מאוד מרבב, סופר ברזולוציה הדמיה של תאים T באמצעות madSTORM

המטרה הכוללת של פרוטוקול הדמיה זה היא ויזואליזציה של חלבונים מרובים בתא T מופעל, באמצעות מיקרוסקופיית לוקליזציה של מולקולה בודדת. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הפעלת תאי T, כגון התפלגות המולקולות הבודדות של TCR או רכיבי מיקרו-קלסטרים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת מיני-פלקסינג (multiplexing) רחב יותר מזה שמושג בשיטות מיקרוסקופיה קיימות המבוססות על פתרונות מונחים.

בתחילה, בצעו צימוד ישיר של נוגדנים עם צבע Alexa 647, באמצעות ערכה לסימון נוגדנים ב-Alexa 647, בהתאם לפרוטוקול הסימון המסופק על ידי היצרן. סבבו את הנוגדנים המסומנים בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-20,800 ×g. לאחר הצנטריפוגה, אספו את העלייה (supernatant) כדי להסיר נוגדנים מצומדים (aggregated). לאחר מכן, צפו תאי כיסוי מסוג A12 ב-250 µL של poly-l-lyzine בריכוז 0.1% למשך 15 דקות.

לאחר מכן, שאבו את התמיסה ללא שטיפה וייבשו את התאים בטמפרטורה של 65 degree celsius למשך 30 דקות. הכינו מהילה של ננו-יהלומים פלואורסצנטיים בגודל 100 nanometer או FNDs, ב-PBS אחד, ובחנו מהילולים שונים כדי להבטיח כי מספר מספיק של FNDs יהיה נראה בכל שדה. ערבבו את ה-FNDs המהולים באמצעות וורטקס למשך דקה אחת.

בשלב הבא, בצע סוניקציה לתוף העליון של ה-FND למשך 30 שניות בהגדרת הספק גבוה. דגרי את תוף העליון של ה-FND שעבר סוניקציה בתא של כיסוי זכוכית A12 מצופה ב-poly-l-lyzine למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפת התא חמש פעמים ב-1x PBS, הדמיין את התא המצופה ב-FND באמצעות עירור בלייזר של 647 ננומטר במיקרוסקופ turf.

השתמש בעדשה עם הגדלה של 100x המעניקה שדה ראייה של 61 על 61 מיקרון. באופן אידיאלי, ארבעה עד 10 FNDs בודדים צריכים להיות נראים בשדה הראייה, בהינתן דילול מתאים של ה-FNDs, כאשר לפחות FND אחד נמצא בכל רבע של שדה הדימוי. לאחר שהושגה הצפיפות המתאימה של FNDs, הוסף 250 microliters של נוגדן anti-CD3 לכל באר.

דגרו את התא למשך שעה אחת ב-37 degree celsius או למשך לילה ב-four degree celsius. לאחר הדגירה, הסירו את התמיסה מהבארות והוסיפו 1x PBS למשך 30 שניות. חזרו על שלב שטיפה זה חמש פעמים.

סבבו מיליליטר אחד של תאי T מסוג Jurkat במהירות של 800 ×g למשך שש דקות. רצוי שריכוז תאי ה-T מסוג Jurkat יהיה בין 0.5 למיליון תאים למיליליטר לפני הסבב. השהו שוב את התאים ב-300 µL של תמיסת 1x HBS.

בינתיים, הוסיפו 150 µL של תמיסת 1x HBS לכל באער בתא והדגירו בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 דקות. לאחר מכן, הוסיפו 50 µL של תאי T מסוג Jurkat שהושעו מחדש לכל באער והדגירו למשך שלוש דקות בטמפרטורה של 37 °C. לאחר מכן, הוסיפו 300 µL של 4% paraformaldehyde לכל באער והדגירו למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 °C.

לאחר שטיפה של שלוש פעמים עם 1x PBS, בצעו פרמיליזציה לתאים על ידי הוספת 250 microliters של תמיסת 01%Triton x למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שלושה שלבי שטיפה נוספים עם 1x PBS, הוסיפו 250 microliters של תמיסת 1%fish gelatin לכל באר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לבסוף, שטפו את התאים שלוש פעמים נוספות עם 1x PBS.

הוסף 200 µL של נוגדן מסומן בריכוז של 0.1 עד 0.5 µg/mL לתאים המקובעים למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפת התאים חמש פעמים עם 1x PBS, הוסף 1 mL של STORM buffer וכסה את התא באמצעות כיסוי זכוכית (cover slip) כדי להגביל את החשיפה. השתמש בתפסנים עלבמת המיקרוסקופ כדי להחזיק את התא עם כיסוי הזכוכית במקומו.

שלב זה הוא קריטי עבור ריבוי (multiplexing) בקנה מידה גדול, מכיוון שאותו שדה ראייה חייב להישמר לאחר מספר סבבים של שטיפה ואינקובציה. באמצעות הספק נמוך של לייזר 647 nanometer במצב turf, אתרו תא צבוע עם לפחות שלושה FNDs בשדה הראייה. הגבירו את הספק לייזר 647 nanometer ורכשו את התמונות.

ניתן למצוא פרמטרים טיפוסיים בפרוטוקול הכתוב. שטפו את התאים חמש פעמים עם 1x tris-buffered saline או 1x TBS. לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של elution buffer והדגירו בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת.

חזור על תהליך an-elution שלוש פעמים. השתמש בתנאי elution המדויקים ובמספר שטיפות elution הדרושות להסרת האות, כפי שצוין עבור כל נוגדן. לאחר מכן, שטוף את התאים שלוש פעמים עם 1x TBS והוסף מיליליטר אחד של 1x PBS.

ביצוע נכון של שלב אלוציה זה יוביל להסרה של נוגדנים שנקשרו קודם לכן ויאפשר יעילות גבוהה יותר עבור סימון נוגדנים עוקב. חשוב להשתמש ב-TBS לשטיפות כדי למזער שקיעה בין שלבי האלוציה. בצעו הבהרה פוטוכימית (Photo bleach) של התאים באמצעות לייזר 647 nanometer בהספק גבוה, יחד עם לייזר 405 nanometer בהספק של שני עד חמישה milliwatts כדי להפעיל פוטוכימית צבעי Alexa 647 שנמצאים במצב חשוך.

המתינו עד שכל האות שנותר מאנטי-גוף שלא עבר אלוציה יעבור פוטו-بلیצ'ינג (הבהרה פוטוכימית). בדרך כלל, שלב זה דורש חשיפה ללייזר למשך שתיים עד חמש שניות. רכשו תמונות של הדגימה, תוך שימוש בהגדרות ה-STORM שלאחר האילוציה והפוטו-بلیצ'ינג, כדי לאשש את הסרת האות.

בשלב הבא, הוסיפו 250 µL של 4% paraformaldehyde למשך 15 דקות. פעולה זו מונעת קשירה צולבת חוזרת (reverse cross-linking) של מולקולות מקובעות בתא. שטפו את התאים שלוש פעמים עם 1x PBS.

חזור על שלבים אלו לצורך סימון רצפי של מספר מטרות. לבסוף, בצע תיקון סחף (drift correction) ויישור של מחסניות תמונות מולטיפלקס כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסטואלי. שיטת האילוזיה הרצפית והעמידה (sequential illusion and standing method) שימשה להפקת תמונת MET STORM מולטיפלקס של מיקרו-צבירים ומבנים אחרים בתא T מסוג Jurkat שהופעל.

תמונת ה-MET STORM הסופית תוקנה עבור סחיפה ויישור, באמצעות תיקון סימני ייחוס (fiducial) ממוצע וסמני ייחוס מסוג FND. מוצגות כאן תמונות מיקרוסקופיה של לוקליזציה של מולקולה בודדת (SMLM) של FND בודד הממוקם ב-30,000 פריימים של תמונה לפני ואחרי תיקון סחיפה באמצעות תיקון סימני ייחוס ממוצע. באופן דומה, מוצגות כאן תמונות מיקרוסקופיה של לוקליזציה של מולקולה בודדת של תא T מסוג Jurkat מופעל, הצבוע בנוגדן anti-phosphorelated SLP76 ובסמני ייחוס FND, לפני ואחרי תיקון סחיפה באמצעות תיקון סימני ייחוס ממוצע.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה מעמיקה באופן ביצוע דימוי רזולוציה-על (super resolution) מרובה (multiplexed) של חלבונים בתא T מופעל, באמצעות MET STORM. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה תוך שלוש שעות עבור כל סבב רב-דימוי. בעת ביצוע פרוטוקול זה, חשוב לזכור לשמור את הדגימה באותה נקודה על במה של המיקרוסקופ.

ניתן לבצע זאת באמצעות תפסני במה. זכרו שעבודה עם תמיפת ה-STORM המותאמת שלנו עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון מסנני אוויר (respirators) ומשקפי מגן בעת ביצוע פרוצדורה זו.