית כיסוי על השקופית.לאחר מכן, הקישו במהירות ובעדינות על השקופית כדי להוציא אתו את העובר מהלולח. לאחר מכן, השתמשו במיקרוסקופיה קונפוקלית עם סריקה בלייזר כדי לבחון את השקופית עבור פלואורסצנציה של חלבון פלואורסצנטי ירוק. אתרו את העוברים המבודדים תחת שדה במיגדילה נמוכה, ורשמו את מיקומם.עברו לשדה ראייה בהגדלה גבוהה והגדירו את מקור אור העירור ל-488 nanometers כדי לצפות בביטוי של GR5 GFP בעוברים. לאחר מכן, גלו את ביטוי ה-GFP ואפיינו את תהליך היווצרות התבנית של העובר כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. במחקר זה, ניתן לצפות באמבריוגנזה ב-Arabidopsis באמצעות שקיפות של הלוליינות (ovule clearance), כפי שניתן לראות.לאחר פינוי הלוליינות, ניתן להבחין בעוברי השלבים ההתפתחותיים השונים באמצעות מיקרוסקופיית ניגוד הפרעה דיפרנציאלית (DIC). תבנית הביטוי של GR5 GFP במהלך העוברנות נדגמה לאחר מכן תחת מיקרוסקופיית סריקה בלייזר קונפוקלית. ניתן לראות כי DR5 מובע בקוטב השורש של עוברים גלובולריים ובצורת לב מסוג הטיפוס הפראי.ניתן לראות את ביטויו של DR5 בקצות הקוטילדונים העובריים, ובמערכת כלי ההובלה של עוברים בוגרים מסוג בר. לאחר מכן, נבחן תפקידו של naa10 ב-Arabidopsis במהלך האמ בריוגנזה. ההיפותזה שנדגמה הראתה חלוקה לא תקינה, עם חלוקה עקומה ואנכית ב-naa10 בהשוואה לחלוקה אסימטרית רוחבית בצמחים מסוג בר.כפי שניתן לראות כאן, ל-oxen יש התפלגות אחידה כמעט בכל עוברים של naa10 בשלב הגוביילי (globular stage), והוא שומר על אות רחב יותר בהשוואה לעוברים מסוג הבר (wild-type). תוצאות אלו מעידות על כך ש-naa10 נחוץ לאמבריוגנזה, וכי הוא עשוי להיות מעורב באמצעות נתיב השליח oxen ב-Arabidopsis. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כיצד לגדל Arabidopsis כחומר צמחי.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע מדדים נוספים כגון היברידיזציה in-situ על מנת לענות על שאלות נוספות, כגון ביטוי של גנים ספציפיים לתא. לאחר פיתחו, סלל טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום האמבריוגנזה לחקור את המנגנון המולקולרי שבאמצעותו גנים ספציפיים מתווכים את האמבריוגנזה ב-Arabidopsis. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של האופן שבו ניתן לאפיין אמבריוגנזה ב-Arabidopsis.

a-method-for-characterizing-embryogenesis-in-arabidopsis

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

אנו מתארים פרוטוקול באמצעות שקופיות קאמריות ותקשורת כדי לשתק פסיגי צמחים עבור הדמית confocal של האפידרמיס על פני כמה ימים של פיתוח, המתעד את בידול הפיוניות. חלבוני fluorophore מתויג-ניתן לעקוב באופן דינמי על ידי ביטוי ולוקליזציה subcellular, להגביר את ההבנה של התפקידים האפשריים שלהם במהלך חלוקת תאים והתמיינות תאים מסוג.

לטווח ארוך הדמיה, ברזולוציה גבוהה Confocal זמן פקיעה של<em&gt; טבורית ארבידופסיס</em&gt; אפידרמיס במהלך הנביטה

אנו מדווחים שיטה יעילה ופשוטה לבודד את העוברים בשלבים מוקדמים של פיתוח...

בידוד יעיל ומהיר של עוברים משלבים מוקדמים<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; זרעים

אנו מציגים את ההליך כדי להרכיב assay זרע מצעי מעיל (SCBA) מזרעי thaliana ארבידופסיס. SCBA הוצג להיות כלי רב עוצמה כדי לחקור מבחינה גנטית ובמבחנה כיצד נביטת זרעי פקדי האנדוספרם בזרעים רדומים ובתגובה לאותות אור. SCBA הוא בעיקרון ישים בכל מצב שבו האנדוספרם חשוד להשפיע על צמיחה עוברית.

מעיל זרע מצעים Assay לחקור גנטי<em&gt; במבחנה</em&gt; כיצד נביטת זרעי בקרת האנדוספרם ב<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em

אנו מספקים כאן פרוטוקול יעיל ואמין עבור immunostaining, הקרינה הכלאה באתר, מכתים DNA ואחרי הדמיה בביציות thaliana ארבידופסיס כל הר כמותיים, ברזולוציה גבוהה. שיטה זו השתמשה בהצלחה כדי לנתח שינויי הכרומטין ואדריכלות גרעינית.

שיטה יעילה לניתוח כמותי, תא בודד של הכרומטין שינוי ואדריכלות גרעינית בהר שלם-ביציות ב<em&gt; ארבידופסיס</em

המטרה היא להמחיש שניתן להשתמש בקלות במודל הקטניות Medicago truncatula כדי לחקור את הוויסות של עובריות צמחים מוקדמות כדי להשלים את מודל ה-Arabidopsis שאינו קטניות. מורפולוגיה של תרמילים קשורה לשלבי אמבריוגנזה זיגוטית ומסופק גם פרוטוקול לאיסוף עוברים באמצעות תרבית רקמה.

פרוטוקולים לקבלת Zygotic וסומטי עוברים ללימוד תקנה של פיתוח העובר מוקדם בקטניות הדגם<em&gt; Medicago truncatula</em

הדמיה confocal לחיות מספק לביולוגים עם כלי רב עוצמה כדי ללמוד פיתוח. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור הדמית confocal לחיות לפתח פרחים ארבידופסיס.

חי Confocal הדמיה של פיתוח פרחים ארבידופסיס

כתב יד זה מתאר במבחנה ביצית טיפוח שיטה המאפשרת הדמיה לחיות תאים של תודרנית מופרות, העוברים. בשיטה זו הוא מנוצל כדי להמחיש את הדינמיקה תאיים במהלך זיגוטה קיטוב מפרט הגורל תא בפיתוח עוברי.

במבחנה ביצית טיפוח עבור Live-תא הדמיה של הזיגוטה קיטוב והמתבנת העובר ב תודרנית לבנה

אנו מדגימים שיטה לקביעת הפריה מוצלחת או כושלת שנכשלה על בסיס מורפולוגיה גרעינית של הזרע בערידרופזיס הפריה כפולה באמצעות מיקרוסקופ אפיפייתי.

הערכה של מדינת הדישון באמצעות מורפולוגיה גרעינית של הזרע בערידופזיס הפריה כפולה

עבודה זו מתארת פרוטוקול של תפוקה חצי-גבוהה המאפשרת הדמיה בו של embryogenesis בזמן בו במהירות של 80-100 ס מ עוברים בריצה אחת ללילה. בנוסף, כלי עיבוד תמונה ופריטים חזותיים נכללים כדי לייעל את ניתוח הנתונים. השילוב של שיטות אלה עם זני כתבת מותאמים אישית מאפשר ניטור מפורט של embryogenesis.

שיטת דימות למחצה של תפוקה גבוהה וערכת כלי הדמיה של נתונים כדי לנתח את הפיתוח העובריים של ס. אלאנס

מאמר זה מתאר שתי שיטות פנוטיפ ללא שימוש בקליפות אפידרמיס כדי לאפיין את הגנים השולטים בהתפתחות הסטומטלית. השיטה הראשונה מדגימה כיצד לנתח פנוטיפ סטומטלי באמצעות אפידרמיס צמחי מוכתם O כחול טולוידין. השיטה השנייה מתארת כיצד לזהות ליגנדות סטומטיות ולנטר את פעילותן הביולוגית.

זיהוי הגנים המעורבים בהתפתחות סטומאטלית באמצעות ניקוד פנוטיפ אפידרמלי

במאמר זה אנו מתארים כלי מתקדם המיועד לניטור ביוסינתזה של כלורופיל בשלבים המוקדמים של דה-אטיולציה של שתילי ארבידופסיס . המתודולוגיה החדשנית מספקת דימות פלואורסצנטי כלורופיל לא פולשני בזמן אמת ברזולוציה מרחבית וטמפורלית גבוהה.

בדיקה לא פולשנית לביוסינתזה של כלורופיל קביעת קינטיקה בשלבים מוקדמים של דה-אטיולציה של ארבידופסיס

למד שיטת אפיון מופרה ב-Arabidopsis באמצעות מיקרוסקופיית DIC ו-GFP. הפרוטוקול מאפשר ניתוח מורפולוגיה עוברית, מספר תאים ותבניות ביטוי גנים בביולוגיה התפתחותית של צמחים.

שיטת אפיון מופרה ב תודרנית

גלה סרטונים נוספים