שינוי מסוף הגבלת שבירת ניתוח לכימות אורך הטלומרים באמצעות הכלאה ב-ג'ל

המטרה הכוללת של הליך זה היא לקבוע את אורך הטלומרים בתאים אוקריוטיים באמצעות גרסה שונה של הליך ניתוח שברי הגבלת טלומרים, המתואר על ידי הרופאים ג'רי וו.שיי, וודרינג רייט ועמיתיו. על ידי מתן נתונים על אורך הטלומרים, ההליך יכול לענות על שאלות בביולוגיה של התא, רפואה התנהגותית, אפידמיולוגיה ומחלות זיהומיות, על השפעות הגיל, מתח, טיפולים תרופתיים וזיהומים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מספקת מדידה ישירה בקילובסיסים של אורך הטלומרים הממוצע במגוון תאים.

דגימות ה-DNA הגנומיות לניתוח חולצו מהתאים באמצעות ערכת מיצוי DNA מסחרית כמתואר בפרוטוקול הטקסט. בצע את עיכול ה- DNA הגנומי בנפח סופי של 20 עד 40 מיקרוליטר. שלב את הדברים הבאים בכל צינור מיקרו-צנטריפוגה:שלושה מיקרוגרם של DNA גנומי; מאגר עיכול DNA פי 10; מיקרוליטר אחד של אנזים הגבלה Rsa1; מיקרוליטר אחד של אנזים הגבלה Hinf1; ומים סטריליים נטולי יונים עד לנפח הסופי.

צנטריפוגה בקצרה כדי להבטיח שכל הרכיבים נמצאים בתחתית הצינור. דגרו על העיכול בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, למשך 16 שעות לפחות. התחל הליך זה על ידי הכנת תמיסה של 0.6% אגרוז כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

הכן את מערכת האלקטרופורזה של הג'ל ליציקת ג'ל. חבר את שערי הקצה למגש יציקת הג'ל. לאחר שתמיסת ג'ל האגרוז התקררה ל-50 מעלות צלזיוס, שפכו אותה למגש יציקת הג'ל, הניחו חרוט לתוך הג'ל והניחו לג'ל להתקשות במשך 45 דקות ללא כיסוי בטמפרטורת החדר.

הסר את שערי הקצה ממגש היציקה, והסר את המסרק מהג'ל. מלאו את מערכת האלקטרופורזה של הג'ל, עם מאגר אלקטרופורזה לקו המילוי, והבטיחו שהג'ל שקוע לחלוטין במאגר. טען את בארות הג'ל בדגימות ה-DNA, והשאיר באר ריקה בין הדגימות.

הוסף 10 מיקרוליטר של סולם DNA לבארות בקצוות הנגדיים של הג'ל. הפעל את אלקטרופורזה הג'ל ב-150 וולט למשך 30 דקות, כדי להעביר במהירות את ה-DNA לתוך הג'ל. לאחר 30 דקות, כוונן את המתח ל 57 וולט, והפעל במשך 18 עד 24 שעות.

לאחר שהג'ל פעל במשך 18 עד 24 שעות, כבה את מקור האלקטרופורזה והסר את מגש יציקת הג'ל עם הג'ל ממאגר האלקטרופורזיס. פרוסת הפינה הימנית העליונה של הג'ל כדי לשמש כהתייחסות לכיוון הג'ל. חותכים פיסת נייר פילטר לגודל מעט גדול יותר מהג'ל.

מניחים את נייר הסינון על גבי הג'ל במגש יציקה, ומאפשרים לנייר לספוג את התמיסה העודפת על הג'ל. הסר בזהירות את בועות האוויר בין נייר הסינון לג'ל, בעזרת פיפט כגלגלת כדי לסחוט את הבועות החוצה דרך הצדדים. הסר את הג'ל ממגש היציקה על ידי היפוך הג'ל ונייר הסינון כך שהנייר יהיה מתחת לג'ל.

מעבירים את הג'ל עם נייר הסינון למייבש ג'ל, ומכסים את הג'ל בניילון. הסר את כל בועות האוויר בין הניילון לג'ל באמצעות פיפט כגלגלת. יבש את הג'ל בחום של 50 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.

לאחר שהג'ל התייבש, הסר את הניילון והעביר את הג'ל ונייר הסינון לכלי זכוכית המכיל 250 מיליליטר מים נטולי יונים. הסר בזהירות את נייר הסינון, ודגר את הג'ל בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. הניחו את הג'ל על גבי רשת ניילון בגודל 12 על 12 אינץ'.

מגלגלים את רשת הניילון והג'ל יחד ומוודאים שהג'ל אינו במגע עם עצמו. מניחים את הרשת והג'ל לתוך צינור הכלאה. שלב 100 מיליליטר של 5x SSC ו-12 מיקרוליטר של כתם חומצת גרעין פלואורסצנטית ירוקה, והניח בצינור ההכלאה.

דוגרים במשך 30 דקות בחום של 42 מעלות צלזיוס בתנור היברידיזציה עם סיבוב. הגן על התמיסה מפני אור. לאחר 30 דקות, הסר את רשת הניילון והג'ל מצינור ההכלאה.

מגלגלים ומניחים שטוח לכלי זכוכית המכיל 250 מיליליטר מים נטולי יונים. הסר בעדינות את רשת הניילון. דמיין את הג'ל באמצעות זרחן עם ההגדרות שצוינו.

הכן את בדיקת הטלומרים הרדיואקטיבית בהתאם לתקנות המתקן לטיפול ברדיואקטיביות. בצינור המיקרו-צנטריפוגה שלב את הדברים הבאים:שני מיקרוליטרים של בדיקת טלומר; 2.5 מיקרוליטר של מאגר תגובה של פולינוקלאוטיד קינאז פי 10; שלושה מיקרוליטרים ל-ATP המסומנים בקבוצת הגמא פוספט עם P32; ארבעה מיקרוליטרים של T4 פולינוקלאוטיד קינאז; ומים נטולי DNase, סטריליים ונטולי יונים לנפח סופי של 20 מיקרוליטר. צנטריפוגה קצרה של הצינור.

דגרו את הצינור באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. צנטריפוגה קצרה של הצינורית, ודגירה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי לעצור את התגובה. טען את תמיסת הבדיקה הרדיואקטיבית לעמודת כרומטוגרפיה מוכנה G25, וצנטריפוגה למשך שתי דקות ב-700 פעמים גרם.

שמור את המסנן, המכיל את בדיקת הטלומרים הרדיואקטיבית. מניחים את הג'ל בכלי זכוכית המכיל 250 מיליליטר תמיסת דנטורינג ודוגרים למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את תמיסת הדנטורינג והחלף ב -250 מיליליטר מים סטריליים נטולי יונים.

דגירה למשך 10 דקות על שייקר אורביטלי בטמפרטורת החדר. הסר את המים נטולי היונים. מחליפים ב -250 מיליליטר תמיסת נטרול ודוגרים למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.

מגלגלים את הג'ל לרשת ניילון, ומניחים בצינור ההכלאה. מוסיפים 20 מיליליטר מתמיסת ההכלאה, ודוגרים בתנור הכלאה בחום של 42 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות עם סיבוב. לאחר 10 דקות, הסר את תמיסת ההכלאה והחלף ב -20 מיליליטר תמיסת הכלאה טרייה.

מוסיפים את כל בדיקת הטלומרים, ודוגרים בתנור הכלאה בחום של 42 מעלות צלזיוס עם סיבוב למשך הלילה. לאחר השלמת ההכלאה עם בדיקת הטלומר, הסר את הג'ל והרשת מצינור ההכלאה, והניח בכלי זכוכית המכיל 250 מיליליטר של 2x SSC. מגלגלים ומסירים את רשת הניילון מהצלחת.

מניחים את צלחת הזכוכית על שייקר אורביטלי ומדגרים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את ה-SSC 2x, החלף ב-250 מיליליטר של 0.1x SSC, בתוספת תמיסת SDS של 0.1%, ודגר למשך 15 דקות על שייקר המסלול בטמפרטורת החדר. הסר את פתרון 0.1x SSC בתוספת 0.1% SDS.

החלף ב -250 מיליליטר של 2x SSC ודגירה למשך 15 דקות נוספות על שייקר המסלול. הסר את הג'ל מה-SSC 2x ועטוף את הג'ל בניילון. הסר את כל הבועות וכיסי האוויר בין הג'ל לניילון.

הנח את הג'ל בקלטת חשיפה עם מסך זרחן, וחשוף את מסך הזרחן לג'ל למשך הלילה. למחרת, השתמש בהדמיית זרחן כדי לצלם את מסך הזרחן החשוף. תמונות הזרחן משמשות לאחר מכן לכימות אורך הטלומרים כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

שלושה ריכוזים של DNA שבודדו מקו תאי פיברובלסטים אנושיים של עורלה אנושית ותאים חד-גרעיניים מדם היקפי אנושי נותחו לאורך הטלומרים. תמונת זרחן זו של ג'ל האגרוז המיובש המוכתם בכתם חומצת גרעין פלואורסצנטית ירוקה מראה את מיקום רצועות סולם ה-DNA בנתיבים 1 ו-8. המרחק הנמדד מהחלק העליון של הג'ל לכל תקן משקל מולקולרי מסומן על ידי חצים כחולים.

לאחר הכלאה עם בדיקה טלומרים, רצועות הטלומרים מופיעות כמריחות בכל נתיב. רשתות של 150 תיבות, חושבו עבור כל נתיב בתוספת נתיב רקע אחד. אזורי הניתוח שנבחרו עבור כל קבוצת דגימות מוצגים.

נתיבי רקע נפרדים המסומנים B נבחרו עבור כל קבוצת דגימות, כדי להבטיח שעוצמות הרקע יהיו דומות עבור כל קבוצת דגימה. חישובי אורך הטלומרים הממוצע חשפו אורך טלומרים ממוצע גבוה יותר בקו התאים האימורטליים מאשר בתאים חד-גרעיניים בדם היקפי אנושי. תוצאות אלו גם מדגימות כי כמות ה-DNA הגנומי המנותחת בכל נתיב היא קריטית להשגת אות הניתן לזיהוי לאחר הכלאה.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 12 שעות המתפרסות על פני יומיים וחצי, עם שתי דגירות לילה אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשתמש לפחות בשלושה מיקרוגרם של DNA עבור כל דגימה, ולמדוד כל דגימה בשכפול. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום ההזדקנות לחקור מנגנונים האחראים לשמירה על אורך הטלומרים במינים שונים של בעלי חיים, כולל בני אדם.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לקבוע ישירות את האורך הממוצע של הטלומרים עצמם. אל תשכח שעבודה עם רדיואקטיביות עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת מעילי מעבדה וכפפות בעת ביצוע הליך זה.