Name: Chondrogenic גלולה היווצרות דם טבורי הנגזרות Pluripotent תאים גזעיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: חקור שיטה ליצירת גלולות כונדרוגניות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מדם טבורי. הפרוטוקול מאפשר ייצור בקנה מידה גדולה למחקר ביולוגיית סחוס ורפואה רגנרטיבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהפרויקט למחקר ופיתוח של טכנולוגיה בקוריאה, משרד הבריאות, הרווחה והמשפחה, הרפובליקה של קוריאה (HI16C2177).

פרוטוקול זה אושר על ידי המועצה המוסדית סקירה של האוניברסיטה הקתולית של קוריאה (KC12TISI0861). CBMCs המשמשים לתכנות מחדש הושגו ישירות מהבנק הטבורי של בית החולים סנט מרי בסיאול. 1. בידול Chondrogenic מ iPSCs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדור CBMC-iPSC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור CBMC-hiPSCs באמצעות פרוטוקול המוצג בעבודה הקודמת שלנו 23 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את תאי הדם בצינור חרוטי 15 מ&quot;ל לספור אותם באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 3 x 10 5 תאים צנטריפוגה אותם 5 דקות ב 515 xg ו RT. מחק supernatant על ידי יניקה resuspend התאים 0.5 מ&quot;ל של המדיום תא דם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את התאים היטב של צלחת לא מצופה היטב 24-ולהוסיף את תערובת וירוס Sendai, בעקבות המלצות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צלחת במשך 30 דקות ב X150 1,50 ו 30 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחורהצנטריפוגה אה, דגירה התאים לילה (O / N) ב 37 מעלות צלזיוס 5% CO 2 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להעביר את התאים transduced כדי מצופה היטב מטריצה. צנטריפוגה את הצלחת ב XG 1,150 במשך 30 דקות ב 30 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה, להסיר את supernatant, להוסיף 1 מ&quot;ל של המדיום iPSC, ולשמור על התאים O / N ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על התאים המצורפים על 37 מעלות צלזיוס 5% CO 2 . שנה את המדיום מדי יום, והחלפתו במדיום iPSC טרי. הערה: המושבות יופיעו ביום 14-21 לאחר התמרה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדור EB <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על hiPSCs ב 37 ° C ו 5% CO 2 . שנה את המדיום היומי, להחליף אותו עם Essential 8 חדש (E8) בינוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 2 x 10 6 hiPSCs בצלחת vitronectin מצופה, 100 מ&quot;מ ב E8 בינוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיום E8 מהצלחת תרבות לשטוף עם מלוחים סטרילי פוספט שנאגרו (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1מ&quot;ל של 1 mM ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס 5% CO 2 עבור 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר התאים עם 3 מ&quot;ל של מדיום E8 ולהעביר אותם צינור חדש חרוטי 15 מ&quot;ל. צנטריפוגה התאים ב XG 250 בטמפרטורת החדר (RT) במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את supernatant מבלי להפריע תא גלולה resuspend התאים 5 מ&quot;ל של מדיום E8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את התאים באמצעות hemocytometer ולהכין 2 x 10 6 תאים עבור כל צלחת פטרי 100 מ&quot;מ. Resuspend התאים מוכנים בתערובת 10 מ&quot;ל של E8 ו EB בינוני (1: 1) עם 10 מיקרומטר rho- הקשורים מעכב Kinase (ROCK). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים O / N עבור צבירה ב 37 ° C ו 5% CO 2 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום המחרת, למסוק את EBS המצטבר על ידי pipetting. צנטריפוגה התאים ב 250 xg במשך 1 דקות. הסר את supernatant ו resuspend EBS ב 10 מ&quot;ל של מדיום E8 טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדל את EBS שנוצר במשך 5 ימים, ביצוע שינויים יומיים עם fresשעה E8 בינוני. להבשלה נוספת, לשנות את המדיום תרבות בינוני E7. שמור על EBS ב 37 ° C ו 5% CO 2 במשך 5 ימים נוספים, ביצוע שינויים בינוניים מדי יום עם בינוני E7 טרי. הערה: המדיום E7 הוא בינוני E8 ללא FGF2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אינדוקציה תא תא מתוך EBS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 6 מ&quot;ל של ג&#39;לטין 1% למאכל 100 מ&quot;מ ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס 5% CO 2 למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים את הג&#39;לטין ומייבשים את התבשיל לחלוטין למשך 2-3 שעות לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את EBS לצינור חרוטי 50 מ&quot;ל. אפשר EBs להתיישב לתחתית של צינור חרוטי. הסר את supernatant מבלי להפריע EBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend EBS ב 10 מ&quot;ל של Dulbecco השתנה של נשר בינוני (DMEM) עם 20% בסרום שור עוברית (FBS). מעבירים את EBS לצלחת מצופה ג&#39;לטין, 100 מ&quot;מ. הוסף 10 מיקרומטר ROCK inhibitor. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ולשמור על התאים ב 37 ° C ו 5% CO 2 במשך 7 ימים. לשנות נושאDium כל יום ללא הוספת מעכב ROCK. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היווצרות chondrogenic גלולה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המדיום תרבות מהצלחת לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 1 מ&quot;ל של 1 מ&quot;מ EDTA ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס 5% CO 2 עבור 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר התאים באמצעות 5 מ&quot;ל של DMEM עם 20% FBS ולהעביר אותם צינור חדש חרוטי 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים דקות 2 ב 250 xg ו RT. מחק supernatant ו resuspend גלולה ב 10 מ&quot;ל של DMEM עם 20% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סינון להשליך את גושי התא באמצעות מסננת תא 40 מיקרומטר ומסיק את התאים בודדים. ספירת תאים בודדים באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים דקות 2 ב 250 xg ו RT. הסר את supernatant וזרע 3 x 10 5 תאים לכל גלולה בצינור חרוטי 15 מ&quot;ל עם μL 300 של המדידה בידול chondrogenic (CDM). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור היווצרות גלולה, צנטריפוגה התאים במשך 5 דקות ב680 xg ו- RT. הערה: כדורי נשמרים ב 15 צינורות חרוטי מ&quot;ל במהלך בידול של כדורי chondrogenic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים לילה ב 37 מעלות צלזיוס 5% CO 2 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה את ה- CDM כל 2-3 ימים. תוך 3 ימים, כדורי יציגו מורפולוגים שטוחים, spheroidal. לשמור על כדורי 21 ימים ב 37 ° C ו 5% CO 2 . </li></ol></li></ol> 2. אפיון Chondrogenic גלולה על ידי מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטבעה chondrogenic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הטבעה, להכין להמיס פרפין ב 58 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את כדורי 1 מ&quot;ל של paraformaldehyde 4% עבור 2 שעות ב RT בצינור 1.5 מ&quot;ל. זהירות: Paraformaldehyde הוא רעיל מאוד. הימנע ממגע עם עיניים, עור או ריריות. למזער את החשיפה ולמנוע שאיפה בעת הכנתו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים שכבה אחת של גזה על הקלטת ולהעביר את כדורי קבוע באמצעות פיפטה. לכסות את גלולה על ידי קיפול thגזה וסוגר את מכסה הקלטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייזום התייבשות ב 100 מ&quot;ל של 70% אתנול (EtOH) פעמיים, 10 דקות כל אחד. מייבשים את כדורי דרך שוטף 10 דקות שוטף 80% ו 95% EtOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את כדורי 100% EtOH למשך 10 דקות. חזור שלוש פעמים עם EtOH טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור &quot;ניקוי&quot;, להחליף את הפתרון של 100 מ&quot;ל, 1: 1 תערובת של EtOH ו קסילן, ואחריו תערובת של 1: 2 של EtOH ו קסילן במשך 10 דקות כל אחד. נקה את EtOH הנותרים על ידי דוגרים את כדורי פעמיים 100% xylene, 10 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור חדירת פרפין, דגירה של כדורי ב קסילן רציף תערובות פרפין. בצע את תהליך חדירת הפרפין כולו ב 58 ° C. לדגור את כדורי ב 100 מ&quot;ל של תערובת 2: 1 של קסילן פרפין במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את הפתרון עבור 100 מ&quot;ל של תערובת 1: 1 של קסילן פרפין ו דגירה במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את הפתרון עבור 100 מ&quot;ל של תערובת 1: 2 של קסילן פרפין ו דגירה עבור 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור חדירת הסופי, להעביר את כדורי לאמבט הראשון של פרפין 100% ו דגירה של 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את כדורי לאמבט השני של פרפין 100% ו דגירה O / N ב 58 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, בעדינות להעביר את הכדורים עובש באמצעות פינצטה. הוסף פרפין כדי עובש מן מתקן פרפין. לחזק את הפרפין במשך 30 דקות על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פורסים את הסעיפים ב 7 מיקרומטר ולהעביר את החלקים על השקופית. אפשר את השקופיות לייבוש לילה ולאחסן את השקופיות ב RT עד שהם מוכנים לשימוש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת שקופיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Deparaffinize שקופיות על ידי הזזת אותם דרך 100 מ&quot;ל של 100%, 90%, 80%, ו 70% EtOH ברצף במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקופיות בצנצנת זכוכית ולשטוף עם מי ברז במשך 5 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתמים כחולים Alcian <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה השקופיות 50 מ&quot;ל של תמיסה 1% alcian כחול במשך 30 דקות. לֹאE: כחול Alcian הוא מדולל פתרון חומצה אצטית 3%. התאם את pH ל 2.5 באמצעות חומצה אצטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקופיות בתוך צנצנת זכוכית ולשטוף עם מי ברז במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את השקופיות במים deionized (DW) ו counterstain עם פתרון גרעיני אדום מהיר במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקופיות בצנצנת זכוכית ולשטוף עם מי ברז במשך 1 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2.3.5) המשך להתייבש ולהרכיב את השקופיות בשלב 2.6. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טולואידין כתם כחול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שקופיות 50 מ&quot;ל של תמיסה כחולה toluidine במשך 4 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקופיות בצנצנת זכוכית ולשטוף עם מי ברז במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לייבש ולהעלות את השקופיות בשלב 2.6. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכתים אימונוהיסטוכימיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שקופיות 3% H 2 O 2 במשך 15 דקות עבור חסימת peroxidase אנדוגני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 200 μL של נוגדנים ראשוניים (אנטי COL1A1 ו - COL2A1) מדולל 1: 100 ב tris-bu(TBS) המכיל 1% אלבומין בסרום שור (BSA) ו 5% סרום עזים נורמלי (NGS) את השקופיות דגירה O / N ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, במקום שקופיות בצנצנת זכוכית ולשטוף אותם עם 50 מ&quot;ל של כפות המכיל 0.1% polysorbate 20 (TBST) שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 200 μL של נוגדן משני (נוגדנים נגד ארנב IgG נוגדן, מדולל 1: 200 ב TBS המכיל 1% BSA ו 5% NGS) את השקופיות דגירה ב RT במשך 40 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקופיות בצנצנת זכוכית ולשטוף אותם שלוש פעמים עם 50 מ&quot;ל, 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הגברה האות, להחיל HRP מצמידים פתרון streptavidin את השקופיות דגירה במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקופיות בצנצנת זכוכית ולשטוף אותם שלוש פעמים עם 50 מ&quot;ל, 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את תמיסת המצע DAB-peroxidase, להחיל 200 μL של פתרון לשקופית כל, דגירה במשך 1 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקופיות בצנצנת זכוכית ולשטוף עם מי ברז במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קונטרסטאיןעם hematoxylin מאייר במשך 1 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את השקופיות עם DW. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לייבש ולהעלות את השקופיות בשלב 2.6. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התייבשות הרכבה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבש את השקופיות על ידי הזזת אותם ברצף דרך 100 מ&quot;ל של 70%, 80%, 90%, ו 100% EtOH, 30 s כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים את השקופיות לתוך שני שינויים של קסילן במשך 1 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μL של פתרון הרכבה coverslips ומניחים את השקופיות על גבי. </li></ol></li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

פרוטוקול זה נוצר בהצלחה hiPSCs מ CBMCs. אנחנו תכנות מחדש CBMCs כדי hiPSCs באמצעות וקטור ויראלי Sendai המכיל גורמים Yamanaka 24 . שלושה מקרים שימשו בידול, וכל הניסויים בהצלחה נוצר chondrogenic pellets באמצעות פרוטוקול זה. מחקרים רבים דיווחו על פרוטוקולים להבחנה של hiPSCs לתוך chondrocytes 25 , 26 , 27 , 28 . עם זאת, מחקר נוסף נדרש ...

השימוש hiPSCs מייצג אסטרטגיה חדשה עבור בדיקות סמים ומחקרים מכניסטיים של מחלות שונות. מנקודת מבט משובי, hiPSCs הם גם מקור פוטנציאלי להחלפת רקמות שנפגעו בעלי יכולת ריפוי מוגבלת, כגון סחוס מפרקי 1 , 2 . התחדשות של סחוס articular יליד כבר אתגר במשך כמה עשרות שנים. סחוס המפרק הוא רקמה רכה, לבנה, המעטפת את קצה העצמות ומגינה עליהם מפני חיכוך. עם זאת, יש לו יכולת regenerative מוגבל כאשר פגום, מה שהופך תיקון עצמי כמעט בלתי אפשרי. לכן, מחקר התמקדות התחדשות הסחוס כבר מתמשך במשך כמה עשורים. בעבר, ב מבחנה חוץ גופית לתוך השושלת chondrogenic בוצעה בדרך כלל עם BMSCs או chondrocytes יליד מבודד מפרק הברך 3 . בשל TO הפוטנציאל chondrogenic שלהם, BMSCs ו chondrocytes יליד יש יתרונות רבים התומכים בשימוש שלהם chondrogenesis. עם זאת, בשל ההתפשטות המוגבלת שלהם פנוטיפ יציב, תאים אלה בפני מספר מגבלות שחזור של מומים הסחוס המפרקי. תחת תנאים תרבות חוץ גופית , תאים אלה נוטים לאבד את המאפיינים שלהם לאחר 3-4 מעברים, אשר בסופו של דבר משפיע על יכולות ההבחנה שלהם 4 . כמו כן, במקרה של chondrocytes יליד, נזק נוסף למפרק הברך הוא בלתי נמנע בעת קבלת תאים אלה. שלא כמו BMSCs או chondrocytes יליד, hiPSCs יכול להאריך ללא הגבלת במבחנה . עם התנאים תרבות נאותה, hiPSCs יש פוטנציאל גדול כמקור חלופי עבור בידול chondrogenic. עם זאת, זה מאתגר לשנות את המאפיינים המהותיים של hiPSCs 5 . יתר על כן, זה לוקח כמה מסובך במבחנה stePS לכוון את גורלם של hiPSCs לסוג תא מסוים. למרות סיבוכים אלה, השימוש hiPSCs עדיין מומלץ בשל יכולת ההתחדשות העצמית שלהם ואת יכולתם להבדיל תאים ממוקד, כולל chondrocytes 6 . בידול chondrogenic נעשה בדרך כלל עם מערכות תרבות תלת מימדי, כגון תרבות גלולה או תרבות micromass, באמצעות תאים MSC כמו. אם באמצעות hiPSCs, פרוטוקול לייצר תאים כמו MSC כמו שונה הפרוטוקולים הקיימים. כמה קבוצות להשתמש בתרבות monolayer של hiPSCs כדי להמיר ישירות את הפנוטיפ לתוך תאים כמו MSC 7 . עם זאת, רוב המחקרים משתמשים ב- EBS כדי ליצור תאי תמותה הדומים ל- MSC 8 , 9 , 10 , 11 . סוגים שונים של גורמי גדילה משמשים לגרום chondrogeNesis. בדרך כלל, BMP ו TGFβ משפחה חלבונים משמשים, לבד או בשילוב. הבידול גם הוא המושרה עם גורמים אחרים, כגון GDF5, FGF2, ו IGF1 12 , 13 , 14 , 15 . TGFβ1 הוכח לעורר chondrogenesis באופן תלוי מינון MSCs 16 . בהשוואה לאיזוטופיפ השני, TGFβ3, TGFβ1 גורם chondrogenesis על ידי הגדלת pre-cartilage תא התעבות mesenchymal מראש. TGFβ3 גורם chondrogenesis על ידי הגדלה משמעותית של התפשטות תאים mesenchymal 17 . עם זאת, TGFβ3 משמש לעתים קרובות יותר על ידי חוקרים מאשר TGFβ1 7 , 10 , 18 , 19 . BMP2 משפר את הביטוי של גנים הקשורים רכיבים chondrogenic מטריקס האדםChondrocytes מפרקי תחת בתנאים חוץ גופית 20 . BMP2 מגביר את הביטוי של גנים קריטיים להיווצרות סחוס ב- MSCs בשילוב עם חלבונים TGFβ 21 . כמו כן הוכח כי BMP2 סינרגיסטי משפר את ההשפעה של TGFβ3 דרך מסלולי Smad ו- MAPK 22 . במחקר זה, CBMC-hiPSCs היו מצטברים לתוך EBS באמצעות EB בינוני בצלחת פטרי מצורף נמוך. תאי תולדה נגרמו על ידי הצמדת ה- EBS לצלחת מצופה ג&#39;לטין. בידול chondrogenic באמצעות תאים תולדה בוצעה על ידי תרבות גלולה. טיפול עם שני BMP2 ו TGFβ3 בהצלחה מרוכז התאים המושרה תאי מטריקס תאי (ECM) הצטברות חלבון עבור היווצרות chondrogenic גלולה. מחקר זה מציע פרוטוקול בידול chondrogenic פשוטה אך יעילה באמצעות CBMC-hiPSCs.

<table><tbody><tr><td><חזק>פלסטיק</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 מ"מ צלחת</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 6 בארות</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינור קורניקל</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל צינור קורניקל</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>10 מ"ל פיפטה חד פעמית</td><td>בז</td><td>7551</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל פיפטה חד פעמית</td><td>פלקון</td><td>7543</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 12 בארות</td><td>TPP</td><td>92012</td><td></td></tr><tr><td><חזק>שם<</td><td>>חזק<חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>תיאור</חזק</td></tr><tr><td>><חזק>E8 חומרים בינוניים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12, HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330-057</td><td>E8 בינוני (500 מ"ל)</td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>Life Technologies</td><td>25080-094</td><td>E8 בינוני (Conc.: 543 &mu; גרם/מ"ל)</td></tr><tr><td>נתרן סלניט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S5261</td><td>E8 בינוני&nbsp; (קונקציונלי: 14 ננוגרם/מ"ל)</td></tr><tr><td>טרנספרין אנושי</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3705</td><td>E8 בינוני (Conc.: 10.7 &mu; גרם/מ"ל)</td></tr><tr><td>בסיסי FGF2</td><td>פפרוטק</td><td>100-18B</td><td>E8 בינוני&nbsp; (קונקציונלי: 100 ננוגרם/מ"ל)</td></tr><tr><td>טכנולוגיות חיים</td> <td>של אינסולין אנושי</td><td>12585-014</td><td>E8 בינוני (Conc.: 20 &mu; גרם/מ"ל)</td></tr> <tr><td>TGF ובטא אנושיים; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>E8 בינוני (קונקציונלי: 2 ננוגרם/מ"ל)</td></tr><tr><td>חומצה אסקורבית</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A8960</td><td>E8 בינוני&nbsp; (Conc.: 64 &mu; g/mL)</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectin</td><td>Life Technologies</td><td>A14700</td><td></td></tr><tr><td>מעכב ROCK</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>תיאור</חזק></td></tr><tr><td><חומרי בקרת איכות >חזקים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 מ"מ כיסוי זכוכית</td><td>מעולה</td><td>HSU-0111580</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldyhyde</td><td>Tech & חדשנות</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BIOSESANG</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>בקר סרום אלבומין</td><td>וקטור מעבדה</td><td>SP-5050</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-SSEA4 נוגדן</td><td>Millipore</td><td>MAB4304</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-Oct4 נוגדן</td><td>סנטה קרוז</td><td>SC9081</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-TRA-1-60 נוגדן</td><td>Millipore</td><td>MAB4360</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן Anti-Sox2</td><td>Biolegend</td><td>630801</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TRA-1-81 נוגדן</td><td>Millipore</td><td>MAB4381</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן Anti-Klf4</td><td>Abcam</td><td>ab151733</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 נוגדן עז נגד עכבר IgG (H+L) בדיקה</td><td>מולקולרית</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 נוגדן עז נגד ארנב IgG (H+L)</td><td>בדיקה מולקולרית</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>בדיקה מולקולרית</td> <td>DAPI</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>מגיב אנטי-דהייה זהב מוארך</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldyhyde</td><td>Tech & חדשנות</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>BIOSESANG</td><td>T1027</td><td></td></tr><tr><td>בקר סרום אלבומין</td><td>וקטור מעבדה</td><td>SP-5050</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן אנטי-קולגן II</td><td>abcam&nbsp;</td><td>ab34712</td><td>1:100</td></tr><tr><td>אלצ'יאן כחול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A3157-10G</td><td></td></tr><tr><td>ירוק מהיר FCF</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>F7252-25G</td><td></td></tr><tr><td>ספרנין או</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>090m0039v</td><td></td></tr><tr><td>גרעיני מהיר אדום</td><td>אמריקן מאסטרטק</td><td>STNFR100&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>קסילן</td><td>דוקסן</td><td>115&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>דוקסן</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת ההמטוקסילין של מאייר</td><td>וואקו תעשיות כימיות טהורות</td><td>LAK7534</td><td></td></tr><tr><td>DAP</td><td>VECTOR LABORATORIES</td><td>SK-4100</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית שקופיות, מצופה</td><td>Hyun Il Lab-Mate</td><td>HMA-S9914</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>366919</td><td></td></tr><tr><td>Isoprypylalcohol</td><td>Millipore</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>דוקסן</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid ערכת סינתזת cDNA גדיל ראשון</td><td>Thermo Scientfic</td><td>K1622</td><td></td></tr><tr><td>שם</td><td>חברה</td><td>מספר קטלוגי</td><td> תיאור</חזק</td></tr><tr><td>><חזק>חומרי התמיינות כונדרוגניים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11885</td><td>רכיב מדיה כונדרוגני (500 מ"ל)</td></tr><tr><td>פניצילין סטרפטומיצין</td><td>Life Technologies</td><td>P4333</td><td>רכיב מדיה כונדרוגני (Conc.: 1%)</td></tr><tr><td>חומצה אסקורבית</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A8960</td><td>רכיב מדיה כונדרוגני (Conc.: 64 &mu; גרם/מ"ל)&nbsp;</td></tr><tr><td>תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות MEM (100x)</td> <td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td>רכיב מדיה כונדרוגני (Conc.: 100 mM)</td></tr> <tr><td>rhBMP-2</td><td>R& D</td><td>355-BM-050</td><td>רכיב מדיה כונדרוגני (Conc.:100 ng/ml)</td></tr><tr><td>רקומביננטי Hman TGF-beta3</td><td>R& D</td><td>243-B3-002</td><td>רכיב מדיה כונדרוגני (Conc.:10 ng/ml)</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td>רכיב מדיה כונדרוגני (Conc.: 1%)</td></tr><tr><td>ITS+ Premix</td><td>BD</td><td>354352</td><td>רכיב מדיה כונדרוגני (Conc.: 1%)</td></tr><tr><td>דקסמתזון-מסיס במים&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2915-100MG</td><td>רכיב מדיה כונדרוגני (Conc.:10-7 M)</td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>רכיב מדיה כונדרוגני (כולל: 1%)</td></tr><tr><td>תמיסת נתרן פירובט</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8636</td><td>רכיב מדיה כונדרוגני (Conc.: 1%)</td></tr><tr><td>L-Proline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5607-25G</td><td>מדיה כונדרוגנית רכיב (40 &mu; גרם/מ"ל)</td></tr></tbody></table>

chondrogenic גלולה היווצרות דם טבורי הנגזרות pluripotent תאים גזעיים

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

לסחוס המפרקי של האדם אין יכולת לתקן את עצמו. ניוון הסחוס ולכן מטופל לא על ידי טיפולים שמרניים אלא על ידי שמרני. נכון לעכשיו, המאמצים נעשים כדי לחדש סחוס פגום עם chivrocytes לשעבר vivo מורחבת או מוח העצם נגזר תאי גזע mesenchymal (BMSCs). עם זאת, המוגבלות הכדאיות וחוסר היציבות של תאים אלה להגביל את היישום שלהם שחזור סחוס. תאי גזע pluripotent האדם המושרה (hiPSCs) קיבלו תשומת לב מדעית כחלופה חדשה ליישומים משובי. עם יכולת חידוש עצמי בלתי מוגבלת ורב-יכולות, hiPSCs הודגשו כמקור חלופי חדש לתיקון סחוס. עם זאת, השגת כמות גבוהה של כדורי chondrogenic באיכות גבוהה היא אתגר גדול היישום הקליני שלהם. במחקר זה, השתמשנו בתאי גדילה של תאי גופרית (EB). CHondrogenesis מוצלח אושרה על ידי PCR אD מכתים עם כחול alcian, כחול toluidine, ונוגדנים נגד סוגי קולגן I ו- II (COL1A1 ו COL2A1, בהתאמה). אנו מספקים שיטה מפורטת להבדיל של דם טבורי mononuclear תא נגזר iPSCs (CBMC-hiPSCs) לתוך כדורי chondrogenic.

במחקר זה, יצרנו כדורי chondrogenic מ CBMC-hiPSCs על ידי גרימת תאים outgrowth מ EBS. בידול chondrogenic היה המושרה באמצעות CBMC-hiPSCs עם pluripotency 1 אישר 11 . תוכנית פשוטה של ​​הפרוטוקול שלנו מוצג באיור 1A . לפני בידול, מושבות iPSC הורחבו ( איור 1 ב ). IPSCs המורחבת היו מורכבים כמו EBS ליזום בידול ( איור 1 ג ). EBS שנוצר צורפו מנות מ...

כאן, אנו מציעים פרוטוקול לבידול chondrogenic מ דם טבורי mononuclear תאים נגזר האדם המושרה בתאי גזע pluripotent.

Chondrogenic גלולה היווצרות דם טבורי הנגזרות Pluripotent תאים גזעיים

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להפיק פלטות (pellets) כונדרוגניות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים (iPSCs) המופקים מדם חבל טבילה. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן להפיק כמות גדולה יחסית של פלטות כונדרוגניות. הפלטות הכונדרוגניות המופקות יכולות לשמש למחקרים או למידול מחלות, לסריקת תרופות ולמחקר רפואי במטרה להעמיק את הבנתנו לגבי טבעו של הסחוס.סחוס אנושי נטרם להחלים בשנה שעברה. לפיכך, יש לטפל בניוון סחוס באמצעות טיפול שמרני. בשל יכולת התחדשות עצמית בלתי מוגבלת ומולטי-פוטנציאליות, iPSCs אנושיים הובלטו כמקור תאים חלופי חדש לתיקון סחוס.את הפרוצדורה ידגימו Eugene Nam ו-Arie Alice Ream, סטודנטים לתארים מתקדמים מהמעבדה שלי. כדי להתחיל את הפרוטוקול, אספו תאי דם לשפופרת קונית של 15 milliliter, וספרו אותם באמצעות המוציטומטר. הכינו 3 × 10⁵ תאים וסובבו אותם בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-515 ×g בטמפרטורת החדר.הסר את הנוזל העליון (supernatant) באמצעות שאיבה, והשהה מחדש את התאים ב-0.5 milliliters של מצע לתאי דם. לאחר מכן, העבר את התאים לבאר בלוחית 24 בארות לא מצופה, והוסף את תערובת נגיף ה-Sendai בהתאם להנחיות היצרן. סובב את הלוחית בצנטריפוגה למשך 30 דקות ב-1,150 ×g ובטמפרטורה של 30 °C.לאחר סבב הצנטריפוגה, הדגרימו את התאים למשך הלילה. למחרת, העבירו את תאי הנוזל המיוצאים (transude cells) לבאר מקודדת במטריצה. סובבו את הפלטה בצנטריפוגה.לאחר סנטריפוגציה, הסיר את העליון (supernatant), הוסף מיליליטר אחד של מצע iPSC ותחזק את התאים. החלף את המצע מדי יום, והחלף אותו במצע iPSC טרי. תחזק את תאי הגזע הפלוריפוטנטיים המושרים של בני אדם, או HIPSCs.החליפו את המצע מדי יום, והחליפו אותו במצע Essential Eight טרי, או מצע E8. הכינו 2×10⁶ תאי HIPSCs בתוך כלי של 100 מיליליטר המכיל vitronectin ומצע E8. לאחר מכן, הסירו את מצע ה-E8 מכלי התרבית ושטפו את התאים באמצעות Phosphate Buffered Saline סטרילי, או PBS.הוסיפו 1 mL של EDTA בריכוז 1 mM, והדגירו את הצלחת למשך שתי דקות. לאחר מכן, קצרו את התאים באמצעות 3 mL של מצע E8, והעבירו אותם לשפופרת קונית חדשה של 15 mL. סבבו את התאים בצנטריפוגה ב-250 ×g בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות.שאבו את העל-נוזל (supernatant) מבלי להפריע לשכבת התאים, והשעיקו מחדש את התאים בחמישה מיליליטר של מצע E8. לאחר ספירת התאים באמצעות המוציטומיטר (hemocytometer), הכינו 2×10⁶ תאים עבור כל צלחת פטרי בקוטר 100 מילימטר. השעיקו מחדש את התאים שהוכנו ב-10 מיליליטר של תערובת ביחס של 1:1 של מצעי E8 ו-EB, עם 10 µM ROCK inhibitor (מעכב ROCK).דגרו את התאים למשך לילה כדי לאפשר אגרגציה. למחרת, אספו את גופי העברים (EBs) המאוגרגים באמצעות פיפטור. הסירו את העלייה, והשעיקו מחדש את ה-EBs ב-10 milliliters של מצע E8 טרי.גדלו את ה-EBs שהיווצרו במשך חמישה ימים, תוך ביצוע החלפות יומיות של מצע E8 טרי. להמשך הבשלה, החליפו את מצע התרבית למצע E7. שמרו את ה-EBs בטמפרטורה של 37 degrees celsius ו-5%carbon dioxide למשך חמישה ימים נוספים, תוך ביצוע החלפות מצע יומיות עם מצע E7 טרי.הוסיפו ששה מיליליטרים של 1% gelatin לצלחי 100 מילימטר, והדגירו את הצלח למשך 30 דקות. הסירו את ה-gelatin, וייבשו את הצלח לחלוטין למשך שעתיים עד שלוש לפני השימוש. העבירו את ה-EBs לפפיה קונית של 50 מיליליטר.אפשרו לגומי ההמטובלסטים (EBs) לשקוע לתחתית הפסולה הקונית. הסירו את הנוזל העליון (supernatant) מבלי להפריע ל-EBs. לאחר מכן, השביו את ה-EBs ב-10 milliliters של מצע DMEM (שילביקו המודף) מחומם מראש, עם 20% סרום עוברי בקר (FBS).העבירו את ה-EBs לצלוחית של 100 מילימטר מצופה ג'לטין. הוסיפו 10 micromolar של מעכב rock. דגרו ושמרו את התאים למשך שבעה ימים.החליפו את המצע מדי יומיים ללא הוספת מעכב סלע. שאבו את מצע התרבית מהצלחת. הוסיפו מיד לצלחת 1 ml של 1 mM EDTA, ודגרו את התאים למשך שתי דקות.לאחר מכן, קצרו את התאים באמצעות 5 ml של DMEM עם 20% FBS, והעבירו אותם לפפח קוני חדש של 15 ml. סובבו את התאים בצנטריפוגה למשך שתי דקות ב-250 ×g, בטמפרטורת החדר. השליכו את העילוי, והשעיקו מחדש את המשקע ב-10 ml של DMEM עם 20% FBS.סננו והשליכו את גושי התאים באמצעות מסננת תאים של 40 micrometer, ואספו את התאים הבודדים. ספרו את התאים הבודדים באמצעות המוציטומטר. צנטריפוגו את התאים.הסר את הנוזל העליון (supernatant), והעבר שלוש פעמים 10⁵ תאים לכל כדורית (pellet) לשפופרת קונית של 15 מיליליטר עם 300 µL של מצע התמיינות כונדרוגנית, או CDM. להיווצרות הכדוריות, סבב את התאים בצנטריפוגה, ולאחר מכן דגור את התאים למשך לילה. בתוך שלושה ימים, הכדוריות יציגו מורפולוגיות ספרואידיות שטוחות.יש לשמור את הכדורים למשך 21 ימים. לפני ההטמעה, יש להכין ולהמיס פראפין בטמפרטורה של 58 °C. יש לקבע את הכדורים ב-1 mL של 4% paraformaldehyde למשך שעתיים בטמפרטורת החדר בתוך מבחנה של 1.5 mL.הניחו שכבה אחת של גזה על הקסטה והעבירו את הכדוריות המקובעות באמצעות פיפטה. כסו את הכדורית על ידי קיפול הגזה וסגירת מכסה הקסטה. התחילו את תהליך הדהידרציה ב-100 milliliters של 70% ethanol.בצעו דהידרציה למשקעים באמצעות שטיפות סיום רצופות באתנול 80% ו-95%. העבירו את המשקעים לאתנול 100% למשך 10 דקות. לצורך הבהרה (clearing), החליפו את התמיסה בתערובת של 100 מיליליטר של אתנול וקסילן ביחס של אחד לאחד למשך 10 דקות.בשלב הבא, החליפו את התמיסה ביחס של 1:1 בתערובת של אתנול וקסילן ביחס של 1:2 למשך 10 דקות. הסירו את האתנול שנותר על ידי דגירה של הכדוריות ב-100% xylene. לצורך חדירה של פאראפין, דגרו את הכדוריות בתערובות רצופות של קסילן ופאראפין.בצע את כל תהליך ההחדרה של הפרפין בטמפרטורה של 58 °C. הדגר את הכדורים ב-100 milliliters של תערובת ביחס של שניים לאחד של xylene ופרפין למשך 30 דקות. לאחר מכן, החלף את התמיסה ב-100 milliliters של תערובת ביחס של אחד לאחד של xylene ופרפין והדגר למשך 30 דקות.לאחר מכן, החליפו את התמיסה ב-100 milliliters של תערובת ביחס של אחת לשתיים של xylene ופראפין והדגירו למשך 30 דקות. עבור ההספיגה הסופית, העבירו את הדגימות לאמבט הראשון של 100% paraffin והדגירו את הדגימה למשך שעתיים. העבירו את הדגימות לאמבט השני של 100% paraffin והדגירו למשך לילה בטמפרטורה של 58 °C.ביום למחרת, השתמשו בפינצטה כדי להעביר בעדינות את הכדוריות לתבנית. הוסיפו פראפין לתבנית באמצעות מפזר הפראפין. המתינו להר𝐭מת הפראפין במשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 °C.בצעו חיתוך של נתחים בעובי של שבעה µm והעבירו את הנתחים למשקף. הניחו למשקפים להתייבש למשך לילה, ואחסנו אותם בטמפרטורת החדר עד למועד השימוש. לפני הדיפרנציאציה, בוצעה הרחבה של מושבות iPSC.תאי ה-iPSCs המורחבים הורכבו כ-EBs כדי להתחיל את הבידול. ה-EBs שנוצרו הוצמדו למנות ציפוי ג'לטין כדי להשרות צמיחת תאים. לאחר 21 ימי בידול, התקבלו פלטים כונדרוגניים דמויי חרוזים קטנים, ששימשו לאפיון נוסף.איכות הפלטים הכונדרוגניים הוערכה היסטולוגית ביום 21, כאשר פלטים כונדרוגניים של BMSC שימשו כביקורת חיובית. הצטברות חלבוני ECM שהופרשו על ידי הכונדרוציטים המובחנים אוששה באמצעות צביעת Alcian blue ובצביעת Toluiodine blue. פלטים כונדרוגניים שהופקו מ-CDMC HIPSCs ביטאו רמות COL2A1 גבוהות יותר מאשר פלטים שהופקו מ-CBMSC HIPCs.הביטוי של קולגן מסוג 1, סמן לסחסוח פיברוטי, היה נמוך יותר בכדוריות שנגזרו מ-CBMC HIPSC בהשוואה לביטוי של COL2A1. ביטוי הגנים של חלבונים במטריקס extracellula של סחסוח בכדוריות כונדרוגניות ביום 21 אושש באמצעות real time PCR. ביטוי aggrecan בכדוריות שנגזרו מ-CBMC HIPSC היה דומה לזה של כדוריות שנגזרו מ-BMSC.סיפקנו שיטה מפורטת לגביהם של תאי iPSCs המופקים מתאים חד-גרעיני של דם שורי לכדי פלטות כונדרוגניות. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו תוך חודשיים אם היא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי האופן שבו מייצרים פלטות כונדרוגניות מ-iPSCs.

chondrogenic-pellet-formation-from-cord-blood-derived-induced

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

לחץ מכני יכול לגרום להתמיינות כונדרוגנית של תאי גזע, ולספק גישה טיפולית פוטנציאלית לתיקון סחוס פגום. אנו מציגים פרוטוקול לגרימת התמיינות כונדרוגנית של תאי גזע שמקורם בשומן (ASCs) באמצעות כבידה צנטריפוגלית (CG). ויסות מוגבר המושרה על ידי CG של SOX9 מביא להתפתחות פנוטיפים כונדרוגניים.

Chondrogenic בידול האינדוקציה של תאי גזע שמקורם שומן על ידי הכביד צנטריפוגלי

Chondrogenesis מתאי גזע דורש כוונון עדין תנאי התרבות. כאן, אנו מציגים גישה מגנטית עבור עיבוי תאים, צעד חיוני ליזום chondrogenesis. בנוסף, אנו מראים כי התבגרות דינמית בתוך bioreactor חלה גירוי מכאני כדי המבנים הסלולר ומשפרת ייצור תאי מטריקס סחוסים.

צבירת Cell מגנטי גזע 3D והתבגרות Bioreactor להתחדשות סחוס

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנתיחה של חבל טבור האנושי (UC) ו מדגם שליה העובר לתוך חוט קרונית (CL), ג'ל וורטון (WJ), צומת חבל-שליה (CPJ), ואת השליה עוברת (FP) עבור הבידוד ואפיון של תאי סטרומה mesenchymal (MSCs) באמצעות טכניקת תרבות explant.

בידוד ואפיון של תאי סטרומה mesenchymal מן טבורי אדם העובר שליה

אנו מציגים פרוטוקול ליצירת השושלת chondrogenic מן הדם ההיקפי האנושי (PB) באמצעות תאי גזע pluripotent המושרה (iPSCs) בשיטה ללא אינטגרציה, הכוללת גבריות הגוף (EB) היווצרות, הרחבת תאים fibroblastic, אינדוקציה chondrogenic.

הבדל Chondrocytes מ היקפי דם הנגזרות האדם תאים Pluripotent Pluripotent Induced

אנו מציעים פרוטוקול זה מראה כיצד להבדיל keratinocytes נגזר תאי גזע pluripotent המושרה ו fibroblasts וליצור תא צורב של העור תלת-ממד באמצעות אלה keratinocytes ו fibroblasts. פרוטוקול זה מכיל צעד נוסף של יצירת מודל humanized עכברים. הטכניקה המובאת כאן תשפר את המחקר דרמטולוגית.

דור של תא צורב עור תלת-ממד של כבל דם-derived המושרה בתאי גזע Pluripotent

לטיפול בעצם באמצעות אוסיפיקציה אנדוכונדרלית על ידי השתלת רקמת סחוס מלאכותית המיוצרת מתאי גזע מזנכימליים יש פוטנציאל לעקוף את החסרונות של טיפולים קונבנציונליים. הידרוג'ל חומצה היאלורונית יעיל בהגדלת שתלי סחוס ממוינים באופן אחיד, כמו גם ביצירת עצם משולבת עם כלי דם בין שתלים מאוחים in vivo.

היווצרות עצם משולבת באמצעות אוסיפיקציה אנדוכונדרלית in vivo באמצעות תאי גזע מזנכימליים

פרוטוקול זה מתאר ומשווה שתי שיטות מייצגות להבחנה של hiPSCs לתאי סטרומה מזנכימליים (MSCs). השיטה החד-שכבתית מאופיינת בעלות נמוכה יותר, תפעול פשוט יותר ובידול אוסטאוגני קל יותר. שיטת הגופים העובריים (EBs) מאופיינת בצריכת זמן נמוכה יותר.

השוואה בין שתי שיטות מייצגות להתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם לתאי סטרומה מזנכימליים

פרוטוקול זה מפרט את הבידוד של כונדרוציטים, כונדרופרוגניטורים שמקורם בבדיקת הידבקות פיברונקטין (FAA-CPs), וכונדרופרוגניטורים נודדים (MCPs) מסחוס מפרקי אנושי. הוא מכסה עיכול אנזימטי, הידבקות פיברונקטין ומבחנים מבוססי נדידה לבידוד ואפיון תאים אלה.

בידוד כונדרוציטים וכונדרופרוגניטורים באמצעות הידבקות פיברונקטין ובדיקת נדידה

מחקר זה מתאר שיטה לייצור ספרואידים כונדרוציטיים על ידי צבירת תאים לספרואידים בתנאי הדבקה נמוכה באמצעות כוח הכבידה, ולאחר מכן תרבית את הספרואידים המתקבלים במיני-ביוריאקטורים.

יצירת ספרואידים מכונדרוציטים שונים בתנאי הדבקה נמוכה תחת כוח הכבידה ומיני ביוריאקטורים תוצרת בית

קוצים הדנדריטים של נוירונים פירמידה הם האתרים של רוב סינפסות המעוררות בקליפת המוח של יונקים. שיטה זו מתארת ​​ניתוח כמו 3D של מורפולוגיות עמוד השדרה בנוירונים glutamatergic הפירמידה אנושיים בקליפת המוח שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרה.

כימות תלת ממדיות של קוצים הדנדריטים מפירמידת נוירונים שמקורם בתאי גזע האנושי המושרה pluripotent

חקור שיטה ליצירת גלולות כונדרוגניות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מדם טבורי. הפרוטוקול מאפשר ייצור בקנה מידה גדולה למחקר ביולוגיית סחוס ורפואה רגנרטיבית.

Chondrogenic גלולה היווצרות דם טבורי הנגזרות Pluripotent תאים גזעיים

גלה סרטונים נוספים