Name: במבחנה ביצית טיפוח עבור Live-תא הדמיה של הזיגוטה קיטוב והמתבנת העובר ב תודרנית לבנה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 41 s
Description: למדו שיטת טיפוח ביציות במבחנה לדימוי תאים חיים של זיגוטות ועוברים ב-Arabidopsis. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר דינמיקת הקיטוב והתבנית בעוברים ומספקת כלי עוצמתי לחקר תהליכי ההתפתחות הצמחית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מיקרוסקופ בעבודה זו נערך ב מכון של טרנספורמטיבי ביו-מולקולות (WPI-ITbM) של אוניברסיטת נאגויה ו נתמכת על ידי יפן מתקדמת צמח המדע רשת. עבודה זו נתמך על ידי מענקים של יפן ומדעי הטכנולוגיה סוכנות (ERATO פרוייקט תוצרת הארץ, M.U.) ומן החברה יפן הקידום של המדע: מענק הסיוע למחקר מדעי בתחומים חדשניים (Nos. JP24113514, JP26113710, JP15H05962 ו JP15H05955 M.U., Nos. JP16H06465, JP16H06464 ו JP16K21727 עבור T.H), מענק הסיוע מדענים ומפתחים צעירים (B, Nos. JP24770045 ו JP26840093 עבור M.U.), ואת מענק של הסיוע למחקר גישוש מאתגר (מס ' JP16K14753 על M.U.).

1. הכנה של המדיום תרבות חוץ גופית של ביצית <ol><li>הופכים את המדיום הנוזלי לתרבות ביצית הפרייה (&#34; N5T בינוני &#34;) המכילה 1 x Nitsch הבזליים תערובת, 5% (w/v) טרהלוז וגופרית והרכבו 0.05 % (w/v) 2-(N-מורפולינו) ethanesulfonic חומצה (MES)-קו (pH 5.8), ו- 1 x Gamborg &#39; פתרון ויטמין s.</li>
	<li>להתאים את ה-pH ל 5.8 עם קו-</li>
	<li>לחטא המדיום מאת autoclaving זה (121 מעלות צלזיוס, 20 דקות) או סינון זה דרך מסנן 0.22-מיקרומטר. 
	הערה: המדיום סטיריליים שניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2-3 חודשים.</li>
</ol> 2. הכנת המכשיר מערך Micropillar PDMS <ol><li>לחתוך את המכשיר micropillar PDMS על ידי סכין, גילוח או מספריים כדי להתאים לתוך החלק זכוכית (φ 14 מ מ) של צלחת זכוכית-התחתון 35 מ מ. 
	הערה: הנוהל המלא של הבנייה התקן PDMS מתואר ניירות הקודם 8 , 9, ולכן הפרטים מושמטים כאן. זכוכית-התחתון מנות עם אמצעי אחסון קטן יותר, כגון לוחות 4-ובכן או 96-ובכן, יכול לשמש עבור הדמיה לטווח קצר בלי המכשיר.</li>
	<li>Sterilize בחלק העליון של המכשיר PDMS תחת אור UV במשך 15 דקות</li>
	<li>הפעל את ההתקן PDMS ליד באמצעות פינצטה קצה מרובע, תשאיר את זה מתחת UV אור למשך 15 דקות לחטא התחתון.</li>
	<li>להעביר את המכשיר PDMS סטיריליים לתוך תבשיל תרבות 35 מ מ ולהוסיף המדיום N5T עד המכשיר לחלוטין טבולים המדיום (כ 5-7 מ"ל).</li>
	<li>לשים את הצלחת לתוך תא ואקום, ולהפחית את הלחץ דגה. לשמור על שואב אבק עבור h 3 ללון עד האוויר במכשיר מוחלף על-ידי מדיום. 
	הערה: המכשיר יכול להיות מנותק על ידי בועות אוויר תחת ואקום חזק.</li>
	<li>לקחת את המכשיר מתוך קערה על ידי החזקתה עם פינצטה קצה מרובע ושים אותו על מגבת נייר כדי להסיר את בינונית נוספת בצד ולמטה. 
	הערה: המדיום על המערך micropillar (משטח עליון) אין להסירו כי הוא ישמש לגידול ביצית.</li>
	<li>להעביר את המכשיר על גבי זכוכית שקופית 76 מ"מ x 26 מ"מ, המבטיח לשמור את החלק micropillar כמו הצד העליון, ולכסות את ההתקן עם 35 מ מ תרבות מאכל המכסה כדי למנוע המדיום ממנו להתייבש במהלך החילוץ ביצית הבאה.</li>
</ol> 3. Silique ניתוח והפקת ביצית <ol><li>לחטא מחט (0.40 מ מ G) עם פינצטה בסדר על ידי מנגב עם 70% אתנול. המחט מתבצע בקלות על ידי הצמדתו מקל מזרק או עץ.</li>
	<li>לבדוק את התפרחת של הצמח ובחר את siliques המתאים לניסוי. Siliques כ 5 מ מ מכילים מופרות, siliques 8-10 מ מ כולל צעירים העוברים הכדוריים.</li>
	<li>לסלק את siliques באמצעות פינצטה, ומניחים אותם על סרט הדבקה דו-צדדי על כוס שקופית 76 x 26 מ מ. אחד silique מכיל על 40-60 ovules, 3-4 siliques (כלומר, ovules 120-240) מספיקים עבור התקן אחד.</li>
	<li>פתח את silique (קיר השחלה) כדי לראות את ovules בתוך באמצעות מחט סטיריליים פינצטה תחת stereomicroscope. לחתוך רק את הקיר השחלה כך ovules אינן פגומות.</li>
	<li>להעביר את silique נפתח אל המדיום N5T במכשיר PDMS (להכין בשלב 2.7), ולשחרר את ovules לתוך האמצעי עם מחט או פינצטה.</li>
	<li>שמה כוס כיסוי קטן (18 מ מ x 18 מ"מ) על גבי המכשיר PDMS כדי לדחוף את ovules לתוך השטחים במערך micropillar.</li>
	<li>תוריד את הזכוכית המכסה על-ידי משיכתו אופקית באמצעות פינצטה או האצבעות כדי להסיר בינונית נוספת.</li>
	<li>הפוך את ההתקן PDMS למקם אותו לתוך צלחת זכוכית-התחתון 35 מ מ, מעט הקש את המכשיר על ידי דחיפת באמצעות את הפינצטה מרובע עצה בשביל להקל הזכוכית.</li>
	<li>בינוני N5T שופכים בעדינות לתוך הזכוכית-התחתון צלחת על ידי decanting הבקבוק בינונית עד המכשיר PDMS לחלוטין טבולים המדיום, לאטום את המנה עם סרט פרפין. 
	הערה: המכשיר PDMS ניתן למחזר, אך התקנים ישנים מדי מנותקים בקלות מהחלק התחתון זכוכית. בנוסף, המכשיר יכול לעוף אם זה לא הוא לחלוטין degassed בשלב 2.5 או המדיום הוא שפך מהר מדי.</li>
</ol> <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55975/55975fig2.jpg" /> איור 2: סכימטי נוהל הכנת הדוגמא. 
לזרימה סכמטית לשלבי 3.5 ל 4.1. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55975/55975fig2large.jpg" target="_blank"> אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
 4. time-lapse הדמיה <ol><li>למקם את המנה זכוכית-התחתון זה הוכן בשלב 3.9-מיקרוסקופ הפוכה, ובחר ovules מתאימים כדי להתמקד על. 
	הערה: כי ovules נבדלים הבמה, מיקום, כיוון, ovules מתאים צריך להימצא על-ידי בדיקת קרינה פלואורסצנטית שלהם סמן.</li>
	<li>להתחיל לחיות-ההדמיה על פי היצרן &#39; s ההוראות של מערכת מיקרוסקופ. 
	הערה: פרמטרים וציוד מיקרוסקופ הן מגוונות, ובכך המשתמשים צריך לבחור את ההגדרות המתאימות מתאימים לצורך הניסוי. כדוגמה, ההגדרות המשמשות כתב יד זה מפורטים בטבלה 1-</li>
</ol> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> <tbody><tr><td>ציוד/הגדרת</td> <td>איור 3 (א) ומשלימה קטעי וידאו 1 ו- 4</td> <td> איור 3 (ב) ו- 2 הסרטונים משלימה</td> <td>משלימה 3 הסרטונים</td></tr> <tr><td>סריקה בלייזר הפוכה מיקרוסקופ (A1R MP)</td> <td>מיקרוסקופ</td> <td>ספינינג-דיסק קונאפוקלית מיקרוסקופ הפוכה (CSU-W1)</td> <td> תיבת סוג הפוכה מיקרוסקופ קונפוקלי המערכת עם תא הדגירה יציב (CV1000)</td></tr> <tr><td>לייזר</td> <td>לייזר הפמטו-שנייה Ti:sapphire</td> <td>לייזרים LD 488 ננומטר, 561-ננומטר</td> <td>לייזר LD 488 ננומטר, 561-nm</td></tr> <tr><td>O עדשה bjective</td> <td>40 X עדשה המטרה טבילה במי (נה = 1.15) טבילה בינונית</td> <td>60 X עדשה המטרה של טבילה שמן סיליקון (NA = 1.30), רכוב על כונן המוקד Piezo</td> <td>40 X עדשה המטרה (NA = 0.95)</td></tr> <tr><td>זיהוי או</td> <td>חיצוניים שאינם descanned PMT חאספ גלאי</td> <td>EMCCD מצלמה</td> <td>מצלמה EMCCD</td></tr> <tr><td>Dichroic מראה</td> <td>DM495, DM560</td> <td>DM488/561</td> <td>DM400-410/488/561</td></tr> <tr><td>מסנן</td> < td > הלהקה לעבור מסננים; 534/30 nm ו- 578/105 nm</td> <td>הלהקה לעבור מסננים; 520/35 ננומטר, 593/46 ננומטר</td> <td>הלהקה לעבור מסננים; 520/50 ננומטר, 617/73 nm</td></tr> <tr><td>פרוסה לאורך ציר z</td> <td>z-במחסן 31 עם מרווחי 1-מיקרומטר</td> <td>z-במחסן 17 עם 3-מיקרומטר אינטר vals</td> <td>z-במחסן 7 עם 5-מיקרומטר מרווחי</td></tr> <tr><td>מרווח הזמן</td> <td>20 דקות</td> <td>5 דקות</td> <td>10 דקות</td></tr></tbody></table> טבלה 1: מיקרוסקופים ומערכות ההגדרות המשמשות בכתב היד. 
מיקרוסקופים והפרמטרים הן מגוונות, וכך כל משתמש צריך לבחור את המערכת המתאימים לניסוי.
<ol start="3"> <li>לבדוק את רצף תמונות נרכשות, ולהמיר אותו לתבנית סרט כלליות, כגון .avi או .mov למצגת. 
	הערה: אם התוכנה המיקרוסקופ לא פלט את התמונות כתבנית סרט, זה אפשרי לשמור את התמונות. tif ולאחר מכן לפתוח אותם ב- ImageJ, תוכנית קוד פתוח בהשראת התמונה NIH, כדי לשנות את סוג הקובץ. ImageJ הינה מסופקת במלון: https://imagej.nih.gov/ij/. ImageJ יכול לשמש גם כדי להפוך Z-sטאק הסרט, כגון התחזית בעוצמה מקסימלית, כפי שמתואר ב: https://imagej.net/Z-functions.</li>
</ol>

<ol><li>Natesh, S., Rau, M. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNatesh%2C+S+%22Embryology+of+Angiosperms%22">Embryology of Angiosperms</a>. Johri, B. M. , Springer. Berlin Heidelberg. 377-443 (1984).</li>
<li>Kranz, E., Lorz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+fertilisation+of+maize+by+single+egg+and+sperm+cell+protoplast+fusion+mediated+by+high+calcium+and+high+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Zygote%22%5BJournal%5D)">In vitro fertilisation of maize by single egg and sperm cell protoplast fusion mediated by high calcium and high pH.</a> Zygote. 2 (2), 125-128 (1994).</li>
<li>Uchiumi, T., Uemura, I., Okamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+in+vitro+fertilization+system+in+rice+%28Oryza+sativa+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Establishment of an in vitro fertilization system in rice (Oryza sativa L.).</a> Planta. 226 (3), 581-589 (2007).</li>
<li>Sun, M. X., Moscatelli, A., Yang, H. Y., Cresti, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s004970000063">In vitro double fertilization in Nicotiana tabacum (L.): the role of cell volume in cell fusion.</a> Sex Plant Rep. 13 (4), 225-229 (2001).</li>
<li>Tian, H. Q., Yuan, T., Russell, S. D. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00497-004-0233-9">Relationship between double fertilization and the cell cycle in male and female gametes of tobacco.</a> Sex Plant Rep. 17 (5), 243-252 (2004).</li>
<li>Costa, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+cell-derived+peptides+regulate+early+embryo+patterning+in+flowering+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Central cell-derived peptides regulate early embryo patterning in flowering plants.</a> Science. 344 (6180), 168-172 (2014).</li>
<li>Sauer, M., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+culture+of+Arabidopsis+embryos+within+their+ovules%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">In vitro culture of Arabidopsis embryos within their ovules.</a> Plant J. 40 (5), 835-843 (2004).</li>
<li>Gooh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+and+optical+manipulation+of+Arabidopsis+early+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging and optical manipulation of Arabidopsis early embryogenesis.</a> Dev Cell. 34 (2), 242-251 (2015).</li>
<li>Park, J., Kurihara, D., Higashiyama, T., Arata, H. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925400513011015">Fabrication of microcage arrays to fix plant ovules for long-term live imaging and observation.</a> Sens Act B-Chem. 191, 178-185 (2014).</li>
<li>Kimata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeleton+dynamics+control+the+first+asymmetric+cell+division+in+Arabidopsis+zygote%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cytoskeleton dynamics control the first asymmetric cell division in Arabidopsis zygote.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (49), 14157-14162 (2016).</li>
<li>Nambo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+Synthetic+Chemistry+and+Live-Cell+Imaging+Identified+a+Rapid+Cell+Division+Inhibitor+in+Tobacco+and+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Combination of Synthetic Chemistry and Live-Cell Imaging Identified a Rapid Cell Division Inhibitor in Tobacco and Arabidopsis thaliana.</a> Plant Cell Physiol. 57 (11), 2255-2268 (2016).</li>
<li>Mizuta, Y., Kurihara, D., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+with+longer+wavelength+excitation+in+intact+Arabidopsis+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging with longer wavelength excitation in intact Arabidopsis tissues.</a> Protoplasma. 252 (5), 1231-1240 (2015).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

כתב יד זה מציג פשוט במבחנה ביצית טיפוח פרוטוקול זה יעיל לשימוש ההדמיה לחיות תאים של פיתוח מופרות עוברי.
העיצוב של המכשיר PDMS עשוי להזדקק אופטימיזציה לפי השלב העובר. המכשיר המפותח הראשון היה מערך microcage כדי להתאים את הכיוון וכדי לתקן את המיקום של ovules9ולאחר מכן התקן micropillar נבנה כדי ללכוד את ovules בצורה יעילה יותר8. יתר על כן, micropillars דק יותר, רך יותר microcage, ולכן אינם מונעים הרחבה ביצית במהלך התצפית לטווח ארוך. התקן mi...

התוכנית גוף בסיסי של אורגניזם מתפתח זיגוטה חד־תאיות. ברוב הצמחים פורחים, חטיבת zygotic מחוללת על הפסגה של התאים הבזליים, אשר לפתח לתוך לירות ואת שורש, בהתאמה1. לכן, חשוב להבין איך נוצר בגוף הצמח במהלך מופרה, אך לא היה כלי יעיל כדי לצפות ישירות את הדינמיקה של החיים מופרות, עוברי כי הם מפתחים עמוק בתוך הפרח. מספר מינים monocot, כגון תירס, אורז, שיטת הפריה במבחנה כבר הוקמה2,3. בשיטה זו, מבודד זרע ותאי ביצה הם התמזגו חשמלית או כימית, התא שנוצר יכול להתפתח צמח פורה. עם זאת, בצמחים dicot, יש אין במבחנה שיטת הדישון יכול לייצר עוברי תקין, ככל הנראה מפאת מצב בלתי-מסונכרנות מחזור התא של זכר ונקבה גמטות4,5. בנוסף, הרקמה שמסביב העובר (האנדוספרם) משחק תפקידים חשובים העובר פיתוח6.
במינים dicot מודל, לבנה א, שיטת טיפוח במבחנה פותחה על-ידי התמקדות כל ביצית, אשר מכיל העובר ואת האנדוספרם7. מערכת זו שימשה בהצלחה כדי לנתח את ההשפעות של ריאקטיבים כימיים שונים על מופרה, אבל היא לא מתאימה הדמיה בצילום מואץ כי יש לו סיכויי הישרדות נמוכה. לכן, הרומן במבחנה ביצית טיפוח מערכת פותחה על מנת להתחיל מוקדם ככל השלב זיגוטה ולייצר צמחים פורייה-יחס גבוה8. לאחר ניסויים שונים, זה היה למצוא אותה מדיום Nitsch, טרהלוז לשפר באופן משמעותי את שיעור ההישרדות של ovules8. בנוסף, כי שלייה מתרחב כפי שהוא גדל ולכן לעתים קרובות יוצא מהשדה תצפית במיקרוסקופ, מכשיר PDMS פותחה כדי לתקן את ביצית ב בינוני9. המכשיר PDMS איפשרה ההדמיה לטווח ארוך 3-4 ימים, וזה מספיק כדי לעקוב אחר ההתפתחות זיגוטה העובר בשלב הלב. באמצעות שיטה זו, הוא הופך להיות אפשר לדמיין את הדינמיקה של קיטוב זיגוטה, העובר תכנים, לא רק בתנאים רגילים, אבל גם בנוכחות מעכבי כימי או שונים רקעים מוטציה8,10 ,11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55975/55975fig1.jpg"> 
איור 1: תרשים סכמטי של הסמנים פלורסנט ספציפיים המשמשים מופרות באופן חזותי של עוברי דרך ביצית. הזיגוטה תודרנית מתפתח העובר בתוך ביצית, אשר נוצר בתוך הפרח. ב במבחנה שיטת הטיפוח הזאת, זיגוטה את ואת העובר הם נצפו דרך להפרייה, ולכן חשוב להשתמש מסוים סמנים פלורסנט אינם מבוטאים ברקמות אחרות ביצית. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55975/55975fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

<table><tbody><tr><td>תערובת מלח בסיס ניטש</td><td>Duchefa</td><td>N0223</td><td></td></tr><tr><td>טרהלוז דיהידראט</td><td>Wako Pure Chemical</td><td>206-18455</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Dojindo</td><td>345-01625</td><td></td></tr><tr><td>Gamborg' s תמיסת ויטמין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1019</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תחתית זכוכית 35 מ"מ</td><td>Matsunami Glass</td><td>D111300</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבות 35 מ"מ</td><td>Corning</td><td>430588</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning Co.</td><td>Sylgard184</td><td></td></tr><tr><td>76 & פעמים; 26 מ"מ זכוכית שקופיות</td><td>Matsunami Glass</td><td>S1225</td><td></td></tr><tr><td>18 & פעמים; 18 מ"מ זכוכית שקופית</td><td>Matsunami זכוכית</td><td>C018181</td><td></td></tr><tr><td>מחט (מד 0.40 מ"מ)</td> <td>Terumo</td><td>NN-2719S</td><td></td></tr><tr><td>טבילה בינונית Immersol W 2010</td><td>Zeiss</td><td>444969-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>A1R MP</td><td>Nikon</td><td>A1RsiMP(1080) Ti-E-TIRF</td><td></td></tr><tr><td>CSU-W1</td><td>Yokogawa Electric</td><td></td><td>זהו ציוד מותאם אישית, ולכן המספר הקטלוגי אינו זמין.</td></tr><tr><td>CV1000</td><td>יוקוגאווה חשמלי</td><td>CV1000-SP84</td><td></td></tr></tbody></table>

במבחנה ביצית טיפוח עבור live-תא הדמיה של הזיגוטה קיטוב והמתבנת העובר ב תודרנית לבנה

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

רוב הצמחים פורחים, זיגוטה את ואת העובר מוסתרים עמוק בתוך רקמת אמא, ובכך כבר זמן רב המסתורין של איך הם מפתחים באופן דינאמי; לדוגמה, איך הזיגוטה קוטביות (ניגודים) להקים את ציר הגוף, איך העובר מציין הגורלות תא שונים במהלך היווצרות האיברים. כתב יד זה מתאר במבחנה ביצית תרבות שיטה לבצע הדמיה לחיות תאים של פיתוח מופרות, העוברים של תודרנית לבנה. המדיום טיפוח ממוטבת מאפשר מופרות או עוברי מוקדם כדי לגדול לתוך צמחים פורייה. על ידי שילוב זה עם מכשיר מערך של micropillar poly(dimethylsiloxane) (PDMS), ביצית מתקיים המדיום הנוזלי באותה תנוחה. הקיבעון הזה חיוני להתבונן באותה ביצית תחת מיקרוסקופ במשך מספר ימים ממחלקת zygotic לבמה העובר מאוחר. ההדמיה לחיות תאים וכתוצאה מכך ניתן לנטר את הדינמיקה בזמן אמת של קיטוב זיגוטה, כגון העברה גרעינית ו שחלוף שלד התא, וגם לעיתוי חלוקת התא תא מפרט הגורל במהלך העובר המתבנת. יתר על כן, שיטת הטיפוח הזאת ביצית יכול להיות משולב עם טיפולים מעכב כדי לנתח את השפעת גורמים שונים על התפתחות העובר, ועם מניפולציות אופטי כמו שיבוש לייזר כדי לבחון את תפקידה של תקשורת.

באמצעות שיטת הטיפוח הזאת ביצית, שיטה זו יכולים לעקוב אחר הדינמיקה החיים של קיטוב זיגוטה, העובר המתבנת. זה הישג כי בעבר היה שום טכניקה כדי להמחיש את אופן הפעולה בזמן אמת של הזיגוטה ואת העובר, אשר מוסתרים עמוק בתוך רקמת אמא. איור 3A ו- 1 וידאו משלימה להראות microtubules (MTs) ב- הזיגוטה הצעיר לצבור כמו טבעת רוחבי ב אזור subapical10. טבעת זו MT נשמר בזמן הזיגוטה מאריך לכיוון הפסגה. לאחר השלמת זיגוטה התארכות והעברה גרעיני ...

כתב יד זה מתאר במבחנה ביצית טיפוח שיטה המאפשרת הדמיה לחיות תאים של תודרנית מופרות, העוברים. בשיטה זו הוא מנוצל כדי להמחיש את הדינמיקה תאיים במהלך זיגוטה קיטוב מפרט הגורל תא בפיתוח עוברי.

במבחנה ביצית טיפוח עבור Live-תא הדמיה של הזיגוטה קיטוב והמתבנת העובר ב תודרנית לבנה

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לאפשר דימוי של תאים חיים של זיגוטים ועוברים של Arabidopsis לצורך ויזואליזציה של הדינמיקה של האמ בריוגנזה שלהם. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום התפתחות הצמחים בנוגע לאופן שבו נוצרים האסימטריה של הזיגוט והמורפולוגיה של העובר. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא היכולת לעקוב אחר הדינמיקה החיה של קיטוב הזיגוט ותבנית העובר.הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן הכנת המכשיר בעל המיקרו-עמודים והלולאות קשות להסבר באמצעות טקסט בלבד. להכנת מכשיר מערך מיקרו-עמודים מ-PDMS, ראשית גזרו את המכשיר כך שיתאים לכלי זכוכית עם תחתית של 35 מילימטר, ועקרו את הצדדים העליון והתחתון של המכשיר באמצעות חשיפה לאור UV למשך 15 דקות לכל צד. לאחר שכל הצדדים עוקרו, העבירו את מכשיר ה-PDMS לכלי תרבית חדש של 35 מילימטר והוסיפו לכלי חמישה עד שבעה מיליליטר של מצע N5T טרי, עד שהמכשיר יהיה שקוע לחלוטין.לאחר מכן, הנח את הצלחת בתוך תא ואקום והפחת את הלחץ, כאשר המכשיר נשאר בוואקום עד שכל האוויר שבמכשיר הוחלף במדיום. כאשר המכשיר עבר ניקוון מאוויר, השתמש בפינצטה בעלת קצה מרובע כדי לטפח את המכשיר על נייר סופג להסרת עודפי מדיום מהדפנות ומהחלק התחתון. לאחר מכן, הנח את המכשיר על זכוכית למשקוף בגודל 76 על 26 מילימטר וכסה אותו במכסה של צלחת תרבית בקוטר 35 מילימטר כדי לשמור על לחות המכשיר.לפני תחילת הנתיחה, יש לעקר מחט בקוטר 0.40 מילימטר ופינצטה עדינה באמצעות ethanol 70%. לאחר מכן, יש לבחון את התפרחתו של הצמח כדי לאפשר בחירה של ה Тарסיליקה (siliques) המתאימות לניסוי. תרסיליקה באורך של כ-5 מילימטר מכילות זיגוטות, ואילו תרסיליקה באורך של 8 עד 10 מילימטר כוללות עוברים גלובולריים צעירים.באמצעות פינצטה, העבירו שלושה עד ארבעה תרמילים (siliques) רלוונטיים אל פיסת סרט דביק דו-צדדי על זכוכית של סלייד בגודל 76 על 26 מילימטר. לאחר מכן, העבירו את הסלייד למסגרת של מיקרוסקופ סטריאו והשתמשו במחט ובפינצטה כדי לפתוח את דפנות השחלה. העבירו את התרמילים הפתוחים אל מערך המיקרו-עמודים של התקן ה-PDMS ושחררו את הביציות אל תוך התווך.לאחר מכן, הנח זכוכית כיסוי בגודל 18 על 18 מילימטר על המכשיר כדי לדחוף את הלולאות (ovules) אל תוך המרווחים של מערך המיקרו-עמודים. כאשר הלולאות במקומן, השתמש בפינצטה או באצבעות כדי למשוך את זכוכית הכיסוי אופקית מהמכשיר לצורך הסרת עודפי מצע, והנח את המכשיר הפוך בתוך צלחת חדשה בעלת תחתית זכוכית בקוטר 35 מילימטר. השתמש בקצה של פינצטה ריבועית כדי ללחוץ קלות על המכשיר אל תחתית הצלחת, ומזוג מצע N5T טרי לתוך הצלחת עד שהמכשיר יהיה שקוע לחלוטין.לאחר מכן, אטמו את הצלחת באמצעות parafilm. לצורך הדמיית time lapse של הלוליינות, העבירו את הצלחת אל הבמה של מיקרוסקופ הפוך והשתמשו בפלואורסצנציה של הסמן כדי לבחור את הלוליינות להדמיה. כאשר אותרו הלוליינות האופטימליות, התחילו בהדמיה חיה של הדגימות בהתאם להמלצות היצרן.מערכת גידול לוליכים זו מאפשרת מעקב אחר הדינמיקה החיה של קיטוב הזיגוט ודפוסי התפתחות העובר. לדוגמה, כאן ניתן לצפות בהצטברות של מיקרוטובוליים כטבעת רוחבית, ולאחריהם בהיווצרותם ככישוף (spindle). התאים העובריים מתחלקים לאחר מכן באופן רבעוני כדי ליצור צורה גלובולרית סימטרית רדיאלית.עם זאת, טיפול בלוליות המטופלות בתרבית במעכב פולימריזציה של actin מעכב את נדידת הגרעינים הפולריים, מה שמוביל לחלוקה סימטרית יותר של הזיגוטה ומצביע על תפקיד של סיבי actin בקוטביות הזיגוטה. לאחר שליטה בטכניקה, ניתן להשלים אותה בשלוש שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע הפרעה באמצעות לייזר כדי לענות על שאלות נוספות בנוגע לתפקידה של התקשורת בין תאים בעיצובו של העובר.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להדגים ויזואלית אירועים הדוקים במהלך האמבריוגנזה.

in-vitro-ovule-cultivation-for-live-cell-imaging-zygote-polarization

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

אנו מתארים פרוטוקול באמצעות שקופיות קאמריות ותקשורת כדי לשתק פסיגי צמחים עבור הדמית confocal של האפידרמיס על פני כמה ימים של פיתוח, המתעד את בידול הפיוניות. חלבוני fluorophore מתויג-ניתן לעקוב באופן דינמי על ידי ביטוי ולוקליזציה subcellular, להגביר את ההבנה של התפקידים האפשריים שלהם במהלך חלוקת תאים והתמיינות תאים מסוג.

לטווח ארוך הדמיה, ברזולוציה גבוהה Confocal זמן פקיעה של<em&gt; טבורית ארבידופסיס</em&gt; אפידרמיס במהלך הנביטה

אנו מדווחים שיטה יעילה ופשוטה לבודד את העוברים בשלבים מוקדמים של פיתוח...

בידוד יעיל ומהיר של עוברים משלבים מוקדמים<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; זרעים

אנו מספקים כאן פרוטוקול יעיל ואמין עבור immunostaining, הקרינה הכלאה באתר, מכתים DNA ואחרי הדמיה בביציות thaliana ארבידופסיס כל הר כמותיים, ברזולוציה גבוהה. שיטה זו השתמשה בהצלחה כדי לנתח שינויי הכרומטין ואדריכלות גרעינית.

שיטה יעילה לניתוח כמותי, תא בודד של הכרומטין שינוי ואדריכלות גרעינית בהר שלם-ביציות ב<em&gt; ארבידופסיס</em

המטרה היא להמחיש שניתן להשתמש בקלות במודל הקטניות Medicago truncatula כדי לחקור את הוויסות של עובריות צמחים מוקדמות כדי להשלים את מודל ה-Arabidopsis שאינו קטניות. מורפולוגיה של תרמילים קשורה לשלבי אמבריוגנזה זיגוטית ומסופק גם פרוטוקול לאיסוף עוברים באמצעות תרבית רקמה.

פרוטוקולים לקבלת Zygotic וסומטי עוברים ללימוד תקנה של פיתוח העובר מוקדם בקטניות הדגם<em&gt; Medicago truncatula</em

פרוטוקול זה מתאר שיטת התבוננות מופרה ב תודרנית באמצעות סיווג ביצית ואחריו את הבדיקה של היווצרות תבנית העובר תחת מיקרוסקופ.

שיטת אפיון מופרה ב תודרנית

אנו מדגימים שיטה לקביעת הפריה מוצלחת או כושלת שנכשלה על בסיס מורפולוגיה גרעינית של הזרע בערידרופזיס הפריה כפולה באמצעות מיקרוסקופ אפיפייתי.

הערכה של מדינת הדישון באמצעות מורפולוגיה גרעינית של הזרע בערידופזיס הפריה כפולה

כאן, אנו מתארים שיפור של שיטת Semi-in vitro (SIV) לצפייה בהנחיית צינור אבקה וקליטה ב- Arabidopsis thaliana, אשר מגביר את הקבלה של הביציות. ניתן לשלב את שיטת SIV cum septum בעלת תפוקה גבוהה עם קווי סמן gametophyte וחיישנים ביולוגיים מקודדים גנטית כדי לפקח על התהליך הדינמי של ההפריה.

הדמיה חיה של קליטת צינור אבקה Arabidopsis והפריה כפולה בשיטת Semi-in vitro cum septum

תנועת כרומוזומים במהלך פרופאזה מיוטית היא תופעה לא מובנת היטב שהיא בסיסית להיווצרות נבגים. פרוטוקול זה מתאר שיטה לרכישה, ניתוח וכימות של תנועות צנטרומר במהלך פרופאזה מיוטית במיוציטים זכריים של Arabidopsis thaliana .

אפיון הדמיה חיה של תנועות צנטרומר במהלך פרופאזה מיוטית זכרית ב- Arabidopsis thaliana

מאמר זה מתאר מתודולוגיה in vivo ו-in vitro לאפיון אבות התיישבות תימית על ידי ניתוח הקינטיקה של הדור, הפנוטיפ והמספרים של צאצאי תאי ה-T שלהם.

אפיון של הרתי יישוב אבות בעובר העכבר באמצעות<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; מבחני

הדמיית ההתנהגות הדינמית של אברונים ומבנים תת-תאיים אחרים in vivo יכולה לשפוך אור על תפקודם במצבים פיזיולוגיים ומחלות. כאן, אנו מציגים שיטות לתיוג גנטי של שני אברונים, צנטרוזומים ומיטוכונדריה, והדמיית הדינמיקה שלהם בעוברי דג זברה חיים באמצעות מיקרוסקופיה רחבת שדה וקונפוקלית.

הדמית מבני subcellular בעובר דג הזברה החייה

למדו שיטת טיפוח ביציות במבחנה לדימוי תאים חיים של זיגוטות ועוברים ב-Arabidopsis. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר דינמיקת הקיטוב והתבנית בעוברים ומספקת כלי עוצמתי לחקר תהליכי ההתפתחות הצמחית.

במבחנה ביצית טיפוח עבור Live-תא הדמיה של הזיגוטה קיטוב והמתבנת העובר ב תודרנית לבנה

גלה סרטונים נוספים