הערכת זיכרון מרחבי פגיעה במודל עכבר של פגיעה מוחית טראומטית באמצעות מבוך רדיאלי מים רדיאלי
17 ביולי 2017
כאן אנו מציגים פרוטוקול לבדיקת עכבר ספציפית של קוגניציה שאינה דורשת שחייה. בדיקה זו יכולה לשמש כדי להבדיל בהצלחה מבוקרת קליפת המוח המושרה עכברים פגיעה מוחית טראומטית מ שולטת בושה.
המטרה הכוללת של פרוטוקול מבוך הליכה במים רדיאלי (Radial Water Tread Maze) זה היא לבחון זיכרון מרחבי במודל עכברי של פגיעה מוחית טראומטית, באמצעות משימה קוגניטיבית הממוקדת בעכבר ואינה דורשת שחייה. שיטה זו יכולה להיות שימושית במיוחד לבדיקת קוגניציה במודלים של עכברים, שבהם ליקויים מוטוריים ו/או חוסר מוטיבציה הופכים פרוטוקולים של בדיקות קוגניטיביות מבוססות שחייה, כגון מבוך המים של מוריס (Morris Water Maze), לבלתי מעשיים. למרות ששיטה זו עשויה לספק תובנות לגבי הבדלים קבוצתיים וקוגניציה במודל של פגיעה קורטיקלית מבוקרת (controlled cortical impact) של פגיעה מוחית טראומטית בעכברים, היא יכולה להיות שימושית גם למדידת קוגניציה במודלים של עכברים מזדקנים ועכברים טרנסגניים הידועים כבעלי ביצועים נמוכים בבדיקות מבוססות שחייה.
בכל ימי הבדיקה, בצע את שלבי ההכנה הבאים. ראשית, אפשר לעכברים להסתגל לחדר הבדיקה, כאשר הם בכלובים הביתיים שלהם, למשך 30 דקות לפחות. המזंतरק העגול כולל רמזים חזותיים לאורך הקירות הפנימיים.
תיבת המילוט הניידת ממוקמת באחד מתשעת חורי היציאה השונים. בזמן שהעכברים מסתגלים, חטאו את היציאות ואת התיבה באמצעות תרסיס אתנול 70%.
שמירה על טמפרטורת מים עקבית בין החזרות היא חשובה מאוד. לכן, מדדו במדויק והתאימו לפי הצורך. כעת, מקמו את קופסאות המילוט באחד מתשעת חורי היציאה.
השתמשו במקור חימום כדי לשמור על הקופסה חמה, רצוי באמצעות פד חימום. כמו כן, אטמו את הקופסה מפני אור. קופסת הבריחה חייבת להיות תמיד חשוכה, חמה וללא ריח משמעותי.
מקור האור עשוי לשמש גם הוא כרמז, לכן אין לשנות את מיקומו בין ניסויים. הוציאו בעדינות את עכבר הבדיקה מכלובו על ידי הזנבו, והניחו אותו במרכז המכשור. לאחר מכן, התחילו מיד למדוד את הזמן שייקח לעכבר למצוא את היציאה.
אם עכבר נכנס לחור מסתיים ואינו חוזר באופן ספונטני למבוך לאחר 20 שניות, אין להפסיק את הניסוי. במקום זאת, הכוו את העכבר חזרה למרכז המבוך באופן ידני, ואפשר לו להשלים את הניסוי. אם לאחר שלוש דקות העכבר לא יצא מהמבוך, רשום את הניסוי ככישלון ורשום את הזמן כשלוש דקות.
לאחר מכן, הובל בעדינות ביד את בעל החיים בנתיב הישר ביותר אל היציאה. ברגע שהעכבר נמצא בתיבת המילוט, אפשר לו להישאר שם למשך דקה אחת. לאחר מכן, העבר אותו בחזרה לכלוב הבית בזמן שהמבוך מאתחל.
בין ניסויים, חטאו ביסודיות את תיבת המילוט ואת פתחי היציאה בעזרת תרסיס אתנול 70% כדי למנוע מהעכבר להשתמש ברמזים קודמים מהסביבה לאיתור נתיב המילוט הנכון. ניתן לבצע זאת במהירות. כעת, חזרו על הניסוי באותו עכבר פעמיים נוספות, לסך הכל שלושה ניסויים רצופים.
כל יום בדיקה מורכב משלושה ניסיונות לכל עכבר. לא יותר ולא פחות. בנוסף לחיטוי, יש לרוקן את המבוך ולחדש את המים בין הבדיקות של עכברים שונים.
הקפידו לשמור על טמפרטורת המים בין 12 ל-14 מעלות צלזיוס. השתמשו במכלי קרח או במים חמים יותר כדי להתאים את טמפרטורת מי הברז לטווח זה. בין ימי הבדיקה, חשוב להבטיח שהרמזים הוויזואליים במבוך, ובמרחב שסביבו, יישארו עקביים.
משטר בדיקה מלא כולל חמישה ימי בדיקה רצופים המבוצעים כולם באותו אופן. היום החמישי נחשב למדד לשימור הזיכרון. בתנאי שלא בוצעו בדיקות בין היום השישי ל-11, ניתן להשתמש בבדיקה ביום ה-12 כדי למדוד זיכרון לטווח ארוך.
מבוך מים רדיאלי שימש לבדיקת ליקויים בזיכרון מרחבי התלויים בפגיעה בעכברים שקיבלו פגיעה מוחית טראומטית שחוללה באמצעות אימפקט קורטיקלי מבוקר או פגיעה דמה (sham injury). ניתוח ה-TBI מתואר בפירוט בפרוטוקול הטקסט ובמאמר של JoVE מאת Romin, Gao ו-Chen משנת 2014. בקצרה, הפגיעה חוללה באמצעות אימפקט קורטיקלי המונע על ידי סולנואיד עם קצה קמור של שלושה מילימטרים.
קבוצות הביקורת (shams) הוכנסו לניתוח אך לא הושפעו מהמכשיר. 35 ימים לאחר הניתוח, בוצע משטר הבדיקות המתואר. כל העכברים עמדו במבחן הקריטריונים לרצון להימלט מהמבוך.
לפיכך, כולם נכללו בניתוח. התוצאות מראות הבדל ברור בין העכברים עם TBI לביקורת ה-sham. זמן השיהוי עד למציאת המילוט היה ארוך משמעותית עבור העכברים הפגועים ביום הראשון של האימון, ובשני ימי מבחן הזיכרון.
לפיכך, ה-TBI המתואר השפיע על יכולת הלמידה של בעל החיים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן הביצוע הנכון של בדיקות קוגניציה באמצעות בדיקה של קוגניציה מרחבית ספציפית לעכברים. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בפחות מ-15 דקות לבעל חיים, במידה והיא מבוצעת כראוי.
בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי מיקום הרמזים הוויזואליים וטמפרטורת המים חייבים להישאר עקביים לאורך כל הניסויים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לבדיקה קוגניטיבית ספציפית לעכברים שאינה כוללת שחייה, שמטרתה להעריך זיכרון מרחבי במודלים של עכברים עם פגיעת מוח טראומטית. השיטה שימושית במיוחד להערכת קוגניציה בעכברים עם ליקויים מוטוריים או מוטיבציה נמוכה, שבהם בדיקות מסורתיות המבוססות על שחייה אינן מעשיות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- בדיקות קוגניטיביות
- חבלות במוח
רקע
- מבחנים קוגניטיביים מסורתיים דורשים לעיתים קרובות שחייה, דבר שעשוי שלא להתאים לכל דגמי העכברים.
- פרוטוקול זה מאפשר להעריך קוגניציה ללא צורך בשחייה.
- ניתן להחילוו על דגמי עכברים שונים, כולל עכברים מבוגרים ועכברים טרנסגניים.
- השיטה שואפת לספק תובנות לגבי הבדלים קוגניטיביים במודלים של פגיעות מוח טראומטית.
מטרת המחקר
- פיתוח מבחן קוגניטיבי הממוקד בעכברים ואינו דורש שחייה.
- הבחנה בין ביצועים קוגניטיביים בעכברים עם פגיעה מוחית טראומטית לבין קבוצות ביקורת (sham).
- סבסוד של הערכה קוגניטיבית במודלים של עכברים עם ליקויים מוטוריים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הסתגלות של העכברים בכלובים שלהם לפני הבדיקה.
- שימוש במבוך עגול עם רמזים חזותיים לאורך הקירות הפנימיים.
- הערכה של זיכרון מרחבי באמצעות משימה שאינה כוללת שחייה.
- השוואת ביצועים בין קבוצות שונות של עכברים.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול מבדיל בהצלחה בין היכולות הקוגניטיביות של עכברים פגועים לעכברי ביקורת.
- הוא מספק מדד מהימן לזיכרון מרחבי במודלים שונים של עכברים.
- השיטה יעילה עבור עכברים שבדרך כלל מראים ביצועים נמוכים במבחני שחייה.
- התוצאות מעידות על פוטנציאל ליישומים רחבים יותר במחקר קוגניטיבי.
מסקנות
- מבחן קוגניטיבי זה, שאינו דורש שחייה, הוא כלי בעל ערך למחקר במדעי המוח.
- הוא משפר את היכולת לחקור קוגניציה במודלים של עכברים עם פגיעה מוחית טראומטית.
- ניתן להתאים את הפרוטוקול לתנאי ניסוי שונים ולזני עכברים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג ניהולי
הערכת הזיכרון המרחבי במודלים של עכברים עם פגיעה מוחית טראומטית היא קריטית לתיקוף מטרות ולצמצום סיכונים מכניסטיים בפיתוח טיפולים נוירותרפויטיים. מבוך ה-Radial Water Tread מספק בדיקה קוגניטיבית שאינה מבוססת שחייה ומותאמת לעכברים, המאפשרת זיהוי מהימן של ליקויים קוגניטיביים שנגרמו כתוצאה מהפגיעה, ובכך תומכת בהחלטות בשלבי הגילוי המוקדמים. גישה זו משפרת את הביטחון החזוי על ידי התגברות על מגבלות של מבחנים מבוססי שחייה במודלים עם ליקויים מוטוריים או מוטיבציה נמוכה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות הקשורות למסלולי זיכרון מרחבי במודלים של TBI.
- ערך תפעולי: מספק חלופה ישימה לבדיקות המתוקפות בחולדות, ובכך מגביר את התפוקה בתהליכי גילוי המבוססים על עכברים.
- ערך ניבוי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגית על ידי זיהוי גירעונות קוגניטיביים ללא השפעה של משתנים מוטוריים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מספקת מדידות כמותיות של זמן השהייה עד למציאת המבלט (escape latency), המstandardize את הסריקה הקוגניטיבית בין קבוצות עכברים שונות.
- שחזוריות: דורשת רמזים חזותיים עקביים ובקרה של טמפרטורת המים, ובכך מבטיחה השוואות מהימנות בין קבוצות.
- מדרגיות: תקופת רכישה קצרה (4 ימים) ומשך בדיקה קצר (<15 דקות לבעל חיים) תומכות בשילוב בתוך תהליכי סריקה בעלי תוכן גבוה (high-content screening).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מבחין באופן מוצלח בין עכברים עם TBI ש प्रेरित על ידי פגיעה קורטיקלית מבוקרת (controlled cortical impact) לבין קבוצות ביקורת דמי (sham) 35 ימים לאחר הפגיעה.
- המשכיות תרגומית: מאפשר הערכה לאורכית עם בדיקת שימור זיכרון ביום 5 ובדיקת זיכרון לטווח ארוך ביום 12.
- קידום מותאם סיכונים: מזהה פנוטיפים של ליקוי קוגניטיבי המשמשים לקבלת החלטות של go/no-go בתוכניות פרה-קליניות.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline & Workflow)
מבוך ה-Radial Water Tread משתלב ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לבדיקת יעילות פרה-קלינית, ובמיוחד עבור תוכניות במדעי העצבים המכוונות לנקודות סוף קוגניטיביות ב-TBI.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות לגבי פגמים בזיכרון מרחבי התלויים בפגיעה, באמצעות למידה המבוססת על רמזים חזותיים.
- סריקה: מייצר מדידות כמותיות של משתנה תלוי (זמן השהייה עד למציאת המבלט) המאפשרות השוואות בין קבוצות ותקינה של הבדיקה.
- אנליזה: דורש ניתוח סטטיסטי של הבדלים בזמני השהייה לאורך ימי האימון וימי מבחן הזיכרון כדי לזהות השפעות קבוצתיות מובהקות.
- מחקר תרגומי: מאפשר המשכיות ממודל פגיעה חריפה להערכה קוגניטיבית ארוכת טווח, בהלימה ללוחות זמנים של תיקוף פרה-קליני.
- שימוש חוזר ארגוני: מהווה פלטפורמה קוגניטיבית הניתנת לשימוש חוזר ורלוונטית למודלים של הזדקנות, מודלים טרנסגניים ומודלים של פגיעה, שבהם בדיקות המבוססות על שחייה אינן יעילות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי בידוד ביצועי הזיכרון המרחבי ממשתפעים מוטוריים או מוטיבציוניים.
- ערך תפעולי: מבטל את הצורך בשחייה, ובכך מרחיב את הישימות למודלים עם ליקויים מוטוריים.
- ערך אסטרטגי: משפר את הביטחון בהחלטות go/no-go באמצעות אספקת נקודות קצה קוגניטיביות ניתנות לתרגום במודלים של TBI בעכברים.
- השפעה על תיק הפיתוח: מאפשר תיעדוף של תרכובות מותאם לסיכון, בהתבסס על פוטנציאל להצלה קוגניטיבית במודלים פרה-קליניים תקפים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במדעי המוח ההתנהגותיים וביצוע בדיקות קוגניטיביות.
- תלוי במכשור לבקרת טמפרטורת מים מדויקת (12–14°C) ובמיקום עקבי של רמזים חזותיים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים לחיטוי המזות ולהכנת תיבת המילוט כדי למנוע זיהום של רמזים.
- כולל שיקולי התאמה בעת תרגום פרוטוקולים בין זני עכברים שונים או קבוצות גיל שונות.
- מוגבל להערכת זיכרון מרחבי; אינו מודד תחומים קוגניטיביים אחרים כגון תפקודים ניהוליים או התנהגות רגשית.
