Name: מאוד מרבב, סופר ברזולוציה הדמיה של תאים T באמצעות madSTORM (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: למד הדמיית חלבונים ברזולוציה על-על באמצעות מיקרוסקופיית מיקום מולקולות בודדות בתאי T מופעלים. שיטה זו מאפשרת ריבוב גבוה לחקר הפעלת תאי T ותפקידם במערכת החיסון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים Xufeng וו עבור גישה למיקרוסקופ STORM. מחקר זה נתמך על ידי תוכנית המחקר הפנימי של המרכז הלאומי לסרטן (NCI) מרכז לחקר הסרטן ואת הלב הלאומי לבריאות דם המכון (NHLBI).

זהירות: יש לעיין בכל הגיליונות הרלוונטיים של נתוני בטיחות (MSDS) לפני השימוש. כמה מן הכימיקלים המשמשים בפרוטוקול זה רעילים מסרטנים. אנא השתמש בכל נוהלי הבטיחות המתאימים בעת ביצוע הפרוטוקול, כולל שימוש בבקרת ההנדסה (מכסה המנוע, מכסה הכפפות) וציוד מגן אישי (משקפי מגן, כפפות, מעיל מעבדה, מכנסיים באורך מלא ונעליים סגורות). 1. Multiplexed הדמיה של תאים T הופעל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ישירות נוגדנים מצמידים עם Alexa-647 (A647) צבע באמצעות אלקסה 647 ערכת תיוג נוגדנים. עקוב אחר פרוטוקול תיוג המסופק על ידי היצרן. הערה: דיאליזה של תמיסת נוגדנים 1x PBS מומלץ לפני שלב זה כדי להגביר את יעילות תיוג נוגדנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין שכותרתו נוגדנים 5 דקות ב 20,800 rcf ו לאסוף supernatant כדי להסיר נוגדנים צבירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של coverslips פלואורסצנטי ננו-יהלום מצופה <ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל 8-היטב coverslip תאי (ראה מגיב / רשימת חומר) עם 250 μL 0.01% פולי-ליזין (PLL) במשך 15 דקות, לשאוב, ויבש על 65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. (לא לשטוף לפני ייבוש.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת דילול של 100 ננומטר FNDs ב 1x PBS. בדוק דילולים שונים כדי להבטיח מספיק FNDs גלויים כל שדה של נוף בשלב 1.2.7 (אנו משתמשים דילול 1: 200 של FNDs המסופק על ידי היצרן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס FNDs מדולל במשך 1 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סוניקטור fnd supernatant עבור 30 s לעבר הגדרת כוח גבוהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה supernatant FND sonicatant בתא PLL מצופה 8-well coverslip במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 5x עם 1x PBS לדמיין את החדר מצופה FND באמצעות עירור 647 ננומטר לייזר על מיקרוסקופ TIRF. באופן אידיאלי, 4-10 FNDs הפרט צריך להיות גלוי בתחום הראייה בהתחשב דילול המתאים של FNDs בשלב 1.2.2 (אנו משתמשים במטרה 100X עם 256 x 256 הגדרת פיקסל המצלמה להניב 61 x 61 מיקרומטר שדה תצוגה) עםלפחות אחד FND נוכח בכל רבע של שדה הדמיה. אם FNDs נראה מקובצים ( כלומר, FNDs עם אות גבוה משמעותית מאשר FNDs שמסביב ו פונקציה להפיץ נקודה גדול מ 200 ננומטר), צנטריפוגות FNDs ב 6,800 rcf במשך דקה 1, וחזור על הליך ציפוי באמצעות supernatant FND. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 μl של נוגדנים נוגדי CD3 (10 מיקרוגרם / מ&quot;ל) היטב כל דגירה במשך שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס, או לילה ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון ולהוסיף 1x PBS למשך 30 שניות. חזור על צעד זה לשטוף 5 פעמים (לשטוף 5x). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעלת תאי T יורקת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין 1 מ&quot;ל של תאים Jurkat T ב 800 rcf במשך 6 דקות resuspend ב 300 μl פתרון 1x HBS. תאים Jurkat T צריך אידיאלי להיות בריכוז של 0.5-1.0 x 10 6 תאים / מ&quot;ל ​​לפני ספינינג. 1x HBS פתרון מורכב HEPES חיץ מלוחים עם אלבומין 1% בסרום בסרום כפי שתואר לעיל 22 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 150 μLשל פתרון 1x HBS היטב כל דגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μL resuspended תאים Jurkat לכל טוב דגירה במשך 3 דקות על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 300 μL של Paraformaldehyde 4% היטב כל דגירה למשך 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3x עם 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Permeabilize ידי הוספת 250 μL של 0.1% Triton-X פתרון במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3x עם 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 μL 1% פתרון ג&#39;לטין דגים 1x PBS לכל טוב במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3x עם 1x PBS. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדמיה מופעלת Jurkat T תאים באמצעות madSTORM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μL של נוגדנים שכותרתו ב 0.1-0.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​לתאים קבועים במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 5x עם 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של חיץ STORM לכסות את החדר עם coverslip זכוכית להגביל את החשיפה לאוויר. המאגר STORM תוארה בעבר 10 . אנו ממליצים על MAהמלך חדש STORM חיץ עבור כל סיבוב של הדמיה ספינינג למאגר STORM ב 20,800 rcf במשך 2 דקות כדי להסיר משקעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות נמוך 647 ננומטר כוח לייזר במצב TIRF, לאתר תא מוכתם עם לפחות 3 FNDs בתחום התצוגה. כדי לסייע באיתור FNDs, עירור יחד עם 568 ננומטר לייזר ניתן להשתמש כדי להגדיל את בהירות האות FND. הערה: הביצועים של תיקון fiducial ממוצעת המתואר בסעיף 2.1 משפר עם הכללה של יותר FNDs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדל 647 ננומטר כוח לייזר לרכוש תמונות. אנחנו בדרך כלל לרכוש 10,000 מסגרות בחשיפה 200 ms, 125 mW 647 ננומטר לייזר, 100X TIRF אובייקטיבי העדשה (1.49 NA), 100X EM רווח (5 MHz ב 16 ביט, המרה המרה 1). פרטים על הגדרת ההדמיה שלנו תוארו בעבר 10 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 5x עם 1x TBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים 1 מ&quot;ל oF חיץ elution (3.5 M MgCl 2 , 20 מ&quot;מ צינורות, 0.1% Tween-20, pH 6.5) ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 1 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על elution 3 פעמים. (תנאי elution המדויק ומספר שטיפות elution הדרושים כדי להסיר את האות יש לבדוק עבור כל נוגדנים בשימוש). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3x עם 1x TBS ולהוסיף 1 מ&quot;ל של 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Photobleach באמצעות 647 ננומטר לייזר בעוצמה גבוהה (125 mW) עם לייזר 405 ננומטר ב 2-5 mW לתצלום-להפעיל צבעים A647 במצב כהה. המתן עד שכל האות הנותר של נוגדנים שאינם eluted הוא photobleached. בדרך כלל זה לוקח 2-5 של חשיפה לייזר. רכישת תמונות לדוגמה (~ 100 מסגרות) באמצעות הגדרות STORM ב 1.3.5 לאחר elution ו photobleaching מומלץ לאשר הסרת אות. אנחנו בדרך כלל להסיר 99.8% של האות באמצעות שיטה זו. אנו ממליצים לבדוק את יעילות elution של כל נוגדן לפני השימוש ב MadSTORM כפי שמוצג בעבר 10 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 Paraformaldehyde μL 4% במשך 15 דקות. זה יחסי ציבוראירועים crosslinking הפוכה של מולקולות קבועים בתא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3x עם 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.3.1-1.3.12 לתיוג רציף של מספר מטרות. איור 1 מציג תמונה מרוכבת של מולקולות מרובות בתא Jurkat T מופעלת רכשה באמצעות madSTORM. </li></ol></li></ol> 2. להיסחף תיקון ויישור של ערימות תמונה מרובות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיקון להיסחף של ערימות התמונה madstorm <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח תמונות באמצעות ImageJ. אנו ממליצים להמיר את קובצי התמונות לתבנית TIFF לפני פתיחת ImageJ. השתמש ROI מלבן כדי לבחור FND אחד. לשחק את הזמן לשגות כדי לוודא כי FND גלוי בכל מסגרת של מחסנית התמונה. השתמש בניתוח הפעלה בפלאגין ThunderSTORM כדי למקם את ה- FND. עבור שיטת תיקון fiducial ממוצעת המתוארת 2.1.5, חשוב כי FND יחיד הוא מקומי בכל מסגרת תמונה ( כלומר מספר פסגות מזוהה צריך להיות דוארQual למספר המסגרות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם FND אינו מזוהה בכל מסגרת, בחר FND אחר. אם מספר פסגות ממוקמות במסגרת אחת, להסיר את הפסגה החורגת ביותר מן הפסגות הקודמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על 2.1.2 עבור כל FND בערימת התמונות. יש לזכור כי חלק FNDs לא צריך להיכלל בתהליך תיקון סחיפה, כך שהם יכולים לשמש מד עצמאי עבור דיוק תיקון נסחף כמתואר בשלב 2.1.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור תיקון סחיפה מהיר יותר, מדויק יותר, השתמש במתאם הצלב או באלגוריתמים לתיקון fiducial הכלולים ב- ThunderSTORM כדי לתקן את תמונות FND. בדרך כלל, אנו משתמשים 100 bins, 5 הגדלה, ו 0.1 מסלול החלקה גורם עבור המתאם הצלב ו 10 מרחק מקסימלי, 0.1 דקות יחס הראות סמן, ו 0.01 מסלול החלקה גורם תיקון fiducial. המתאם הצולב תיקון fiducial תניב קובץ תיקון אשר ניתן להחיל על FNDs אחרים כדי לבדוק את תיקון תיקון נסחף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת תיקון קפדני יותר, מדויק יותר להסחף, להשתמש באלגוריתם תיקון fiducial ממוצעת (AFC) כפי שתואר לעיל 10 . תהליך זה אינו דורש אופטימיזציה של הפרמטרים והתשואות דיוק לוקליזציה גבוהה יותר מאשר חזה על ידי אלגוריתמים לוקליזציה SMLM. עם זאת, תיקון סחיפה ממוצעת דורש לפחות 4 FNDs ו עבור FNDs להיות מקומי בכל מסגרת של מחסנית התמונה. תיקון סחיפה AFC מבצעת טוב יותר עם הכללת FNDs יותר כי מספר גדול של FNDs מקומיים יפחית את האפקט המעוות של פסגה outlier במסגרת נתון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למקם את כל הפונקציות להפיץ נקודה בתוך מחסנית התמונה באמצעות ThunderSTORM כמתואר לעיל 10 . אנו משתמשים בדרך כלל בגודל פיקסל של 100 ננומטר, photelectrons לכל A / D ספירה של 4.28, רמת הבסיס A / D לספור של 100, רווח EM של 100, PSF: לוקליזציה גאוס משולב, רדיוס 5 פיקסל מתאים, שיטת הסתברות מקסימלית, 1.3 פיקסל סיגמא הראשונית.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל את גורם תיקון הסחיפה שנרכש מ FNDs ל לוקליזציות מכל ערימת התמונה כולה. ראייה לבדוק את התמונה הסופית כדי להבטיח תיקון הנסחף הנכון ( איור 2 ). גורם תיקון הסחיפה המתקבל צריך להיות נבדק באופן עצמאי על FNDs לא נכלל בהליך AFC כדי למדוד את רמת דיוק תיקון נסחף. הדיוק של FNDs העצמאיים המתוקנים, צריכים להיות קרובים לערך הדיוק / אי-הוודאות הממוצע המחושב מאלגוריתם לוקליזציה שניצלו בשלב 2.1.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2.1.1-2.1.7 עבור ערימות התמונות של MEDSTORM של נוגדנים שכותרתו ברצף. זכור, כי לוקליזציה של אותה קבוצה של FNDs בכל מחסנית תמונות של madSTORM היא קריטית עבור הליך היישור הבא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישור תמונות מדסטורם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב עמדת centroid של נסחף לתקן FNDs בכל התמונה madSTORM. כדי לעשות זאת, למצוא את הממוצע x ו y ציר פועבור כל FND מקומי, ממוצע ממוצע x ו- y עמדות של כל FNDs בכל התמונה madSTORM. אלגוריתם מפורט עבור שלב זה תוארה בעבר 10 . יישר תמונות madStorM רציף באמצעות עמדות centroid של סמנים fnucial FND. כדי לבצע את היישור, לחשב את קיזוז בין שתי תמונות madSTORM מקומי על ידי חיסור עמדת centroid של FNDs בתמונה madSTORM השני מן הראשון. לאחר מכן לחסר את סכום היסט מכל לוקליזציות בתמונה madSTORM השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו ממליצים להשתמש בתמונה הראשונה של madSTORM כתמונת עיון וחזרה על שלב היישור בין הראשון והשלישי, הראשון והרביעי, וכו &#39;. בדוק את דיוק היישור על ידי מדידת הקיזוז בין FNDs שלא נכללו בתהליך היישור. קיזוזים גדולים עשויים להצביע על קבוצות שונות של FNDs שימשו בעת חישוב עמדות centroid של תמונות madStORM רציף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם כן, צעדים 2.2.1-2.2.2 shouד לחזור באמצעות אותה קבוצה של FNDs לבצע יישור. הערה: קודים מותאמים אישית עבור שני תיקוני הסחיפה AFC ו הליכי יישור מסופקים. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys J. 91 (11), 4258-4272 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li>
<li>van de Linde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+with+standard+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes.</a> Nat Protoc. 6 (7), 991-1009 (2011).</li>
<li>Mortensen, K. I., Churchman, L. S., Spudich, J. A., Flyvbjerg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+localization+analysis+for+single-molecule+tracking+and+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized localization analysis for single-molecule tracking and super-resolution microscopy.</a> Nat Methods. 7 (5), 377-381 (2010).</li>
<li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li>
<li>Rieger, B., Stallinga, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lateral+and+axial+localization+uncertainty+in+super-resolution+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chemphyschem%22%5BJournal%5D)">The lateral and axial localization uncertainty in super-resolution light microscopy.</a> Chemphyschem. 15 (4), 664-670 (2014).</li>
<li>Pertsinidis, A., Zhang, Y., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subnanometre+single-molecule+localization%2C+registration+and+distance+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Subnanometre single-molecule localization, registration and distance measurements.</a> Nature. 466 (7306), 647-651 (2010).</li>
<li>Bates, M., Jones, S. A., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%3A+a+method+for+superresolution+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM): a method for superresolution fluorescence imaging.</a> Cold Spring Harb Protoc. (6), 498-520 (2013).</li>
<li>Yi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((madSTORM%3A+a+superresolution+technique+for+large-scale+multiplexing+at+single-molecule+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">madSTORM: a superresolution technique for large-scale multiplexing at single-molecule accuracy.</a> Mol Biol Cell. 27 (22), 3591-3600 (2016).</li>
<li>Bates, M., Huang, B., Dempsey, G. T., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+super-resolution+imaging+with+photo-switchable+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multicolor super-resolution imaging with photo-switchable fluorescent probes.</a> Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).</li>
<li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li>
<li>Erdelyi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correcting+chromatic+offset+in+multicolor+super-resolution+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Correcting chromatic offset in multicolor super-resolution localization microscopy.</a> Opt Express. 21 (9), 10978-10988 (2013).</li>
<li>Gerdes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiplexed+single-cell+analysis+of+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11982-11987 (2013).</li>
<li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+3D+cellular+super-resolution+imaging+with+DNA-PAINT+and+Exchange-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT.</a> Nat Methods. 11 (3), 313-318 (2014).</li>
<li>Nanguneri, S., Flottmann, B., Horstmann, H., Heilemann, M., Kuner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tomographic+super-resolution+fluorescence+imaging+of+serially+sectioned+thick+samples%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tomographic super-resolution fluorescence imaging of serially sectioned thick samples.</a> PLoS One. 7 (5), e38098(2012).</li>
<li>Schubert, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+proteome+topology+and+function+by+automated+multidimensional+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Analyzing proteome topology and function by automated multidimensional fluorescence microscopy.</a> Nat Biotechnol. 24 (10), 1270-1278 (2006).</li>
<li>Tam, J., Cordier, G. A., Borbely, J. S., Sandoval Alvarez, A., Lakadamyali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-talk-free+multi-color+STORM+imaging+using+a+single+fluorophore%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cross-talk-free multi-color STORM imaging using a single fluorophore.</a> PLoS One. 9 (7), e101772(2014).</li>
<li>Valley, C. C., Liu, S., Lidke, D. S., Lidke, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+superresolution+imaging+of+multiple+targets+using+a+single+fluorophore%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Sequential superresolution imaging of multiple targets using a single fluorophore.</a> PLoS One. 10 (4), e0123941(2015).</li>
<li>Hoebe, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+light-exposure+microscopy+reduces+photobleaching+and+phototoxicity+in+fluorescence+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Controlled light-exposure microscopy reduces photobleaching and phototoxicity in fluorescence live-cell imaging.</a> Nat Biotechnol. 25 (2), 249-253 (2007).</li>
<li>Kiuchi, T., Higuchi, M., Takamura, A., Maruoka, M., Watanabe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multitarget+super-resolution+microscopy+with+high-density+labeling+by+exchangeable+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Multitarget super-resolution microscopy with high-density labeling by exchangeable probes.</a> Nat Methods. 12 (8), 743-746 (2015).</li>
<li>Campi, G., Varma, R., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+and+agonist+MHC-peptide+complex-dependent+T+cell+receptor+microclusters+as+scaffolds+for+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Actin and agonist MHC-peptide complex-dependent T cell receptor microclusters as scaffolds for signaling.</a> J Exp Med. 202 (8), 1031-1036 (2005).</li>
<li>Sarkar, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wide-field+in+vivo+background+free+imaging+by+selective+magnetic+modulation+of+nanodiamond+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Wide-field in vivo background free imaging by selective magnetic modulation of nanodiamond fluorescence.</a> Biomed Opt Express. 5 (4), 1190-1202 (2014).</li>
</ol>

אין לנו מה לגלות.

ההעתקה הסידורית, תיקון הסחיפה ויישורי היישור ב- madStORM מאפשרים הדמיה מדויקת ומרובת מאוד של מבנים הטרוגניים בתאים. 10 בנוסף, MadSTORM נמנע את המגבלות של צבע רב STORM כגון סטייה כרומטית ותת-אופטימלי photoswitching / תכונות פליטה של ​​צבעי אדום לא 9 , 12 . כמו צעד elution מפחית באופן משמעותי את ההפרעה הסטרית נוגדנים קשורה ברצף, madSTORM ניתן להשתמש כדי לבצע הדמיה חוזרת של דגימות התא מעבר 6-10 סיבובים...

מגוון רחב של מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה טכניקות פותחו כדי להתגבר על גבול עקיפה של מיקרוסקופ אור (~ 200 ננומטר). בין אלה היא קטגוריה של טכניקות הנקראות מולקולה מולקולה לוקליזציה מיקרוסקופית (SMLM) הכוללת צילום לוקליזציה לוקליזציה מיקרוסקופ (PALM) ו סטוכסטי שחזור אופטי מיקרוסקופ (STORM). טכניקות SMLM לשתף את השימוש fluorophores כי ניתן לעבור בין (פלורסנט) ו כבוי (כהה / צילום), המאפשר לוקליזציה רצף של הקרינה מ מולקולות בודדות 1 , 2 , 3 . בשל תאימותו עם צבעים מסחריים זמינים מיקרוסקופים, ישיר STORM (dSTORM) הפך טכניקה SMLM שאומצה נרחב 4 . DSTORM יכול להשיג באופן קבוע ~ 10 ננומטר לוקליזציה דיוק, מוגדר אי ודאות בחישוב מרכז diffractיון מוגבל נקודת פונקציית התפשטות (PSF). עם זאת, למרות דיוק גבוהה מוערך באמצעות אלגוריתמים לוקליזציה 5 , 6 , 7 , קביעת מדויקת של המיקום בפועל של מולקולות בודדות כבר הקשו על ידי מספר נושאים. ראשית, תנועה מכנית של הבמה מיקרוסקופ במהלך רכישת התמונה מוסיף אי ודאות משמעותית דיוק לוקליזציה. כמו תמונות SMLM מתקבלים במשך אלפי מסגרות זמן לשגות, תנועות בקנה מידה ננו של הבמה מיקרוסקופ יכול לפגוע באופן משמעותי את הדיוק של התמונה ברזולוציה הסופי הסופי 8 . כדי לפצות על תנועת הבמה במהלך רכישת התמונה, סחיפה שלב הוא מוערך בדרך כלל מן ההתאמה מבוסס רגרסיה של לוקליזציה binned מן התמונה עצמה (קורלציה צולבת) או לוקליזציות רצף מ סמנים fiducial (תיקון fiducial) 1 , 9 . Howevאה, שיטות אלה דורשים אופטימיזציה של פרמטרים מרובים עבור כל מחסנית תמונה, ולא יכול להסביר את תנועות הבמה על קשקשים זמן קצר כגון רטט מכני. ננו-חלקיקי זהב וחרוזי ניאון רב-צבעוניים שימשו סמנים fiducial ב- SMLM, אך הם אינם תמונה יציבה, וכתוצאה מכך דיוק נמוך משמעותית לאחר תיקון סחיפה מאשר חנקן מרכז ניאון פלואורסצנטי נינו-יהלומים (FNDs) בשימוש In madSTORM 10 . בנוסף למגבלה עקיפה, מיקרוסקופ אור מוגבלים עוד יותר על ידי גבולות ספקטרליים. הדמיה סימולטנית של מטרות מרובות דורש בדיקות פלואורסצנטי עם שאינם חופפים פרופילים ספקטרלית, בדרך כלל הגבלת מיקרוסקופ אור מבוסס פלואורסצנטי ל 6 צבעים ו SMLM ל 2-3 צבעים 4 , 11 , 12 . יתר על כן, סטייה כרומטית לא ליניארית גורמת לאי-התאמה של תמונות רב-גוניות, wHich דורשים נהלים יישור נרחב באמצעות סמנים fiducial רב צבעוני 8 , 13 . כדי להתגבר על המגבלות הללו, מחקרים קודמים צילמו מספר מטרות באמצעות photobleaching חוזרות או מרווה כימית של fluorophores 14 ברצף , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 . בעוד שיטות אלה יכולים להתגבר על גבולות ספקטרליים של מיקרוסקופיה, הלבנת הקרינה ידוע להיות תהליך רעיל 20 , הלבנה ממושכת או מרווה עלול לגרום לתופעות לוואי לא רצויות כגון אובדן crosslinking. יתר על כן, הצטברות של בדיקות ניאון יכול להוביל חסימה סטרית של אתרי מחייב במדגם, מניעת ריבוב בקנה מידה גדול ומיקוד חזקים של epitopes. כדי למנוע הפרעות סטריליות כאלה, s האחרונותTudy מושגת ריבוב באמצעות חילופי סטוכסטיים של שברי חלבונים מתפזרים באופן חופשי 21 . בעוד שיטה זו מאפשרת תיוג צפוף של מבנים הסלולר, זה דורש הכנה ביוכימי נרחב לבודד שברים פפטיד, לא ניתן לאתר עמדות מולקולה אחת, ולא בקלות להקל על ריבוב בקנה מידה גדול באמצעות בדיקות זמינות מסחרית. אנו מציגים פרוטוקול וידאו מפורט המתאר את מחייב רציף elution של נוגדנים fluorescently עבור multiplexed, נוגדן גודל מוגבל dSTORM (מדסטורם) הדמיה, ושימוש של ננו פלורסנט יהלומים כדי להשיג תיקון סחיפה מדויקת ויישור.

<table><tbody><tr><td>תא כיסוי 8 באר</td><td>Lab-tek</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פולי-L-ליזין 0.1%</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>NV-100 ננומטר ננו-יהלום פלואורסצנטי</td><td>אדמאס</td><td>אדום FND</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-CD3&אפסילון; נוגדן</td><td>BD Biosciences</td><td>555329</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר, Fraction V</td><td>KSE Scientific</td><td>98-100P</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>10% Paraformaldehyde</td><td>EMS</td><td>15712</td><td></td></tr><tr><td>ג'לטין מסרטן מעור דגי מים מתוקים</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7041</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 647 ערכת תיוג נוגדנים</td><td>Thermo Fisher</td><td>A20186</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד הקסהידראט</td> צינורות <td>138924</td><td></td><td>סיגמא-אולדריץ'</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7154</td><td>Cysteamine</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30070</td><td></td></tr><tr><td>Cyclooctatetraene רעיל מאוד 98%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>138924</td><td>רעיל מאוד, רגיש לאוויר</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>KD רפואי</td><td>RGF-3210</td><td></td></tr><tr><td>10x TBS</td><td>KD רפואי</td><td>RGF-3385</td><td></td></tr></tbody></table>

מאוד מרבב, סופר ברזולוציה הדמיה של תאים t באמצעות madstorm

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

הדמיה מבנים הסלולר הטרוגנית באמצעות מיקרוסקופית מולקולה אחת מולקולה כבר הפריע על ידי דיוק לוקליזציה מספקת יכולת ריבוב. באמצעות נוי פלורסנט סמנים fiducial ננו, אנו מתארים את תיקון סחיפה הליכי יישור נדרש להשיג דיוק גבוהה מיקרוסקופית לוקליזציה מולקולה אחת. בנוסף, אסטרטגיה חדשה ריבוב, madSTORM, מתואר שבו מולקולות מרובות ממוקדות באותו תא באמצעות מחייב רציף elution של נוגדנים פלורסנט. MDSTORM מודגם על תא T מופעל כדי לדמיין את מיקומם של מרכיבים שונים בתוך מבנה מרובה חלבון, מרובת חלבון הנקרא מיקרו קולסטר קולטן התא. בנוסף, היישום של madSTORM ככלי כללי להדמיה של מבנים רב חלבונים נדון.

<html> שיטת elution רציף שיטת מכתים שימש לייצר את התמונה multistlexed madStorM של microclusters ומבנים אחרים בתא T מופעל Jurkat ( איור 1 , לבדוק את היישור דמות). כל תמונה pseudo בצבע מייצג סיבוב אחד של הדמיה madSTORM רכשה צעדים 1.1.1-1.3.13. כפי שתואר לעיל 10 , שדה הראייה צריך להיות פיקוח על אות שיורית של נוגדן הקודם, לא eluted כדי למנוע crosstalk בין מטרות מרובות. יתר על כן, כמו יעילות elution י...

אנו מדגימים שיטה לתמונה מולקולות מרובות בתוך מבנים ננו הטרוגניים בדייקנות מולקולה בודדת, תוך שימוש בחוזקה מחודשת ובזהירות של נוגדנים שכותרתו fluorescently.

מאוד מרבב, סופר ברזולוציה הדמיה של תאים T באמצעות madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול הדמיה זה היא ויזואליזציה של חלבונים מרובים בתא T מופעל, באמצעות מיקרוסקופיית לוקליזציה של מולקולה בודדת. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הפעלת תאי T, כגון התפלגות המולקולות הבודדות של TCR או רכיבי מיקרו-קלסטרים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת מיני-פלקסינג (multiplexing) רחב יותר מזה שמושג בשיטות מיקרוסקופיה קיימות המבוססות על פתרונות מונחים.בתחילה, בצעו צימוד ישיר של נוגדנים עם צבע Alexa 647, באמצעות ערכה לסימון נוגדנים ב-Alexa 647, בהתאם לפרוטוקול הסימון המסופק על ידי היצרן. סבבו את הנוגדנים המסומנים בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-20,800 ×g. לאחר הצנטריפוגה, אספו את העלייה (supernatant) כדי להסיר נוגדנים מצומדים (aggregated). לאחר מכן, צפו תאי כיסוי מסוג A12 ב-250 µL של poly-l-lyzine בריכוז 0.1% למשך 15 דקות.לאחר מכן, שאבו את התמיסה ללא שטיפה וייבשו את התאים בטמפרטורה של 65 degree celsius למשך 30 דקות. הכינו מהילה של ננו-יהלומים פלואורסצנטיים בגודל 100 nanometer או FNDs, ב-PBS אחד, ובחנו מהילולים שונים כדי להבטיח כי מספר מספיק של FNDs יהיה נראה בכל שדה. ערבבו את ה-FNDs המהולים באמצעות וורטקס למשך דקה אחת.בשלב הבא, בצע סוניקציה לתוף העליון של ה-FND למשך 30 שניות בהגדרת הספק גבוה. דגרי את תוף העליון של ה-FND שעבר סוניקציה בתא של כיסוי

highly-multiplexed-super-resolution-imaging-of-t-cells-using-madstorm

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

המידור של חלבונים גם בתוך קרום פלזמה או אל מקומות תאיים הוא אחד מנגנון רגולטורי כי יכול מאוד להשפיע על התוצאות איתות, ולכן, כדי להבין איתות חשוב ללמוד את התנהגות במרחב ובזמן של חלבונים המעורבים. המתואר כאן מערכת מבוססת מיקרוסקופיה TIRF ללמוד התמרה האות בתאי T, אבל הוא החלים רחב.

טכניקה מיקרוסקופית TIRF הדמיה בזמן אמת סימולטני של TCR וחלבונים הקשורים אליו לשידור אותות

אנו מתארים את ההכנה של שלוש דגימות בדיקה וכיצד הם יכולים לשמש כדי לייעל ולהעריך את הביצועים של מיקרוסקופים סערה. שימוש בדוגמאות אלה אנו מראים כיצד לרכוש נתונים גולמיים ולאחר מכן לעבד אותו לרכוש תמונות ברזולוציה סופר בתאים של כ 30-50 ברזולוציה ננומטר.

דוגמאות מבחן לייעול STORM סופר רזולוציה מיקרוסקופית

ההדמיה intravital ברזולוציה גבוהה עם ניגודיות משופרת עד 120 מיקרומטר עומק בבלוטות הלימפה של עכברים בוגרים מושגת על ידי מרחבית ויסות דפוס העירור של מיקרוסקופ שני פוטונים רב המוקדים. ב100 עומק מיקרומטר מדדנו החלטות 487 ננומטר (לרוחב) ו551 ננומטר (צירי), ובכך לעקוף את מגבלות פיזור ועקיפות.

מיקרוסקופית Intravital הפסים תאורה נפתר מאוד של מרכזי ז&#39;רמינל

כדי לחקור מהירויות זרימה וכיווניות של אקטין חוטי בסינפסה האימונולוגית של תאי T, הדמיה ברזולוציה גבוהה של תאים חיים משולבת עם פלואורסצנציה של השתקפות פנימית כוללת ומכומתת עם ספקטרוסקופיה של מתאם תמונה מרחבית-זמנית.

קליפת המוח אקטין זרימה בתאי T לכמת ידי מתאם תמונת ספקטרוסקופיה מרחב ובזמן של תאורה מיקרוסקופית נתונים מובנים

המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא לתת את התנאים ניסיוני אופטימלית של הכנת הדוגמא ייבוא תמונות ושיחזור על מנת לבצע צבע כפול 2D תמונות dSTORM של microtubules חוטים ביניים בתאים...

הדמיה חוטים ביניים Microtubules עם מיקרוסקופ 2-ממדי ישירה שחזור אופטי סטוכסטי

המטרה של פרוטוקול זה היא להראות כיצד להשתמש במיקרוסקופיה של יריעות האור כדי להמחיש באופן זמני את הדינמיקה של קולטן פני השטח בתאים חיים. כאן קולטני תא T על CD4+ תאי t הראשי מוצגים.

דמיין את הדינמיקה של משטח הפני-תא באמצעות מיקרוסקופ גיליון אור של סריג

בפרוטוקול זה מתמונות הן את המערך האימונוולוגי והן את תנועת הפרשה המקוטב הבאה לעבר הסינפולוגית החיסונית. שערי מעלה הסלולר נוצרו בין תא הסופר-אנטיגן פעמו של ראג'י (מתנהג כמו תא אנטיגן המציג) ו שיבוט ג'ורקאט (מתנהג כמו מסייע לימפוציטים T לימפופן).

הדמיה של הסינפסה החיסונית של האדם

מיקרוסקופ אופטי ברזולוציה גבוהה מבוססי שבב הוא גישה מקורית למיקרוסקופיה פלואורסצנטית ומציעה יתרונות ביעילות ובתפוקה. כאן, הפרוטוקולים להכנת השבבים וההדמיה מוצגים עבור מיקרוסקופ TIRF ומיקרוסקופ ברזולוציה סופר מבוססי-לוקליזציה.

כולל תפוקה גבוהה של השתקפות פנימית ומיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי אופטיים באמצעות שבב פוטוני

כאן, אנו מתארים אסטרטגיה פשוטה ונגישה להמחיש, לכמת, ומיפוי תאים חיסוניים ב-formalin-קבוע פרפין מוטבע רקמת הגידול סעיפים. מתודולוגיה זו משלבת הדמיה קיימת טכניקות ניתוח דיגיטלי עם המטרה של הרחבת יכולת ריבוב וניתוח רב פרמטרים של הדמיה מספר.

הדמיה, קוונפיקציה, ומיפוי של אוכלוסיות תאים החיסונית במיקרו סביבה הגידול

ניתוח תמונת ברקוד מרובה שיפר לאחרונה את אפיון המיקרו-סביבה של הגידול, ומאפשר מחקרים מקיפים של הרכב התא, המצב התפקודי והאינטראקציות בין התא לתא. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול צביעה והדמיה באמצעות ברקוד של נוגדנים מצומדים אוליגונוקלאוטידים והדמיית מחזור, המאפשרת שימוש בטכניקת ניתוח תמונה בממד גבוה.

ניתוח תמונת ברקוד מרובה פרופיל חיסוני ואפיון מיפוי מרחבי באנליזה חד-תאית של דגימות רקמת פרפין

דוח זה מתאר פרוטוקול אוטומטי לבדיקות אימונופלואורסצנטיות מרובות (mIF) על מכתים שקופיות אוטומטי. זה מדגים את יכולת השחזור הגבוהה של פרוטאומיקה מרחבית על צביעות רקמות סטנדרטיות בתפוקה גבוהה ומצלמות פלואורסצנטיות שלמות, שהיא אידיאלית עבור מבחני mIF מותאמים אישית על פני מספר רב של שקופיות רקמה במחקר תרגומי.

מבחני אימונופלואורסצנציה אוטומטיים מרובים בתפוקה גבוהה למחקר תרגומי

למד הדמיית חלבונים ברזולוציה על-על באמצעות מיקרוסקופיית מיקום מולקולות בודדות בתאי T מופעלים. שיטה זו מאפשרת ריבוב גבוה לחקר הפעלת תאי T ותפקידם במערכת החיסון.

מאוד מרבב, סופר ברזולוציה הדמיה של תאים T באמצעות madSTORM

גלה סרטונים נוספים