Microtissues תלת-ממד עבור טיפול בזריקות רגנרטיבית ותפוקה גבוהה והתרופות הקרנה
October 4th, 2017
פרוטוקול זה מתאר את הזיוף של microcryogels אלסטית macroporous תלת-ממד על-ידי שילוב מיקרו-מלאכותית עם טכנולוגיית cryogelation. בעת טעינת עם תאים, נוצרים 3D microtissues, אשר יכול להיות מוזרק בקלות בתוך vivo כדי להקל על הטיפול משובי או לצרפן מערכים להקרנה תפוקה גבוהה סמים ' במבחנה .
המטרה הכוללת של ייצור מיקרוקריוג'לים מקרו-נקבוביים תלת-ממדיים אלסטיים באמצעות קריוג'לציה היא להקל על טיפול רגנרטיבי בהזרקה וסינון תרופות בתפוקה גבוהה במבחנה. סרטון זה מציג את הפרוטוקולים לייצור מיקרו-רקמות תלת-ממדיות מגוונות ויישומם בטיפול רגנרטיבי ובסינון תרופות. טכניקת הטיפול הרגנרטיבי משפרת את שימור תאי הגזע, ההישרדות והתפקודים הטיפוליים לאחר הזרקה לאתר הפצע.
בדיקת סמים משופרת גם בגלל קלות השימוש והפוטנציאל לבדיקות סקר בתפוקה גבוהה. בדרך כלל, אנשים חדשים בתרבות התלת מימד נאבקים בגלל הפרוטוקולים המסובכים. טכניקה זו מפשטת את התרבות התלת-ממדית ומציעה לחוקרים שליטה רבה יותר על המיקרו-רקמות התלת-ממדיות המתקבלות.
יסייעו בהדגמת הנהלים הללו ג'ואו ליו, ליו ווי, לי יאקיאן ויו ג'י-פנג, ארבעה סטודנטים לתארים מתקדמים מהמעבדה שלנו. שטפו את שבבי מערך המיקרוסטנסיל PMMA במים נטולי יונים כדי להסיר את הפסולת שנותרה מחריטת הלייזר. לאחר מכן, יבש את שבבי מערך המיקרוסטנסיל ב-60 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, טפלו בצ'יפס המיובש במנקה פלזמה בקבוצות של ארבעה. ראשית, הפעל את משאבת הוואקום למשך שתי דקות. לאחר מכן, השתמש ב-18 וואט של הספק RF למשך שלוש דקות כדי להגביר את ההידרופיליות של השבבים.
כעת, הכינו מיליליטר אחד של תמיסת מבשר ג'לטין לכל חמישה צ'יפס. ממיסים את הג'לטין באמבט מים של 60 מעלות צלזיוס ומדגרים את התמיסה על קרח למשך חמש דקות. לאחר שהתקרר מעט אך עדיין נוזלי, ערבבו היטב את הגלוטראלדהיד בתמיסת מבשר הג'לטין לריכוז סופי של 0.3% גלוטראלדהיד.
כעת, פיפטה 200 מיקרוליטר של תמיסה מוכנה על המשטח העליון של כל שבב. מחלקים את התמיסה באופן שווה על השבבים באמצעות מוט זכוכית כפוף. לאחר מכן, העבירו מיד את שבבי המערך הטעונים בתמיסה למקפיא מינוס 20 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות להקפאה.
למחרת, יש לקרר ליופילייזר למינוס 40 מעלות צלזיוס במשך כ-30 דקות. לאחר מכן, טען את שבבי המערך, ועשה להם ליופיל במשך שעתיים בוואקום. הקרח יהיה נשגב בתנאים אלה, ואז השבבים יהיו מוכנים לשימוש.
התחל בקצירת מיקרוקריוג'לים בודדים מהשבבים. התחל בשכבת-על של שבב מערך המיקרוקריוג'ל המיוצר על גבי מערך פיני מפלט ה-PDMS המפוברק. יישר כל מיקרוקריוג'ל עם סיכת מפלט.
לאחר מכן לחץ על שבב מערך המיקרוקריוג'ל לתוך המערך כדי לעקור את המיקרוקריוג'לים מהבארות שלהם. כעת, קצרו את המיקרוקריוג'לים שנפלטו לאמבט מים, ואספו אותם בעזרת מסננת תאים. השתמש במסננת אחת כדי לאסוף את כל המיקרוקריוג'לים משבב אחד.
לאחר מכן, שטפו את המיקרוקריוג'לים עם נתרן בורוהידריד על קרח. אפשר להרוות את שאריות האלדהיד הלא מקושרות למשך כ -20 דקות. לאחר מכן, השליכו את הנתרן בורוהידריד, ושטפו את המיקרוקריוג'לים בחמישה מיליליטר מים נטולי יונים למשך 15 דקות.
בצע בסך הכל שלוש עד חמש שטיפות מים לפני שתמשיך. לאחר הוצאת המיקרוקריוג'לים משטיפת המים האחרונה, השתמשו בפינצטה כדי להעביר אותם ממסננת התאים לצלחת פטרי בגודל 35 מילימטר. כל אוסף של מיקרוקריוג'לים מהווה אשכול אחד.
כעת, הוסיפו 50 עד 70 מיקרוליטר של מים נטולי יונים לכל אשכול של מיקרוקריוג'לים, וכסו את הצלחת. לאחר מכן, הקש בעדינות על הכלי כדי ליישר את כל המיקרוקריוג'לים המוערמים. לאחר מכן, הקפיאו את המיקרוקריוג'לים במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך ארבע עד 16 שעות.
מאוחר יותר, ליופיל אותם במשך שעתיים כמו קודם. השלב הבא הוא ליצור את המיקרו-רקמות התלת-ממדיות. ראשית, יש לעקר את המיקרוקריוג'לים.
לאחר מכן, קצרו את התאים עם טריפסין, כמתו את הצפיפות שלהם והשעו אותם מחדש בשמונה מיליון תאים למיליליטר במדיום הגידול. לאחר מכן, פיפטה 60 מיקרוליטר של תרחיף תאים על כל אשכול של מיקרוקריוג'לים. שמרו את הכלים בתא לח, ודגרו אותם בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים כדי שהתאים ייספגו בג'לים.
לאחר הדגירה מוסיפים שני מיליליטר מדיום תרבות לכל מנה, וממשיכים בתרבות, משנים את המדיום כל יומיים. בעוד יומיים ייווצרו מיקרו-רקמות תלת-ממדיות. כדי להזריק את המיקרו-רקמות התלת-ממדיות לעכבר, העבירו אותן תחילה לפיפטה של חמישה מיליליטר, ולאחר מכן העמיסו אותן למסננת תאים כדי לסנן את מדיום התרבית.
לאחר מכן, השעו מחדש את המיקרו-רקמות התלת-ממדיות בתמיסת ג'לטין של 15%. לאחר הכנת החיה להשתלה, יש להזריק תוך שרירית את המיקרו-רקמות לשלושה מיקומים של שריר הגרציליס. כל זריקה צריכה להכיל 150 מיקרוקריוג'לים ב-150 מיקרוליטר תמיסה.
השתמש במזרק של מיליליטר אחד עם מחט בגודל 23. לאחר הרכבת מערך המיקרוקריוג'ל לתרבית תאים על השבב, הנח אותם בזהירות בתא לחות שחומם מראש מבלי להרטיב אותם. לאחר מכן יש לנקוט בזהירות שלושה מיקרוליטרים של תרחיף תאים מעורבב היטב ישירות על כל באר מיקרוקריוג'ל.
אפשר לקצה הפיפטה לגעת קלות במשטח המיקרוקריוג'ל לפני הוצאת התמיסה. אין לזרוע את הבארות ההיקפיות. לאחר העמסת הבארות, הוסף 10 מיקרוליטר של מדיום סלקטיבי לכל באר, והוסף מדיום לבארות ההיקפיות כדי להאט את האידוי באמצעות מתקן נוזלים בעל 96 ערוצים.
לאחר מכן, תרבית את השבבים בתא הלחות למשך 24 שעות ליצירת מיקרו-רקמות תלת מימדיות. למחרת, באמצעות מתקן הנוזלים בעל 96 הערוצים, הוסף 10 מיקרוליטר של תרופות לכל באר בשיפוע ריכוז ארבע פעמים כדי להשלים את התוספת של כל 384 הבארות, כולל בקרות DMSO. לאחר מכן, המשיכו בתרבות למשך 24 שעות.
לאחר 24 שעות של טיפול תרופתי, הוסיפו ארבעה מיקרוליטרים של תמיסת מלאי רזזורין לכל באר, ודגרו על הצלחת למשך שעתיים, מה שמאפשר לתאים לבצע חילוף חומרים של הרזזורין. כדי לבחון את חילוף החומרים של רזזורין בתאים, השתמש בקורא צלחות. למיקרוקריוג'לים מג'לטין שנקטפו היו צורות וגדלים מוגדרים מראש.
ניתוח של SEM הראה כי המיקרוקריוג'לים הכילו מבנים מקרו-נקבוביים מחוברים זה לזה עם גדלי נקבוביות בטווח של 30 עד 80 מיקרון. יכולת ההזרקה של מיקרוקריוג'לים מג'לטין הוערכה כמותית על ידי תרבית שלהם לאחר ההזרקה. 1,000 למיליליטר הוזרקו בשישה ניוטון פחות מהכוח המקובל קלינית של 10 ניוטון.
תאי הגזע במיקרוקריוג'לים שמרו על כדאיות גבוהה ויכולת שגשוג גדולה לאחר הזרקה במשך חמישה ימי תרבית. באמצעות תאים אלה טופל באופן טיפולי מודל איסכמיה של גפיים עכבריות, ונבדק המצב הפיזיולוגי של הגפיים האיסכמיות 28 יום לאחר הניתוח. טיפול במיקרו-רקמות עם 100,000 תאי גזע שיפר את הצלת הגפיים.
רק 25% מהעכברים הראו קטיעה ספונטנית של הבוהן לאחר 28 ימים. ביישום אחר, מערך המיקרו-רקמות התלת-ממדי שימש לבדיקת תרופות בתפוקה גבוהה. תאי קרצינומה של הכבד טופלו בדוקסורוביצין, ותאי סרטן ריאה של תאים לא קטנים טופלו ב-IMMLG-8439.
בשני המקרים, העמידות לתרופות הוגברה על ידי תרבית תלת מימדית. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לייצר מיקרוקריוג'לים מיקרו-נקבוביים תלת מימדיים אלסטיים עבור תרבית תלת מימד מחוץ לשבב באמצעות טיפול רגנרטיבי להזרקה או מערכי תרבית תאים תלת מימדיים על השבב לבדיקת תרופות בתפוקה גבוהה במבחנה. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הטיפול הרגנרטיבי מבוסס התאים וסינון תרופות, לעשות שימוש בתרבית תאים תלת מימדית ובכך לקדם את שני תחומי המחקר.
אל תשכח שעבודה עם גלוטראלדהיד ונתרן בורוהידריד עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת בגדי מגן מתאימים ועבודה מתחת למכסה המנוע בעת ביצוע הליך זה.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר את ייצורם של מיקרוקריאוג'לים אלסטיים תלת-ממדיים בעלי נקבוביות גדולות באמצעות טכנולוגיית קריוג'לציה. ניתן לטעון את המיקרוקריאוג'לים הללו בתאים כדי ליצור מיקרו-רקמות תלת-ממדיות לטיפול התחדשות ובדיקת תרופות בתפוקה גבוהה.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- רפואה התחדשותית
- בדיקת תרופות
רקע
- טכניקות תרביות תלת-ממדיות הן לעיתים קרובות מורכבות ומאתגרות עבור חוקרים.
- מיקרוקריאוג'לים מספקים פלטפורמה רב-תכליתית להנדסת רקמות.
- שיפור שמירה והישרדות של תאי גזע חיוני לטיפולים התחדשותיים יעילים.
- בדיקת תרופות בתפוקה גבוהה יכולה להפיק תועלת משיטות תרביות תלת-ממדיות מפושטות.
מטרת המחקר
- להפוך את תהליך התרבות התלת-ממדית לפשוט יותר עבור חוקרים.
- לשפר את הפונקציות הטיפוליות של תאי גזע בטיפול התחדשות.
- להקל על בדיקת תרופות בתפוקה גבוהה באמצעות מיקרו-רקמות תלת-ממדיות.
שיטות ששימשו
- שילוב של מיקרו-ייצור עם טכנולוגיית קריוג'לציה.
- טעינה של תאים לתוך מיקרוקריאוג'לים תלת-ממדיים.
- הזרקת מיקרו-רקמות in vivo ליישומים התחדשותיים.
- הרכבת מיקרו-רקמות למערכים לבדיקת תרופות.
תוצאות עיקריות
- ייצור מוצלח של מיקרוקריאוג'לים אלסטיים תלת-ממדיים בעלי נקבוביות גדולות.
- שיפור שמירה והישרדות של תאי גזע לאחר הזרקה.
- קלות שימוש משופרת עבור יישומי בדיקת תרופות.
- שליטה רבה יותר על המאפיינים של מיקרו-רקמות תלת-ממדיות.
מסקנות
- הפרוטוקול שפותח מפשט את טכניקות התרבות התלת-ממדית.
- מיקרוקריאוג'לים יכולים לשפר משמעותית את תוצאות הטיפול ההתחדשות.
- שיטה זו מבטיחה לקדם בדיקת תרופות בתפוקה גבוהה.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This protocol addresses the discovery-stage challenge of translating 3D cell culture into scalable, reproducible workflows for regenerative therapy and drug screening. By enabling injectable 3D microtissues with enhanced cell survival and compatibility with standard 384-well formats, it supports predictive confidence in target validation and lead identification. The method bridges early discovery and preclinical continuity through mechanistically relevant, disease-relevant systems that reduce biological risk in portfolio advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables therapeutic hypothesis interrogation through 3D microtissues that clarify pathway functionality in regenerative contexts.
- Operational Value: Supports biological de-risking by improving stem cell retention and survival post-injection, reducing mechanistic ambiguity in target validation.
- Predictive Value: Enhances lead identification confidence via controlled 3D microtissue formation that models tissue-level responses.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by forming size- and shape-controllable 3D microtissue arrays.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through on-chip assembly in 384-multi-well format compatible with common laboratory equipment.
- Screening Readiness: Enables reliable compound evaluation by facilitating high-throughput drug screening with quantitative metabolic readouts like resazurin reduction.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Demonstrates translational continuity from discovery through preclinical validation using the mouse limb ischemia model to assess therapeutic outcomes.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports predictive de-risking by showing improved limb salvage with microtissue treatment, informing go/no-go decisions.
- Biomarker Alignment: Connects to preclinical continuity through quantifiable physiological endpoints like toe amputation rates in disease models.
Pipeline & Workflow Integration
The method positions itself within the discovery continuum from Early Discovery to Lead Identification to Preclinical work, supporting hypothesis testing, assay readiness, and quantitative analytics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling 3D microtissue formation that models complex tissue interactions.
- Screening: Describes assay readiness through reproducible 3D microtissue array formation in 384-well format for scalable compound screening.
- Analytics: Highlights quantitative outputs such as resazurin-based metabolism assays that allow teams to compare drug conditions across wells.
- Translational Research: Connects method to preclinical continuity via demonstrated therapeutic efficacy in mouse limb ischemia model, supporting biomarker-aligned advancement.
- Enterprise Reuse: frames the method as a reusable capability for both regenerative therapy and drug screening workflows across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity through 3D microtissue models.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability via cryogel-based microtissue arrays in multi-well formats.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through improved preclinical predictivity.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on enhanced stem cell survival and therapeutic outcomes.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in microfabrication, cryogelation, and 3D cell culture techniques.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including plasma cleaners, lyophilizers, cell strainers, and plate readers for resazurin assays.
- Cross-team standardization requirements for hydrogel preparation, cell seeding density, and injection protocols across biology and engineering teams.
- Adaptation considerations across model systems, including varying cell types and drug compounds as demonstrated with hepatocellular carcinoma and NSCLC cells.
- Practical limitations supported by source material: hazardous reagents (glutaraldehyde, sodium borohydride) require proper protective garments and laboratory hood use.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:18
Fabrication of 3D Microcryogels
3:11
Injectable 3D Microtissues for Treatment of Critical Limb Ischemia
7:09
Assembly of Microtissue Array Chip for High-throughput Drug Screening
9:05
Results: Microcryogels Used as a Therapeutic and for High-throughput Drug-screening
10:31
Conclusion
